植物逆境诱导启动子mwcs120的克隆及表达特性研究
植物逆境胁迫响应的分子机制研究
植物逆境胁迫响应的分子机制研究植物生长和发育过程中常常受到各种逆境胁迫的影响，如高温、低温、干旱、盐胁迫等。
为了适应这些逆境条件，植物发展出了一系列分子机制来应对，保障其生存和繁衍。
植物逆境胁迫响应的分子机制的研究，对于揭示植物耐逆性的基础和应用具有重要的意义。
一、植物逆境胁迫响应的信号转导通路植物在感受到逆境胁迫后，通过一系列信号转导通路来传递和调控逆境信号。
其中，植物激素在逆境胁迫响应中扮演了重要角色。
例如，脱落酸（ABA）是重要的抗逆激素，能够调控植物的抗旱能力；茉莉酸（JA）和油菜素内酯（SL）参与植物的抗病和抗虫能力。
此外，某些信号分子如一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）等也参与了逆境胁迫响应的调控。
二、逆境胁迫响应相关基因的诱导表达与调控在逆境胁迫条件下，植物会激活一系列逆境胁迫响应相关基因的表达。
这些基因编码一些重要的蛋白质，如转录因子、抗氧化酶和脱水蛋白等。
转录因子作为基因调控的关键分子，能够与逆境信号通路中的激素和信号分子相互作用，调控一系列逆境响应基因的表达。
抗氧化酶如过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶等能够清除由于逆境胁迫引起的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。
脱水蛋白通过调节植物的水分平衡，增强植物的抗旱能力。
三、植物逆境胁迫响应的互作网络在植物逆境胁迫响应中，各种胁迫信号和调控蛋白之间相互作用，形成了一个复杂的调节网络。
例如，逆境胁迫信号通路中的激素和信号分子可以直接或间接调控一系列转录因子的表达，从而控制逆境响应基因的表达。
此外，一些蛋白质也可以相互作用形成复合物，参与植物抗逆境的调控。
研究逆境胁迫响应的互作网络，有助于深入理解植物逆境胁迫响应的分子机制。
四、逆境胁迫响应基因的功能鉴定与转基因改良通过对逆境胁迫响应相关基因的功能鉴定，可以进一步理解这些基因在植物逆境胁迫响应中的作用机制。
利用基因工程技术，如转基因改良，可以将逆境胁迫响应相关基因导入作物中，提高作物的抗逆性。
植物抗逆逆境中转录因子基因的克隆与功能鉴定研究
植物抗逆逆境中转录因子基因的克隆与功能鉴定研究随着全球气候变化的加剧，植物遭受各种逆境条件的压力越来越大。
为了适应这些环境压力并保证生长发育的正常进行，植物产生了一系列的适应性机制。
其中，转录因子基因在植物逆境抗性中发挥着重要的调控作用。
本文将探讨植物抗逆逆境中转录因子基因的克隆与功能鉴定研究。
一、转录因子基因的克隆转录因子基因是指编码转录因子的DNA序列。
为了克隆转录因子基因，研究者通常需要运用分子生物学的技术手段。
首先，从植物样本中提取总的RNA。
接着，使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
然后，通过PCR扩增方法，利用设计好的引物扩增目标基因。
最后，将扩增得到的目标基因序列进行测序，并进行进一步的分析。
二、转录因子基因的功能鉴定转录因子基因的功能鉴定是研究者进一步了解转录因子在植物抗逆逆境中的调控机制的重要手段。
功能鉴定一般包括过表达和抑制表达两种方法。
对于过表达，研究者通常使用植物转化技术，将目标基因导入植物细胞中，并使其过度表达。
通过观察转基因植物在逆境条件下的表型变化，可以初步了解转录因子的功能。
而对于抑制表达，研究者通常运用RNA干扰或基因编辑技术等方法，针对目标基因进行敲除或降低表达。
通过观察敲除或降低表达的植物在逆境条件下的表型变化，可以更加准确地判断转录因子在植物逆境抗性中的具体作用。
三、转录因子基因的功能调控研究发现，转录因子基因调控逆境响应网络的机制非常复杂。
转录因子可以通过直接结合到目标基因的启动子区域，调控目标基因的转录水平。
此外，转录因子还可以通过互作和信号传递通路来调控其他转录因子，构建复杂的调控网络。
近年来，一些研究表明，转录因子基因在植物中的调控可能存在着时间和空间的特异性。
即在不同的发育阶段和不同的组织器官中，转录因子的表达模式和调控作用可能存在差异。
这一点对于我们深入理解植物逆境抗性的分子机制至关重要。
四、转录因子基因的创新研究方法目前，植物领域的研究学者们提出了一系列的创新研究方法。
植物逆境响应与抗逆机制的分子调控研究
植物逆境响应与抗逆机制的分子调控研究植物生长与发育受到各种内外部环境因素的影响，其中逆境因素如高温、低温、干旱、盐碱等对植物生长发育具有负面影响。
然而，植物通过一系列的逆境响应和抗逆机制来应对这些逆境条件，以确保其生存能力和适应力。
本文将着重探讨植物逆境响应与抗逆机制的分子调控研究。
一、高温逆境响应与抗逆机制的分子调控研究高温对植物的生长发育具有显著的负面影响，因此植物通过一系列逆境响应和抗逆机制来应对高温逆境。
研究发现，热激蛋白（heat shock proteins, HSPs）在高温逆境响应中发挥着重要的作用。
HSPs参与了蛋白质的折叠、传递和降解，可以维持蛋白质的稳态，并保护细胞免受高温引起的损伤。
此外，激活热休克因子（heat shock factors, HSFs）家族也被认为是高温逆境响应的关键因子，在高温条件下，HSFs能够结合到热激蛋白基因的启动子上，促进热激蛋白的表达。
二、低温逆境响应与抗逆机制的分子调控研究低温逆境对植物的生长发育同样具有重要影响，因此，植物通过一系列逆境响应和抗逆机制来适应低温环境。
研究发现，C-repeat binding factor（CBF）家族在低温逆境响应中起着重要的作用。
CBF家族成员能够与低温响应元素（CRT/DRE）结合，激活一系列的抗寒相关基因的转录，从而提高植物对低温的耐受性。
此外，植物还通过调节膜脂代谢、产生保护蛋白等方式来应对低温逆境。
三、干旱逆境响应与抗逆机制的分子调控研究干旱逆境是植物生长发育的主要限制因素之一，因此，植物通过一系列的逆境响应和抗逆机制来适应干旱环境。
研究发现，abscisic acid （ABA）在干旱逆境响应中起着关键的作用。
ABA能够通过激活相应的信号途径，如MAPK（mitogen-activated protein kinase）途径，进而激活抗性蛋白的表达，从而提高植物的干旱适应性。
此外，研究还发现，蔗糖信号通路在干旱逆境响应中也发挥重要的作用。
植物逆境响应和信号传导的分子机制和干预方法
植物逆境响应和信号传导的分子机制和干预方法植物是自然界中最为重要的生物类群之一，它们在维持生态平衡和保护生态环境中扮演着重要的角色。
然而，植物在逆境环境下的生长和生存常常受到限制，如气候异常、土壤贫瘠、重金属污染等，这些因素对植物的健康和生产力造成了巨大的威胁。
因此，了解植物逆境响应和信号传导的分子机制，对于解决农业生产和环境保护等相关问题具有重要意义。
一、植物逆境响应的分子机制植物在逆境环境下，为了应对外界的压力，会调整自身的生理和生化状态，以适应环境的变化。
植物逆境响应的分子机制包括三个方面：一是感知逆境刺激的信号分子；二是传递逆境信号的路线；三是触发逆境应答的效应分子。
1.感知逆境刺激的信号分子植物感知逆境刺激的信号分子主要包括激素、离子等，其中ABA（脱落酸）作为植物重要的逆境激素，在逆境环境下发挥着明显的作用。
ABA的水平的升高可以通过环境刺激，由于水分亏缺和高浓度盐等而产生，在植物发育和生存过程中发挥着重要的作用。
除ABA外，其他激素如IAA（生长素）、过氧化氢（H2O2）及乙烯等对植物的逆境响应也有影响。
2.传递逆境信号的路线植物逆境信号的传递路线主要包括3个部分，即Fei–C系列、MAPK系列和Ca2+系列。
Fei–C是植物中一个重要的信标蛋白家族，包含了不同的细胞质受体和环境适应信号途径。
它在逆境信号中起着中心作用，如低温、干旱、高浓度盐及其他应激逆境下对植物发育和生长的调节。
3.触发逆境应答的效应分子植物中有许多逆境应答效应分子，如反应氧物质（ROS）、抗氧化酶、热激蛋白、LEA(低温诱导蛋白)等，它们的作用包括维持细胞内稳定的红氧稳态，防止逆境引起的脱水等损伤等。
二、植物逆境响应的信号传导机制植物逆境信号的传导机制主要分为三个途径：Fei–C、MAPK、Ca2+。
Fei–C途径主要通过整个信号传导途中的信号识别模块(PRRs/RBOHs/NLRs)来接收真菌、昆虫及病毒的信号，然后在下游引导的TRAFs/MIKs/MKKs等显性模块逐步往下传递，最后通过细胞内的信号转录因子（TF），调控相应基因的表达，实现逆境应答的目标。
植物逆境应答机制研究及其应用
植物逆境应答机制研究及其应用植物是我们生态系统的重要组成部分，它们的生长和发育过程中面临着各种环境压力，例如干旱、盐碱、高温等，这些环境压力对植物的产量和生长环境造成了巨大的影响。
因此，研究植物的逆境应答机制不仅有助于深入了解植物的生物学过程，还可以帮助促进植物生产和农业可持续发展。
植物逆境应答机制主要包括转录水平和转录后水平的调控。
例如，停止某些基因的表达和启动其他基因的表达，进而使植物能够应对不利的外部环境。
转录水平的调控包括了许多蛋白质激活剂，这些激活剂会刺激细胞核的基因表达过程，进而启动一系列的信号传递过程。
转录后水平的调控主要是指mRNA的拆分和调节，这使mRNA能够正常表达，从而促进某些蛋白质的合成，进而促进生长过程。
植物逆境应答机制不仅是一种类比与反应，还可以被视作一种细胞生物学过程。
通过这种过程，植物能够调节其利尿途径、清除自由基和保护基因，进而应对不同的逆境。
例如，植物在受到高盐和干旱压力时会释放多种物质，例如ABA、亚硝酸和乙烯，这些物质能够调控植物的利尿途径和保护植物的DNA，从而促进干旱逆境应答。
研究植物逆境应答机制不仅有助于我们了解植物的生物学过程，还可以促进农业可持续发展。
例如，通过研究植物的逆境应答机制，我们可以开发更多的新技术，例如基因编辑技术和开发更多的热、条件和抗病物种。
这些技术不仅可以改善植物的品质和产量，还可以降低农业的成本和提高农产品的出口价值。
当然，植物逆境应答机制研究还存在一些挑战。
其中最大的一个挑战就是如何控制植物的逆境应答。
因为植物的生长和发育过程中有许多复杂的因素，例如土壤、气候、水分和光照等，这些因素都会影响植物的逆境应答机制。
所以，我们需要更多的实验研究和理论研究来发现如何优化植物的逆境应答机制。
总之，研究植物逆境应答机制是一项非常重要的研究方向。
通过这种研究，我们可以更好地了解植物的生物学过程，进而开发更多的新技术来促进农业的发展和可持续性。
植物逆境耐受性基因的克隆和功能研究
植物逆境耐受性基因的克隆和功能研究植物在不同的生长发育阶段，会遭遇各种各样的逆境环境，如干旱、高温、低温、盐碱等等，这些逆境条件会引起植物生长发育的异常，但是有些植物确能够适应并克服这些逆境环境，这是因为在它们的基因组中存在着许多与逆境耐受性相关的基因，这些基因为植物提供了能够应对各种逆境情况的生理和生化机制。
为了研究这些基因在植物逆境耐受性中所扮演的角色，科学家通过对植物基因组进行克隆和功能研究，来探究其分子机制和调控途径。
首先，通过基因克隆技术，可将植物基因用于各种实验室研究，如基因转化、表达和功能分析等。
与此同时，比较生物学和功能基因组学的方法能够直接筛选在逆境条件下表达的基因，从中提取与逆境耐受性相关的基因并进行深入研究。
在克隆出逆境耐受性基因的基础上，着重对其功能进行研究，探究其所处的逆境环境对基因发挥作用的影响和调控途径。
例如，通过基因编辑技术和转录组学分析，科学家可以研究植物逆境耐受性遗传机制，设计出对应的生物学管理策略，有助于提高植物抗逆境的水平。
除此之外，植物逆境耐受性的研究也需要密切关注植物的细胞和分子层面，尤其是膜和蛋白质的逆境耐受性机制。
例如，植物的质膜在逆境条件下会经历一系列调整和适应，优化细胞代谢，并调节离子和水分的吸收和输送。
目前，科学家们已经从阿拉伯芥、水稻和玉米等多个模式植物中鉴定了大量的与逆境耐受性相关的转录因子、蛋白激酶、离子转运蛋白等基因，同时也厘清了这些基因与植物逆境耐受性之间的功能联系。
总的来说，植物逆境耐受性基因的克隆和功能研究，对提高逆境植物的产量、促进环境可持续发展、解决粮食安全等具有深远的意义。
因此，对植物逆境耐受性的分子机制和调控途径进行深入研究，有助于提高人类对环境的适应能力，同时也有助于我们更好地理解植物的生理活动和基因组组成。
植物对逆境的信号转导与应答
植物对逆境的信号转导与应答作为生物界中的一员，植物也面临着各种不利的环境因素，称为逆境。
逆境可以是干旱、高温、低温、盐碱胁迫等，这些逆境对植物的生长和发育造成了极大的影响。
为了应对逆境，植物具备了一套复杂的信号转导网络和应答机制。
本文将探讨植物对逆境的信号转导和应答过程。
一、逆境信号的感知与传导植物对逆境信号的感知主要通过细胞膜上的特殊蛋白质来实现。
例如，当植物受到干旱胁迫时，根部的感知器可以感知土壤中水分的减少，进而触发一系列的信号传导过程。
类似地，高温、低温和盐碱等逆境都有相应的感知机制。
逆境信号的传导过程涉及多个信号分子和信号通路，其中最为重要的是植物激素。
植物激素是一类由植物自身产生的化学物质，可以调控植物的生长、发育和应答逆境的能力。
二、逆境信号的应答机制逆境信号传导到植物细胞后，会引发一系列的应答机制。
这些机制旨在帮助植物适应逆境环境，提高其生存能力。
1. 启动逆境反应基因逆境信号传导可以激活一些逆境反应基因，这些基因编码着具有特殊功能的蛋白质。
通过表达这些基因，植物可以产生逆境适应的蛋白质，如抗旱蛋白、抗寒蛋白等。
这些蛋白质可以保护植物组织免受逆境的伤害。
2. 调节离子平衡和渗透调节逆境环境中的高盐、低温等条件会干扰植物细胞的离子平衡和渗透调节。
植物通过调节离子通道和渗透物质的积累，维持细胞的稳态。
例如，一些植物可以通过调节离子通道的表达量和活性，以及调节渗透物质的积累和分布，来适应高盐环境。
3. 调控抗氧化系统逆境环境中，植物细胞会产生大量的活性氧自由基，这对细胞的结构和功能造成严重损害。
植物通过调节抗氧化酶的活性和表达，清除过多的活性氧自由基，从而提高细胞的抗逆境能力。
三、逆境信号转导网络的调控与适应植物对逆境信号的信号转导网络是非常复杂的，其中包括了多个信号分子、激酶级联反应和转录因子的调控等。
这些调控因子共同作用，形成了植物对逆境环境的适应能力。
逆境信号转导网络具有高度的调控性。
逆境下植物对超氧化物歧化酶的调节和表达机制
逆境下植物对超氧化物歧化酶的调节和表达机制植物是自然界中最基础的生命体，它们通过吸收光能和二氧化碳进行光合作用，从而生产出氧气和有机物质。
在这个过程中，由于自由基的产生，也会产生一些有害的物质，比如超氧化物（O2-）。
而植物通过一些调节机制，在逆境环境下，如干旱、高温、寒冷、病虫害等情况下，对超氧化物歧化酶（SOD）进行调节和表达，以保证身体健康。
超氧化物歧化酶是一种钴锌蛋白，其主要作用是将超氧化物氧化为氧气和双价金属离子（Mn或Fe），从而降低超氧化物的浓度，保护细胞和组织免受超氧化物的损伤。
对于逆境环境下的植物来说，SOD的表达和调节机制也至关重要。
首先，SOD的表达量是受到环境刺激的影响的。
比如，在高温条件下，植物会增加SOD的表达量，从而提高细胞对超氧化物的防御能力。
而在干旱、盐碱和低温等逆境环境下，植物的SOD表达量也会增加，以应对这些不利因素的挑战。
其次，SOD的表达是受到激素的影响的。
在植物的生长发育过程中，激素（如赤霉素、脱落酸和乙烯等）与植物的SOD表达也有着紧密的联系。
激素的浓度和作用方式不同，会导致SOD表达量的上升或下降。
此外，SOD的表达也与植物自身的遗传特性有关。
通过对植物基因组的分析和比较，研究人员发现，不同品种的植物对SOD有着不同的表达模式。
这也对植物的逆境适应能力产生了影响。
除了表达调节机制，植物也通过一些修饰机制来调控SOD的活性。
比如，植物的蛋白质修饰能够影响SOD的结构和活性，从而调节其功能。
此外，植物的SOD也会与其他蛋白质相互作用，形成复合物，进一步调节SOD的活性和功能。
综上所述，逆境下植物对SOD的调节和表达机制是非常复杂的，其中涉及到环境刺激、激素、基因遗传和蛋白质修饰等方面。
对于研究植物的逆境适应能力和进一步提高农作物产量和质量，了解植物SOD的调节和表达机制是非常重要的。
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V ol 131,N o 110pp 11328-1332 Oct 1,2005作 物 学 报ACT A AG RONOMICA SI NICA第31卷第10期2005年10月 1328～1332页植物逆境诱导启动子mwcs120的克隆及表达特性研究杜 娟1 朱 祯2 李晚忱1,3Ξ(1四川农业大学玉米研究所,四川雅安625014;2中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京100101)摘 要:以小麦基因组DNA 为模板,通过特异PCR 扩增,克隆逆境诱导表达启动子mwcs120。
序列分析表明,该启动子与冷诱导启动子wcs120的序列同源性为9711%,有2个位点发生了突变,但逆境调控保守元件的序列未发生改变。
瞬时表达实验表明,在单子叶和双子叶植物中,mwcs120启动子均受低温和高盐逆境诱导,使G US 基因的表达增强。
因此,mwcs120启动子在作物抗逆基因工程中具有较好的应用前景。
关键词:逆境;诱导启动子;克隆;瞬时表达中图分类号:Q756Cloning and Expression Properties of Plant Stress I nducible Promoter mwcs120DU Juan 1,ZH U Zhen 2,LI W an 2Chen 1,3(1Maize Research Institute ,Sichuan Agricultural Univer sity ,Ya ’an 625014,Sichuan ;2Institute o f G enetics and Developmental Biology ,Chinese Academy o fSciences ,Beijing 100101,China )Abstract :G rowth and development of plant are heavily in fluenced by abiotic stress 1In recent years ,different resistant genes have been cloned and trans ferred into less resistant species 1It was attem pted to im prove crops for their resistance to abiotic stress 1In m ost cases ,however ,forceful constitutive prom oter was used to prom ote over expression of stress gene 1This was disadvantageous to some activities of physiological metabolism ,although the transgenic plant was im proved for its stress resistance 1In this study ,stress inducible prom oter mwcs120was cloned by specific PCR from wheat genom ic DNA 1Sequence analysis showed that this prom oter was 9711%hom olog ous with cold inducible prom oter wcs1201Even though mutations were found at tw o locations ,conservative elements for stress regulation were still kept unchanged 1T ransient expression experiment indicated that ,both in m onocotyledonous and dicotyledonous plants ,prom oter mwcs120was induced by low tem perature and high salt stress to increase expression of gene G US 1Therefore ,prom oter mwcs120was hopeful to be used to gene engineering of crop im provement for stress resistance 1K ey w ords :S tress ;Inducible prom oter ;C loning ;T ransient expression 非生物逆境严重影响植物的正常生长发育。
近年来,多种抗逆基因被克隆,并转入抗逆性较差的物种,显著提高了作物对非生物逆境的抵抗能力[1]。
但是,在植物抗逆基因工程中,多采用组成型强启动子启动抗逆基因过量表达,虽然使转基因植物的抗逆性得以提高,但对植物的一些生理代谢活动却有抑制作用[1]。
据K asuga 等(1999)报道,组成型启动子CaMV35S 启动DRE B 基因在拟南芥中表达,虽提高了抗逆性,但植株矮化,生长畸形,籽粒数减少;而由诱导型启动子rd29A 启动的DRE B 基因在拟南芥中的表达不仅提高了植株的抗逆性,而且避免了对生长的负面影响[2]。
本研究从小麦中克隆逆境诱导表达启动子mwcs120,并进行了序列分析,以期为植物抗逆基因工程提供新的诱导型启动子。
1 材料和方法111 wcs120启动子的克隆和测序 根据G enBank 公布的wcs120基因启动子序列(AF031235),设计一对特异PCR 引物P1(5′2GG ACG AC 2AACG CGG T C AG T C 23′)和P2(5′2CCT C ACT CGGG AAA 2Ξ基金项目:国家“863计划”课题(2002AA207008)和国家自然科学基金项目(30070476)资助。
作者简介:杜娟(1978-),女,中国科学院遗传与发育生物学研究所博士生。
3通讯作者:李晚忱(1958-),教授,博士生导师,四川省学术带头人,主要从事玉米遗传育种研究。
E 2mail :aumdyms @sicau 1edu 1cnReceived (收稿日期):2004210208,Accepted (接受日期):20052022131T CT ACT A23′),用R oche公司生产的Expand High Fidelity PCR System,从加拿大小麦品种Fredrick的基因组DNA中,扩增wcs120基因的启动子。
用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收扩增片段,纯化后插入Promega公司生产的克隆载体p GE M R2T Easy,电击转化大肠杆菌DH5α菌株。
用直径12cm的培养皿分装含100μgΠm L氨苄青霉素的LB固体培养基,表面涂布浓度为20mgΠm L的X2gal40μL和浓度为20mgΠm L的IPTG40μL,晾干后涂布接种转化菌株,37℃培养过夜,挑选白色菌落,经液体培养后碱法提取质粒DNA,Eco RⅠ酶切鉴定,筛选重组质粒pTP2m wcs120。
mwcs120启动子序列的测定,由上海博亚生物技术有限公司完成。
利用DNAStar软件中的EditSeq 和MegAlign程序进行启动子序列分析和比对。
112 瞬时表达载体构建用Hin dⅢ和Bam HⅠ双酶切质粒pUG FP ocs和psp35SG US,分别回收pUG FP ocs中的单子叶植物启动子ubiquitin片段和psp35SG US中含“G US2T2nos”的载体结构,用T4DNA连接酶连接获得具有表达结构“P2Ubiquitin2G US2T2nos”的pUbiG US质粒,构建成G US基因的单子叶植物组成型瞬时表达载体,作为mwcs120启动子在单子叶植物中瞬时表达实验的对照。
用中国科学院遗传与发育生物学研究所提供的由花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S启动G US基因的质粒psp35SG US,作为mwcs120启动子在双子叶植物中瞬时表达实验的对照。
根据mwcs120启动子序列测定结果,设计1对特异PCR引物P3(5′2TTG CTCG AG AC AACG CGG TC AG 23′)和P4(5′2CGGG ATCCTC ACTCGGG AAATC23′),以pTP2m wcs120质粒为模板,扩增mwcs120启动子。
琼脂糖电泳后回收并纯化扩增片段,用分别在P3和P4引物序列中具有识别位点的限制性内切酶Xho Ⅰ和Bam HⅠ消化,回收mwcs120启动子片段。
再用相同的限制性内切酶消化pUbiG US质粒,回收载体片段。
T4DNA连接酶连接2次酶切后回收的片段,获得含表达结构“P2mwcs1202G US2T2nos”的诱导型瞬时表达质粒pm wG US。
113 基因枪法转化玉米胚性愈伤组织和烟草幼叶参考付凤玲等[3]和张莉萍等[4]的方法,以1300 psi系统压力和28时汞柱真空度,在Bio2Rad公司DuP ont PDS1000ΠHe型基因枪上,分别转化玉米胚性愈伤组织和烟草幼叶,每枪1μg质粒DNA。
玉米胚性愈伤组织是用自交系“182599”的未成熟胚,在改良N6培养基上诱导培养的[5],用mwcs120启动子启动的诱导型表达载体pm wG US转化,以单子叶植物组成型表达载体pUbiG US为对照,各转化愈伤组织150块。
烟草幼叶取自品种N89的无菌株,在1Π2MS 培养基上培养,用mwcs120启动子启动的诱导型表达载体pm wG US转化,以双子叶植物组成型表达载体psp35SG US为对照,各转化幼叶90片。
114 逆境处理和GUS组织化学染色转化后将1Π3玉米愈伤组织转移至N6培养基上,27℃黑暗培养;1Π3烟草幼叶转移至1Π2MS培养基上,24℃条件下,每天16h光照培养,作为正常生长条件的对照。
同时将1Π3玉米愈伤组织或烟草幼叶转接到NaCl浓度为250mm olΠL的高盐培养基上,在相同温度和光照条件下继续培养。
另外1Π3玉米愈伤组织或烟草幼叶在原培养基上于10℃低温培养。
处理3d以后,参考Jeffers on的方法[6],用G US反应液(011m olΠL NaH2PO4缓冲液,pH710;10mm olΠL E DT A,pH710;5mm olΠL铁氰化钾;5mm olΠL亚铁氰化钾;110mm olΠL X2gluc;011%Triton X2100)浸泡上述各处理的玉米愈伤组织或烟草幼叶,抽真空(200Mbar,重复2次,每次30s),37℃温育16h,用蒸馏水清洗。