PCR-DGGE实验
DGGE操作步骤
DGGE操作步骤DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）是一种常用的DNA分析技术，用于研究DNA序列的变异情况和分类等。
DGGE的操作步骤如下：1.准备样品2.PCR扩增将待测DNA进行PCR扩增，以增加DNA的数量。
需要用到一对引物，它们会扩增出感兴趣的DNA片段。
PCR反应体系中含有模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液。
引物的选择需要根据研究的目的确定。
3.准备DGGE凝胶将一定比例的聚丙烯酰胺和甲酰胺溶液以一定的比例混合，制备得到DGGE凝胶。
这个比例可以根据需要调整，以获得所需的DNA分离效果。
其中甲酰胺会使凝胶变性，使DNA分子在电泳中以变性形式进行分离。
4.准备DGGE系统将DGGE凝胶置于DGGE装置中。
根据实验需要，在凝胶两端插入电极，接通电源。
将凝胶槽填满电泳缓冲液，用于维持凝胶均匀膨胀，快速散发产热，以及降低电阻。
一般来说，TAE或TBE缓冲液可用于DGGE。
5.准备DNA样品将PCR扩增得到的DNA样品处理成等浓度。
可以用醋酸抽提、酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒等方法进行纯化。
6.电泳分离将等量的DNA样品加入到DGGE样品孔中。
将样品孔上方和下方的空孔填满DNA负载缓冲液，以避免样品在电泳过程中干涸。
开始电泳，一般电泳时间和电场强度要根据平台的规格表决定。
7.停止电泳和染色当DNA样品从顶端到底端通过凝胶后，在适当的时间内停止电泳。
将凝胶取出，根据需要进行染色。
GelRed或者SYBR Green等染料可以用于可视化DNA条带。
8.分析使用相应的软件如Quantity One或ImageJ等，对电泳结果进行分析。
将得到的DGGE电泳图像转化成数值形式，以研究样品中的DNA序列变异情况。
总结：DGGE是一种用于分析DNA序列变异的常用技术。
通过PCR扩增得到的DNA样品，经过一系列处理后，加入到DGGE凝胶中进行电泳分离。
PCR-DGGE实验
2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。
2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。
将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。
在紫外光下观察电泳条带。
2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。
将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。
并用紫外分光光度计测定DNA浓度。
2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07g dH2O To 100ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15ml 20ml 25ml 30ml50×TAE缓冲液2ml 2ml 2ml 2ml dH2O 83ml(to 100) 78ml 73ml 68ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。
PCR-DGGE技术分析传统臭鳜鱼发酵过程中细菌群落结构
PCR-DGGE技术分析传统臭鳜鱼发酵过程中细菌群落结构李燕1，吴佳佳2，张井1，戴志远3,*（1.温州市农业科学研究院，浙江温州 325006； 2.中国计量大学生命科学学院，浙江杭州 310018；3.浙江工商大学海洋食品研究院，浙江杭州 310012）摘 要：应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术对黄山臭鳜鱼发酵过程中的细菌群落结构组成进行研究。
以发酵0～8 d的臭鳜鱼为研究对象，每2 d取样，提取样品的总DNA，同时进行16S rDNA V6～V8区的PCR扩增，产物纯化后进行DGGE分析。
结果表明：肠球菌（Enterococcus sp.，D带）、腐败西瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，C带）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus，A带）和乙酰微小杆菌（Exiguobacterium acetylicum，F带）在整个发酵过程，特别是发酵后期占较大比例，是黄山臭鳜鱼发酵过程中的优势菌。
臭鳜鱼样品的PCR-DGGE图谱相似度分析显示，臭鳜鱼发酵后期菌群结构比较相似，微生物菌落结构趋于稳定。
本研究结果为筛选适合工业化生产的发酵菌株，有效控制臭鳜鱼生产中存在的腐败菌、致病菌，对提高臭鳜鱼安全性和产品品质具有一定应用价值。
关键词：臭鳜鱼；PCR-DGGE；发酵；细菌群落结构PCR-DGGE Analysis of Bacterial Community Structure in Stinky Mandarin Fish (Siniperca chuatsi)LI Yan1, WU Jiajia2, ZHANG Jing1, DAI Zhiyuan3,*(1.Wenzhou Academy of Agricultural Sciences, Wenzhou 325006, China; 2. College of Life Sciences, Jiliang University,Hangzhou 310018, China; 3. Institute of Seafood, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China) Abstract: Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) was used to study the bacterial community composition in stinky mandarin fish during fermentation. Stinky mandarin fish was fermented for 8 days and sampled every two days for DNA extraction. The V6–V8 region of bacterial 16S rDNA was amplified by PCR and analyzed by DGGE. The results of DGGE showed that Enterococcus sp., Shewanella putrefaciens, Macrococcus caseolyticus and Exiguobacterium acetylicum gradually became dominant strains during the fermentation process, especially in the later stage of fermentation. The comparative analysis of DGGE fingerprints showed that the bacterial community of stinky mandarin fish was similar in later stage of fermentation, and became stable. These findings may provide helpful guidance for screening an industrial fermentation starter, controlling the growth of spoilage organisms and foodborne pathogens and consequently improving the quality and safety of stinky mandarin fish.Key words: s tinky mandarin fish; PCR-DGGE; fermentation; bacterial communityDOI:10.7506/spkx1002-6630-201718005中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）18-0029-06引文格式：李燕, 吴佳佳, 张井, 等. PCR-DGGE技术分析传统臭鳜鱼发酵过程中细菌群落结构[J]. 食品科学, 2017, 38(18): 29-34.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718005. LI Yan, WU Jiajia, ZHANG Jing, et al. PCR-DGGE analysis of bacterial community structure in stinky mandarin fish (Siniperca chuatsi)[J]. Food Science, 2017, 38(18): 29-34. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201718005. 收稿日期：2016-10-22基金项目：浙江省水产品加工重点实验室项目（2011E10002-01）作者简介：李燕（1981—），女，副教授，博士，研究方向为食品应用微生物。
变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)
Fig.1. An example of DNA melting properties in a perpendicular denaturing gradient gel. At a low concentration of denaturant, th e DNA fragment remains double-stranded, but as the concentrati on of denaturant increases, the DNA fragment begins to melt. Th en, at very high concentrations of denaturant,the DNA fragment c an completely melt, creating two single strands.
20.00% 18.00% 16.00% 14.00% 12.00% 10.00% 8.00% 6.00% 4.00%
2.00% 0.00%
2008-2010
1. Microbiological characterisation of Robiola di Roccaverano cheese using PCR-DGGE. Bonetta, S.Carraro, E.Rantsiou, K. Cocolin, L. 2008 Food Microbiology.(IF 2.847) 2. Variation in the active diazotrophic community in rice paddy - nifH PCR-DGGE analysis of rhizosphere and bulk soil. Wartiainen, I. ;Eriksson, T. ;Zheng, W. W. ;Rasmussen, U. 2008 Applied Soil Ecology.(IF2.247) 3. Analysis of community structure of a microbial consortium capable of degrading benzo(a)pyrene by DGGE. Luo, Y. R. ; Tian, Y. ;Huang, X. ;Yan, C. L. ;Hong, H. S. ;Lin, G. H. ; Zheng, T. L. 2009 Marine Pollution Bulletin(IF 2.63)
(完整)PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告
人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告一、研究背景人肠道菌群是指在人体肠道中生长的各种微生物群落，包括细菌、真菌和病毒等。
肠道菌群在人体消化、吸收和免疫等多个方面起着至关重要的作用。
目前，越来越多的研究表明肠道菌群与人体健康密切相关，它们的改变与多种疾病的发生、发展和治疗效果密切相关。
因此，研究肠道菌群的结构、功能及其对人体健康的影响，对于促进人类健康具有重要的意义。
PCR-DGGE是一种常用的肠道菌群研究方法，通过PCR扩增目标基因序列，将不同样品的PCR产物经过DGGE（变性梯度凝胶电泳）检测出差异，从而确定菌群的组成结构和多样性。
然而，PCR-DGGE方法在样品处理和操作环节中容易出现一系列问题，如样品预处理不当、恒温原则和DGGE带解析等，这些问题影响了PCR-DGGE法的特异性、重复性和准确性。
因此，建立PCR-DGGE方法并进行优化是非常必要的。
脾虚是中医学上的一种证候，表现为肌肉松软无力、易疲乏乏力、面色黯淡、食欲不振等症状。
脾主土，主管运化水谷，为人体生命活动所必需。
由于现代饮食结构的改变和生活方式的差异，脾虚已成为常见的调节性疾病。
然而，脾虚的病因及其与肠道菌群的关系尚不明确。
因此，研究脾虚患者的肠道菌群结构与多样性，评估肠道菌群与脾虚间的关系，对于揭示脾虚的病因及推进相关疾病的预防与治疗具有重要的意义。
二、研究目的与内容1. 建立PCR-DGGE方法进行肠道菌群的研究，并对该方法进行优化。
2. 收集脾虚患者的粪便样本进行肠道菌群研究，探讨脾虚患者肠道菌群结构与多样性的变化规律。
3. 利用多元统计学方法对肠道菌群与脾虚间的关系进行分析，评估脾虚患者的肠道菌群与健康人群的差异。
三、研究方法与技术路线1. 采集脾虚患者的粪便样本，提取微生物DNA并进行PCR扩增。
选择16S DNA V3区作为基因靶标，用DGGE进行DNA基因图谱分析，统计并分析不同样品之间菌群结构的相似性与差异性。
PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
PCR-DGGE
（ Ｐ ｅ ｔ ｒ ｉ ｍｏ ｎ ａ ｓ ） 、 假 单 胞菌 属 （ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ） 、泰 氏菌 属（ Ｔ ｉ ｓ ｓ ｉ ｅ ｒ ｅ ｌ ｌ ａ ） 和梭 菌 属 （ Ｃ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍ ） ． 同时。 沼 气池 发 酵 系 统 中 古 菌主 要 包 括 热 丝菌 属 （ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｉｌ ｆ ｕ ｅ ｒ ） 、 甲烷 短杆 菌属 （ Ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｂ ｒ ｅ ｖ ｉ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ） 、 甲烷囊 菌 属（ Ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｃ ｕ ｌ ｌ ｅ ｕ ｓ ） 、产 甲烷 菌属（ Ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｕ ｍ ） 。 其 ， Ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｂ ￣ｖ ｉ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ
Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｗｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ７ ９ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；２ ． Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｙ ｒ Ｂ ｒ ｅ ｅ ｄ ｉ ｎ ｇ Ｂ ａ ｓ ｅ ， Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｏｒ ｂ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｑｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ
中 国环 境 科 学
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2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。
2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。
将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。
在紫外光下观察电泳条带。
2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2 μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。
将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。
并用紫外分光光度计测定DNA浓度。
2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93 g双丙烯酰胺 1.07 g dH2O To 100 ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15 ml 20 ml 25 ml 30 ml50×TAE缓冲液 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml dH2O 83 ml(to 100) 78 ml 73 ml 68 ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。
于棕色瓶中保存在4℃环境中。
3）80%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15 ml 20 ml 25 ml 30 ml50×TAE缓冲液 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 甲酰胺32 ml 32 ml 32 ml 32 ml尿素33.6 g 33.6 g 33.6 g 33.6 gdH2O 83 ml(to 100) 78 ml 73 ml 68 ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。
于棕色瓶中保存在4℃环境中。
4）APS过硫酸铵（APS）0.1 g dH2O 1 ml 5）凝胶加载染料2%溴酚蓝0.25 ml 终浓度0.05%2%二甲苯0.25 ml 终浓度0.05%100%甘油7 ml 终浓度70%dH2O 2.5 ml2.4.2凝胶的制备1.将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统。
2.配制变性浓度为40%和60%的丙烯酰胺溶液到两个离心管中：3.75 ml的0%的变性剂与11.25 ml的80%的变性剂混合得到变性浓度为60%的丙烯酰胺溶液（高浓度）；0%的变性剂与80% 的变性剂各7.5 ml混合配得40%的丙烯酰胺溶液（低浓度）。
3.每个离心管加入120 μl的10% APS和12 μl的TEMED，迅速盖上盖帽后上下颠倒数次混匀。
用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的凝胶，用连有聚乙烯管标有“低浓度”的注射器吸取所有低浓度的凝胶。
通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。
4.将两个注射器安装到梯度传送系统上固定好，再用Y形管将高、低浓度注射器上的聚乙烯管和针头端的聚乙烯管相连。
5.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中，且凝胶中不能出现气泡。
6.小心插入梳子，让凝胶聚合约4小时。
2.4.3电泳1.打开电泳控制装置，预热电泳缓冲液（1×TAE缓冲液）到60 ℃。
2.凝胶聚合完毕后拔下梳子，用去离子水清洗点样孔。
3.将DNA与凝胶加载染料混合，用微量注射器加样，由于DGGE加样量一般不超过500 ng，混合样品的加样量为15 μl。
4.将胶放入电泳槽内，另一侧一定要有对称的制胶板系统来平衡。
5.电泳：先用100 V电压电泳30 min，然后再用65 V电压电泳16 hr。
6.电泳结束后，先拨开短的玻璃板，将胶水平放置在长玻璃板上，均匀的加上20 ml SYBR Green I染色剂，染色30 min。
7.染色结束后，用凝胶成像系统进行拍照。
2.4.4回收聚丙烯酰胺凝胶中的DNA根据DGGE电泳后拍照的图谱，将每个样品中的优势条带切胶回收，用无菌刀从PAGE胶上割下特殊条带，放入灭菌的1.5 ml离心管中，加入50 μl超纯水洗涤，离心，弃掉上清液。
再加入50 μl超纯水水静置过夜，DNA溶解在超纯水中，离心，上清液即为回收的DNA溶液。
2.5 PCR反应用不带GC发夹的引物进行PCR并回收，反应体系及反应条件同2.3。
2.6 连接转化2.6制备感受态细胞2.6.1 TSS法制备感受态细胞1.取- 80℃保存的E.coil DH5α菌株于冰上溶化，划线接种于LB平板上，在37℃条件下过夜培养。
2.挑取单菌落于5 ml的LB液体培养基中，在220 rpm、37℃条件下过夜培养。
3.将1 ml过夜培养的培养基加入到盛有100 ml液体培养基的500 ml的锥形瓶中。
在220 rpm、37℃条件下培养，2.5 hr后开始用紫外可见分光光度计测培养基的OD600，直至OD600在0.3~0.4之间，一般0.35最适。
4.当OD600达到0.35时，将锥形瓶冰浴20 min，然后把培养基分装到两个50 ml的离心管中，3000 rpm、4℃离心10 min。
5.离心后弃掉上清液，每个离心管中加入5 ml的TSS溶液使细胞重悬。
重复步骤4、5。
6.分装感受态细胞：每个1.5 ml的离心管中分装250 μl。
储存在-80 ℃条件下。
2.6.2感受态细胞的检验1.质粒和感受态细胞混和：分别在50 μl感受态细胞悬液中加入下列DNA 质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30 min。
感受态细胞+ pUC19质粒2 μl感受态细胞+ 无菌水 2 μl （阴性对照）2.热激：42℃水浴中热激90秒，热激后立即冰浴2 min。
3.复苏：每管中加入450 μl LB液体培养基，混匀后37℃、200 rpm培养1 hr，使细菌恢复正常生长状态。
4.涂板：将45.8 μl的IPTG与X-gal的混合液（100 mg/ml的IPTG和20 mg/ml 的X-gal以7:40的比例配备）涂布到LB-Amp平板上。
待摇床停止摇动后，取200 μl的菌液均匀的涂布到LB-Amp平板上。
将平板放入生化培养箱内，37 ℃过夜培养。
观察培养皿中感受态细胞的生长状态，阴性对照都是蓝色菌落，转入质粒的平板有白色菌落，说明感受态细胞制备成功。
2.7连接转化使用pMD19-T Vector进行连接，其操作方法为在微量离心管中配制5 μl的DNA溶液体系：2.5 μl的Solution I，0.5 μl的pMD19-T Vector和2.0 μl纯化的DNA样品。
充分混匀后在16 ℃条件下连接8 hr。
将感受态细胞于冰上溶化，将连接产物加到50 μl感受态细胞于中，冰浴30 min，然后42 ℃温度下热激90 s，再冰浴2 min。
之后向离心管中加入450 μl的LB液体培养基，混匀。
将其放入摇床内，200 rpm、37℃摇动1 hr。
待摇床停止摇动后，取200 μl的菌液均匀的涂布到LB-Amp平板（涂有IPTG 和X-gal，同上）上。
将平板放入生化培养箱内，37 ℃过夜培养。
挑取白色单菌落于LA平板上，37 ℃过夜培养。
2.8阳性克隆检验培养出的白色菌落经菌落PCR法进行检验。
选用通用菌落PCR引物M13-47和RV-M，其PCR反应体系为：PCR反应体系成分终液浓度引物M13 0.2 μM引物RV-M 0.2 μMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 UdNTPs 0.2 mMBuffer 1×模板DNA 菌落dH2O to 25 μl反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃2 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。
PCR结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检验目的片段是否存在。
若电泳后条带长度不正确，需重新点板培养，然后再进行菌落PCR检验，至电泳条带与符合要求。
2.9测序挑取经菌落PCR检验克隆成功的菌落于1 ml的LB液体培养基中，在37 ℃、200 rpm条件下过夜培养。
然后将菌液送去测序。
试剂盒DNA提取试剂盒；DNA纯化试剂盒；试剂1. 提取DNA：1 ml、200 µl、100 µl、10 µl的移液器及相对应的枪头，1.5 ml 的离心管，50 ml离心管，200 µl的PCR管，离心机，分析天平2. 琼脂糖凝胶电泳所用试剂：琼脂糖，50×TAE缓冲液，GeneRuler TM DNA Ladder Mix（Marker），核酸染料，loading buffer；量筒、锥形瓶、微波炉（或水浴锅）、电泳仪、10µl移液器，10µl枪头，3. PCR所用的试剂：Taq DNA Polymerase，Taq Buffer，dNTPs，BSA，MgCl2；冰盒，PCR管，医用酒精消毒，酒精灯，切胶刀，DNA纯化试剂盒，1.5ml离心管，分析天平，移液器、枪头3. DGGE所用试剂：过硫酸铵（Ammonium Persulfate，APS），TEMED（即N，N，N′，N′-Tetramethylethylenediamine，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺），SYBR Green Ⅰ（10000×），丙烯酰胺，双丙烯酰胺，50×TAE缓冲液，甲酰胺，尿素，100%甘油；分析天平，移液管，量筒，超声振荡器，0.45µm的滤膜，注射器（10或20ml），DGGE电泳仪，微量注射器（50µl），凝胶成像系统4. LB培养基：琼脂粉，Tryptone，Yeast Extract，琼脂粉，氯化钠，氨苄青霉素（Ampicillin），IPTG，X-gal；锥形瓶，量筒，分析天平，灭菌锅5. 制备感受态细胞所用试剂：PEG，DMSO，MgCl2（1M，pH6.5），大肠杆菌；接种环，培养皿，酒精灯，锥形瓶，50ml离心管，冷冻离心机，牙签，试管，摇床（37℃，220 rpm），无菌操作台，涂布棒，工业酒精，水浴锅（42℃，16℃），冰，牙签6. 连接转化：pMD19-T vector7. 引物：M13和RV-M主要仪器离心机，超纯水系统，PCR仪，琼脂糖凝结电泳仪，超声消化器，变形梯度凝胶电泳仪，凝胶成像系统，紫外可见光分光光度计，灭菌锅，冷冻离心机，变频摇床，生化培养箱，金属浴，水浴锅，超净台（无菌操作台），移液器。