山东省海洋与渔业科技成果汇编表
海洋环境科学类书籍
16开
林炳尧
潜水气体
58.00
2007.09
16开
李晓虹
第二十届全国水动力学研讨会文集
160.00
2007.08
16开
朱德祥 周连第 杨显成 孙西欢
水波相似与模拟
68.00
2006-06
7
16开
左其华
紊流及泥沙运动的随机理论及三维数学模型（英文）
50.00
(估)
2006-04
1
16开
（精）
李元亚
河口科学研究与实践的综合方法
18.00
2005.09
30
16开
高正荣等
合成孔径雷达海面风场海浪和内波遥感技术
40.00
2005.09
10
16开
杨劲松
河流海岸模型测试技术
68.00
2004.11
7
16开
蔡守充等
海岸带污水排放工程环境设计导论
48.00
2004.07
10
16开
孟伟等
波浪对海上建筑物的作用(第二版)
45.00
2002.11
中国近海海面热平衡
66.00
2008.01
7
16开
陈锦年
等
海洋溢油生态损害评估的理论、方法及案例研究
88.00
2008.01
5
16开
高振会
杨建强
王培刚
海洋保护区——概念与应用
58.00
2007.11
7
16开
刘洪宾刘康
中国沿海甲藻孢囊与赤潮研究
40.00
2007.07
10
16开
王朝晖编著
中国海岸带灾害地质特征及评价
MC1R基因多态性与杜黑猪毛色关系研究
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１０):１５２~１５７ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１０.０２１收稿日期:２０２３－０１－１０基金项目:山东省农业良种工程项目(２０２０ＬＺＧＣ０１２ꎬ２０２２ＬＺＧＣＱＹ００７)ꎻ枣庄市自主创新及成果转化项目(２０２２ＧＨ－２７)ꎻ山东省生猪产业技术体系(ＳＤＡＩＴ－０８－０３)作者简介:巩静(１９９９ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事猪遗传育种与繁殖研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１５７８４３３１７５＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:王继英(１９７７ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为猪遗传育种与繁殖ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｊｎｗａｎｇｊｉｙｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍ耿立英(１９７４ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为动物遗传育种与繁殖ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｒｏｓｅｇｅｎｇｌｙ＠１２６.ｃｏｍＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究巩静１ꎬ２ꎬ杨晴１ꎬ２ꎬ王艺盼３ꎬ王彦平２ꎬ朱晓东３ꎬ张传生１ꎬ耿立英１ꎬ王继英２(１.河北科技师范学院动物科技学院ꎬ河北秦皇岛㊀０６６６００ꎻ２.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.枣庄黑盖猪养殖有限公司ꎬ山东枣庄㊀２７７１００)㊀㊀摘要:黑色素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因是调控哺乳动物毛色的一个关键基因ꎮ为了解杜洛克和枣庄黑盖猪杂交组合(简称杜黑猪)中ＭＣ１Ｒ基因多态性与毛色表型的关系ꎬ本研究以３９０头杜黑猪Ｆ２代个体和１８头枣庄纯种黑盖猪为研究对象ꎬ对Ｆ２代群体进行毛色表型类型分组ꎬ利用液相芯片捕获测序技术鉴定ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ位点的基因型ꎮ结果表明ꎬ杜黑猪Ｆ２代群体出现了毛色分离ꎬ其中ꎬ７５.１３％的个体为全黑色ꎬ１３.０８％的个体为棕红色ꎬ其余１１.７９％的个体呈现混杂色ꎬ包括黑红条纹㊁棕色偏黄㊁棕色偏白等ꎮ测定的５个多态ＳＮＰ位点中ꎬＥＤ１等位基因３个ＳＮＰ位点(ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０㊁ｒｓ４５４３４６２９)的突变纯合型(ＧＧ㊁ＧＧ㊁ＴＴ)个体表现为黑红条纹ꎬ野生纯合型(ＡＡ㊁ＡＡ㊁ＣＣ)个体表现为棕红色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ㊁ＴＣ)个体大部分(８０.８３％)表现为黑色ꎬ少部分(１９.１７％)为黑色红纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎮｅ等位基因２个ＳＮＰ位点(ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３)的突变纯合基因型(ＡＡ㊁ＴＴ)个体全部为棕红色ꎬ野生纯合基因型(ＧＧ㊁ＣＣ)个体全部为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＴＣꎬＡＡ㊁ＴＣꎬＧＡ㊁ＴＴ)大部分(８０.９９％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.０１％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎮＨａｐｌｏＶｉｅｗ单倍型分析表明５个ＳＮＰ高度连锁ꎬ位于１个单倍型块内ꎮ本研究结果表明ꎬ杜黑猪毛色黑色对棕红色为不完全显性ꎬ利用ＭＣ１Ｒ基因的５个ＳＮＰ标记进行毛色分子标记辅助选择可快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ使杜黑猪新品种的毛色迅速固定为全黑色ꎬ以加速新品种培育进程ꎮ关键词:杜黑猪ꎻ毛色ꎻＭＣ１Ｒ基因ꎻＳＮＰꎻ基因型中图分类号:Ｓ８２８.１３㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１０－０１５２－０６ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＭＣ１ＲＧｅｎｅａｎｄＣｏａｔＣｏｌｏｒｏｆＤｕｈｅｉＰｉｇｓＧｏｎｇＪｉｎｇ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＱｉｎｇ１ꎬ２ꎬＷａｎｇＹｉｐａｎ３ꎬＷａｎｇＹａｎｐｉｎｇ２ꎬＺｈｕＸｉａｏｄｏｎｇ３ꎬＺｈａｎｇＣｈｕａｎｓｈｅｎｇ１ꎬＧｅｎｇＬｉｙｉｎｇ１ꎬＷａｎｇＪｉｙｉｎｇ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｅｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＱｉｎｈｕａｎｇｄａｏ０６６６００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＭｕｌｔｉ￣ｏｍｉｃｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉＰｉｇＢｒｅｅｄｉｎｇＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＺａｏｚｈｕａｎｇ２７７１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｅｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ￣１ｒｅｃｅｐｔｏｒ(ＭＣ１Ｒ)ｇｅｎｅｉｓａｋｅｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍａｍｍａｌｉａｎｃｏａｔｃｏｌｏｒ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＭＣ１ＲｇｅｎｅａｎｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆｔｈｅｃｒｏｓｓｂｒｅｄｐｉｇｓｆｒｏｍＤｕｒｏｃａｎｄＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉｐｉｇｓ(Ｄｕｈｅｉｐｉｇｓｆｏｒｓｈｏｒｔ)ꎬｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆ３９０Ｆ２Ｄｕ￣ｈｅｉｐｉｇｓｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄꎬａｎｄ１０ＳＮＰｌｏｃｉｏｆＭＣ１Ｒｏｆ３９０Ｆ２Ｄｕｈｅｉｐｉｇｓａｎｄ１８ＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉｐｉｇｓｗｅｒｅｇｅｎｏｔｙｐｅｄｂｙｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｌｉｑｕｉｄｃｈｉｐ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆＦ２ｐｉｇｓｗａｓｓｅｐａｒａ￣ｔｅｄ.Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙꎬ７５.１３％ｏｆｔｈｅＦ２ｐｉｇｓｗｅｒｅｂｌａｃｋꎬ１３.０８％ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｂｒｏｗｎꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ１１.７９％ｓｈｏｗｅｄｍｉｘｅｄｃｏｌｏｒｓｕｃｈａｓｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ａｍｏｎｇｔｈｅｆｉｖｅｍｅａｓ￣ｕｒｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＳＮＰｓꎬｐｉｇｓｗｉｔｈｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＧＧꎬＧＧꎬＴＴ)ａｔ３ＳＮＰｌｏｃｉ(ｒｓ４５４３５０３１ꎬｒｓ４５４３４６３０ꎬｒｓ４５４３４６２９)ｏｆＥＤ１ａｌｌｅｌｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬｗｈｉｌｅｔｈｏｓｅｗｉｔｈｗｉｌｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏ￣ｔｙｐｅｓ(ＡＡꎬＡＡꎬＣＣ)ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒ.Ｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙ(８０.８３％)ｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｐｉｇｓ(ＧＡꎬＧＡꎬＴＣ)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ(１９.１７％)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ｐｉｇｓｗｉｔｈｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＡＡꎬＴＴ)ａｔ２ＳＮＰｌｏｃｉ(ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３)ｏｆｅａｌｌｅｌｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬｗｈｉｌｅｔｈｏｓｅｗｉｔｈｗｉｌｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＧＧꎬＣＣ)ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒ.Ｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙ(８０.９９％)ｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｐｉｇｓ(ＧＡꎬＴＣ)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ(１９.０１％)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ｈａｐ￣ｌｏＶｉｅｗｈａｐｌｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｉｖｅＳＮＰｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｌｉｎｋｅｄꎬａｎｄｌｏｃａｔｅｄｉｎｏｎｅｈａｐｌｏｔｙｐｅｂｌｏｃｋ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｓｎｏｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｄｏｍｉｎａｎｔｏｖｅｒｂｒｏｗｎｉｓｈｒｅｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎＤｕｈｅｉｐｉｇｓꎬｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｆｉｖｅＳＮＰｓｏｆＭＣ１ＲｃｏｕｌｄｑｕｉｃｋｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｒｅｃｅｓｓｉｖｅｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒａｌｌｅｌｅｓａｎｄｆｉｘｔｈｅｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＤｕｈｅｉｐｉｇｓꎬａｎｄｆｉｎａｌｌｙａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｖａｒｉｅｔｉｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＤｕｈｅｉｐｉｇꎻＣｏａｔｃｏｌｏｒꎻＭＣ１ＲｇｅｎｅꎻＳＮＰꎻＧｅｎｏｔｙｐｅ㊀㊀毛色是猪的重要品种特征之一[１]ꎬ一直以来备受人们关注ꎮ在养猪生产中ꎬ毛色被广泛应用于评判品种的纯度㊁遗传稳定性㊁亲缘关系ꎬ以及在配套系培育中确定亲本的杂交组合类型等方面ꎮ揭示猪毛色的遗传机制及影响毛色的相关基因的遗传规律ꎬ对猪的育种具有重要意义[２－３]ꎮ毛色不同的品种或品系杂交时ꎬＦ１代呈现显性毛色ꎬＦ２代群体则会出现毛色分离[４]ꎬ选择毛色一致性强的种猪ꎬ淘汰毛色分离严重的个体ꎬ提高群体的整齐度ꎬ是新品种或配套系培育过程中的重要步骤[５]ꎮ哺乳动物毛色的形成是由一系列与黑色素细胞种类与形成有关的生理㊁生化反应的最终结果ꎬ遗传机制较复杂ꎮ猪的毛色大致分为野生型毛色㊁纯黑色㊁纯白色㊁棕红色㊁两头乌㊁花猪等ꎮ虽然属于质量性状ꎬ由少数几对基因决定ꎬ但由于基因之间有上位效应等遗传互作效应ꎬ调控毛色的基因及其作用机制尚未完全搞清楚ꎮ黑色素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因是调控哺乳动物毛色的一个关键基因[６－８]ꎮＭＣ１Ｒ是Ｇ蛋白偶联受体家族的一员ꎬ由Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ基因座编码ꎬ通过与其配体促进剂α－黑素细胞刺激激素(α－ＭＳＨ)或颉颃剂刺鼠蛋白(Ａｇｏｕｔｉ)的竞争性结合分别形成真黑素或褐黑素ꎬ从而影响猪毛色表型[９]ꎮＫｉｊａｓ等[１０－１１]在欧洲野猪㊁欧洲大黑猪㊁中国梅山猪㊁汉普夏猪㊁大白猪㊁皮特兰猪及杜洛克猪的ＭＣ１Ｒ基因部分序列中发现８个突变构成５种等位基因ꎬ其中Ｅ＋对应于野猪的灰毛色ꎬＥＤ１对应于欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑毛色ꎬＥＤ２对应于汉普夏猪的黑毛色ꎬＥｐ对应于皮特兰猪的黑色斑点及大白猪的白毛色ꎬｅ对应于杜洛克猪的棕红毛色ꎮＦａｎｇ等[１２]在３１头欧洲家猪和１９个亚洲品种家猪及１５头亚欧野猪的ＭＣ１Ｒ基因编码区内共发现１４个突变ꎬ其中包括Ｋｉｊａｓ等发现的８个突变ꎮ枣庄黑盖猪是山东省著名地方品种ꎬ毛色为３５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究纯黑色ꎬ具有肉质鲜嫩㊁产仔数多㊁抗病能力强㊁适应性强等优良特征ꎬ但其生长缓慢ꎬ产肉性能和胴体瘦肉率低[１３－１４]ꎮ利用杜洛克对枣庄黑盖猪进行杂交改良ꎬ瘦肉率㊁肉质性能及胴体性能均明显提高ꎬ为枣庄黑盖猪杂交改良的优良杂交组合之一ꎮ我国多数黑猪毛色黑色对棕红色呈显性遗传ꎬ杜洛克猪与枣庄黑盖猪(以下简称杜黑猪)Ｆ１杂交后代的毛色全部为全黑色ꎬＦ２代群体出现了毛色分离ꎮ常规育种对猪毛色的选育是横交固定后ꎬ通过持续的世代选育逐渐剔除后代中毛色出现分离的个体ꎬ周期长㊁效率低ꎬ严重影响和制约了专门化品系选育和新品种(配套系)育种进程ꎮ本研究以杜黑猪Ｆ２杂交群体和枣庄纯种黑盖猪为研究对象ꎬ对Ｆ２群体进行毛色表型类型分组ꎬ利用液相芯片捕获测序技术[１５]鉴定ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ的基因型ꎬ研究不同基因型与毛色表型的关系ꎬ筛选可用于毛色分子标记辅助育种的ＳＮＰ位点ꎬ为快速建立毛色稳定的杜黑猪新品种培育体系奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验动物及毛色表型收集试验动物包括３９０头杜黑猪Ｆ２杂交后代和１８头枣庄纯种黑盖猪ꎬ均来自枣庄黑盖猪养殖有限公司ꎮ将毛色分为全黑色(枣庄黑盖猪毛色)㊁棕红色(杜洛克毛色)㊁黑红条纹㊁棕色偏黄色㊁棕色偏白色等类型ꎬ对Ｆ２代群体打耳号时记录每头试验猪的毛色ꎬ按毛色表型类型进行分组ꎬ统计每组毛色的个体数ꎮ１.２㊀基因组提取及ＳＮＰ基因型检测采集试验猪耳组织放入装有７５％乙醇的离心管中ꎬ－２０ħ冰箱存储ꎮ利用血液/组织/细胞提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取耳组织基因组ＤＮＡꎮ经Ｎａｎｏｄｒｏｐ(２６０/２８０在１.７~２.１范围之间ꎬ浓度>５０ｎｇ/mＬ)和０.８％琼脂糖凝胶电泳(条带清晰)检测合格后ꎬ委托博瑞迪生物技术有限公司利用定制的液相芯片进行基因组ＳＮＰ测定ꎮ该液相芯片为山东省农业科学院畜牧兽医研究所猪繁育饲养团队集成了近年来候选基因㊁功能基因组研究方面公开发表的功能ＳＮＰ㊁Ｄｅｌ㊁Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ等标记ꎬ采用博瑞迪ＧＢＴＳ技术体系中的ＧｅｎｏＢａｉｔｓ技术[１５]设计并优化开发的一款中低密度(６Ｋ)猪功能标记液相芯片ꎬ其中ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ位点信息参考Ｆａｎｇ等[１２]ꎬ详见表１ꎮ㊀㊀表１㊀ＭＣ１Ｒ基因１０个ＳＮＰｓ位点信息突变名称突变ＩＤ基因组位置密码子碱基变化氨基酸变化突变类型Ｘ３０１ｒｓ３３７７６４７２３６＿１８１２８５３０１ＧңＡＴｙｒңＴｙｒ同义突变Ｘ２４３ｒｓ３２１４３２３３３６＿１８１４６１２４３ＣңＴＡｌａңＴｈｒ错义突变Ｘ１６６ｒｓ７８６４４１６７３６＿１８１６９２１６６ＧңＡＡｒｇңＴｒｐ错义突变Ｘ１６４ｒｓ４５４３５０３２６＿１８１６９７１６４ＧңＡＡｌａңＶａｌ错义突变Ｘ１２４ｒｓ３２６９２１５９３６＿１８１８１８１２４ＣңＴＡｓｐңＡｓｎ错义突变Ｘ１２２ｒｓ７０５２２２４３３６＿１８１８２４１２２ＣңＴＶａｌңＩｌｅ错义突变Ｘ１２１ｒｓ４５４３５０３１６＿１８１８２５１２１ＡңＧＡｓｎңＡｓｎ同义突变Ｘ１１７ｒｓ６９１７２９８０９６＿１８１８３７１１７ＣңＴＧｌｎңＧｌｎ同义突变Ｘ１０２ｒｓ４５４３４６３０６＿１８１８８３１０２ＡңＧＬｅｕңＰｒｏ错义突变Ｘ９５ｒｓ４５４３４６２９６＿１８１９０５９５ＣңＴＶａｌңＭｅｔ错义突变１.３㊀数据处理与分析利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ软件对杜黑猪毛色表型类型进行统计分析ꎮ利用ＰＬＩＮＫｖ１.９０软件[１６]从液相芯片数据中调取出ＭＣ１Ｒ基因１０个ＳＮＰ的基因型数据ꎬ并计算基因型频率㊁基因频率和哈代温伯格平衡显著性ꎮ使用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１软件[１７]对ＳＮＰ进行单倍型分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀杜黑猪Ｆ２代群体毛色表型分析杜黑猪Ｆ２代个体出现了毛色的分离ꎮ其中ꎬ与母本(枣庄黑盖猪)全黑色毛色一致的个体最４５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀多(２９３头)ꎬ占总数的７５.１３％ꎻ呈现父本(杜洛克)棕红色毛色的５１头ꎬ占总数的１３.０８％ꎻ其余４６头(１１.７９％)毛色呈现混杂颜色ꎬ其中５头呈黑红条纹ꎬ另外４１头毛色既不是黑色也不是棕红色ꎬ而是呈棕色偏黄(２４头)或棕色偏白(１７头)ꎮ２.２㊀杜黑猪Ｆ２代ＭＣ１Ｒ基因ＳＮＰ基因型和等位基因频率分析本研究测定的ＭＣ１Ｒ的１０个ＳＮＰ中ꎬ５个ＳＮＰ(ｒｓ３３７７６４７２３㊁ｒｓ７８６４４１６７３㊁ｒｓ３２６９２１５９３㊁ｒｓ７０５２２２４３３㊁ｒｓ６９１７２９８０９)在杜黑Ｆ２代群体中只有一种基因型ꎬ为单态ＳＮＰꎮ另外５个多态ＳＮＰ的基因型和等位基因信息详见表２ꎮ可以看出ꎬ５个多态ＳＮＰ的等位基因频率均在０.５左右ꎬ处于哈代温伯格平衡状态(Ｐ>０.０５)ꎬ这与试验猪为未经毛色选择的Ｆ２代群体有关ꎮ另外ꎬ５个多态ＳＮＰ不同基因型的个体数基本一致ꎬ推测可能存在紧密连锁ꎮ利用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１进一步分析了５个多态ＳＮＰ单倍型ꎬ定义了１个单倍型块(图２)ꎮ单倍型块中各个方块的颜色由浅至深ꎬ表示变异位点连锁程度由低到高ꎬ深红色表示完全连锁ꎮ结果显示ꎬ组成５个ＳＮＰ的各个方块均为深红色ꎬ表示它们紧密连锁在一起ꎮ单倍型ＣＧＧＧＴ的频率为０.５２６ꎬ含有该单倍型的个体全部为黑色毛色ꎬ单倍型ＴＡＡＡＣ的频率为０.４６９ꎬ含有该单倍型的个体全部为棕红色毛色ꎮ图１㊀杜黑猪Ｆ２代群体毛色统计㊀㊀表２㊀杜黑猪ＭＣ１Ｒ基因多态ＳＮＰ位点等位基因和基因型信息突变名称突变ＩＤ基因型个体数㊁频率等位基因频率哈代温伯格平衡Ｐ值Ｘ２４３ｒｓ３２１４３２３３３ＣＣＴＣＴＴＣＴ９５(０.２４３６)２０８(０.５３３３)８７(０.２２３１)０.５１０３０.４８９７０.２２８３Ｘ１６４ｒｓ４５４３５０３２ＡＡＡＧＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０７(０.５３０８)９６(０.２４６２)０.４８８５０.５１１５０.２６８７Ｘ１２１ｒｓ４５４３５０３１ＡＡＧＡＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０６(０.５２８２)９７(０.２４８７)０.４８７２０.５１２８０.３１３６Ｘ１０２ｒｓ４５４３４６３０ＡＡＧＡＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０８(０.５３３３)９５(０.２４３６)０.４８９７０.５１０３０.２２８３Ｘ９５ｒｓ４５４３４６２９ＣＣＴＣＴＴＣＴ８７(０.２２３１)２０９(０.５３５９)９４(０.２４１)０.４９１００.５０９００.１９２４图２㊀ＭＣ１Ｒ基因５个多态ＳＮＰ位点单倍型块２.３㊀毛色与基因型关系分析按照Ｋｉｊａｓ等[１０]的划分标准ꎬ本研究中的５个多态ＳＮＰ位点可以划分为ＥＤ１和ｅ等位基因ꎬ其中ＥＤ１等位基因包含ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０㊁ｒｓ４５４３４６２９３个位点ꎬｅ等位基因包含ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３２个位点ꎮＥＤ１等位基因ＳＮＰ位点中ꎬ突变纯合基因型(ＧＧ㊁ＧＧ㊁ＴＴ型)的Ｆ２代杜黑猪全部为黑色毛色ꎬ野生纯合基因型(ＡＡ㊁ＡＡ㊁ＣＣ)为棕红色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ㊁ＴＣ)个体中大部分(８０.８３％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.１７％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白(表３)ꎮｅ等位基因ＳＮＰ位点中ꎬ突变纯合基因型(ＡＡ㊁ＴＴ)个体全部为棕红毛色ꎬ野生纯合基因型(ＧＧ㊁ＣＣ)个体全部为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＴＣꎬＡＡ㊁ＴＣꎬＧＡ㊁ＴＴ)大部分个体５５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究(８０.９９％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.０１％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白(表３)ꎮ５个多态ＳＮＰ位点在枣庄黑盖猪群体内均只有２种基因型ꎮＥＤ１等位基因有突变纯合基因型和杂合基因型ꎬ频率分别为８３.３３％和１６.６７％ꎻｅ等位基因有野生纯合基因型和杂合基因型ꎬ频率分别为８３.３３％和１６.６７％(表４)ꎮ㊀㊀表３㊀杜黑猪Ｆ２代毛色与ＳＮＰ基因型关系毛色ｒｓ３２１４３２３３３基因型个体数ｒｓ４５４３５０３２基因型个体数ｒｓ４５４３５０３１基因型个体数ｒｓ４５４３４６３０基因型个体数ｒｓ４５４３４６２９基因型个体数黑色ＣＣ９５ＧＧ９６ＧＧ９７ＧＧ９５ＴＴ９４黑色ＴＣ１９６ＧＡ１９５ＧＡ１９４ＧＡ１９６ＴＣ１９７黑红条纹ＴＣ５ＧＡ５ＧＡ５ＧＡ５ＴＣ５棕红色ＴＴ５３ＡＡ５３ＡＡ５３ＡＡ５３ＣＣ５３棕色偏黄ＴＣ２２ＡＡ２２ＧＡ２２ＧＡ２２ＴＣ２２棕色偏黄ＴＴ２ＧＡ２ＧＡ２ＧＡ２ＴＣ２棕色偏白ＴＣ１２ＡＡ１２ＧＡ１２ＧＡ１２ＴＣ１２棕色偏白ＴＴ５ＧＡ５ＧＡ５ＧＡ５ＴＣ５㊀㊀表４㊀枣庄黑盖猪毛色与ＳＮＰ基因型关系毛色ｒｓ３２１４３２３３３基因型个体数ｒｓ４５４３５０３２基因型个体数ｒｓ４５４３５０３１基因型个体数ｒｓ４５４３４６３０基因型个体数ｒｓ４５４３４６２９基因型个体数黑色ＣＣ１２ＧＧ１２ＧＧ１２ＧＧ１２ＴＴ１２黑色ＴＣ６ＧＡ６ＧＡ６ＧＡ６ＴＣ６等位基因频率/％Ｃ８３.３３Ｇ８３.３３Ｇ８３.３３Ｇ８３.３３Ｔ８３.３３Ｔ１６.６７Ａ１６.６７Ａ１６.６７Ａ１６.６７Ｃ１６.６７３㊀讨论与结论我国绝大多数地方猪种毛色均为黑色ꎬ而我国消费者对黑猪肉具有一种与生俱来的青睐感ꎮ市场需求决定育种目标ꎬ因此ꎬ利用国内外两类基因资源ꎬ培育优质高效㊁适应不同市场需求的专门化品系并配套生产黑色优质风味猪成为猪育种领域的主攻目标ꎮ然而ꎬ很多黑毛色的专门化品系选育和新品种(配套系)培育过程中后代会出现明显毛色分离ꎬ从而影响产品经济价值ꎮ研究毛色关键基因的突变位点与毛色类型的关系ꎬ寻找目标毛色的分子标记ꎬ可利用分子标记辅助育种快速建立育种目标毛色类型种群ꎮＭＣ１Ｒ基因位于Ｅ座位ꎬ定位在猪第６号染色体短壁的末端[１８]ꎮＫｉｊａｓ等[１０]研究认为ＥＤ１等位基因ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０和ｒｓ４５４３４６２９对应于欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑毛色ꎬ其中ꎬｒｓ４５４３５０３１为同义突变ꎬｒｓ４５４３４６３０和ｒｓ４５４３４６２９是错义突变ꎬ使所编码的氨基酸Ｌｅｕ和Ｖａｌ突变为Ｐｒｏ和Ｍｅｔꎮ本研究中枣庄黑盖猪毛色为黑色ꎬ大部分个体(８３.３３％)为ＥＤ１等位基因突变基因型(ＧＧ㊁ＧＧ和ＴＴ)ꎬ与邓素华[１９]㊁师科荣[２０]等的研究结果相一致ꎬ表明我国地方猪种的黑毛色可能主要由显性黑等位基因ＥＤ１调控ꎮ杜黑猪群体中ꎬＥＤ１等位基因突变基因型个体全部表现为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ和ＴＣ)个体中大部分(８０.８３％)表现为黑色毛色ꎬ其他表现为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎬ表明黑色对棕红色为不完全显性ꎬ与张建[２１]㊁曾检华[２２]等的报道一致ꎮｒｓ４５４３５０３２和ｒｓ３２１４３２３３３２个ＳＮＰ位点皆为错义突变ꎬ使Ａｌａ分别突变为Ｔｈｒ和Ｖａｌꎬ对应于Ｋｉｊａｓ等[１０]研究中的等位基因ｅꎬ其突变纯合基因型(ＡＡ和ＴＴ)决定了杜洛克猪的棕红毛色ꎮ本研究中ꎬ因为没有采集杜黑杂交猪的父本杜洛克样本ꎬ故没有检测杜洛克的ＭＣ１Ｒ基因ＳＮＰ基因型ꎮ但杜黑猪Ｆ２中棕红色猪全部为突变纯合基因型ꎬ与Ｋｉｊａｓ等[１０]报道的等位基因ｅ突变纯合基因型影响棕红色毛色的结论一致ꎮ６５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ＭＣ１Ｒ基因中ＥＤ１和ｅ等位基因的５个多态ＳＮＰ位于４４４ｂｐ的序列上ꎬ在分析杜黑猪Ｆ２个体时发现呈现相似的基因频率ꎬ推测可能存在紧密连锁ꎮ利用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１进行５个ＳＮＰ单倍型分析ꎬ结果显示５个ＳＮＰ定义了１个高度连锁的单倍型块ꎮ单倍型ＣＧＧＧＴ的频率为０.５２６ꎬ含有该单倍型的个体全部为黑色毛色ꎬ单倍型ＴＡ￣ＡＡＣ的频率为０.４６９ꎬ含有该单倍型的个体全部为棕红色毛色ꎮ该结果提示在杜黑猪新品种选育中ꎬ对ＭＣ１Ｒ基因的５个ＳＮＰ位点进行毛色分子标记辅助选择ꎬ有助于快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ使杜黑猪新品种的毛色迅速固定为全黑色ꎮ综上ꎬ本研究分析了ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪Ｆ２群体毛色的关系ꎬ揭示了杜黑猪毛色中黑色对棕红色为不完全显性ꎬ利用ＭＣ１Ｒ基因的５个多态ＳＮＰ标记进行分子标记辅助选择可快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ为杜黑猪新品种培育中黑色毛色固定奠定基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志[Ｍ].北京:中国农业出版社ꎬ２０１１.[２]㊀ＬüＭＤꎬＨａｎＸＭꎬＭａＹＦꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔ￣ｅｄｗｉｔｈｓｉｘ￣ｗｈｉｔｅ￣ｐｏｉｎｔｃｏａｔｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＤｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ￣ｅａｒｐｉｇｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２７５３４. [３]㊀ＬｉｕＲꎬＪｉｎＬꎬＬｏｎｇＫＲꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ１(ＭＣ１Ｒ)ｇｅｎｅｉｎＴｉｂｅｔａｎｐｉｇｓａｎｄＬａｎｄｒａｃｅｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０１６ꎬ５７５(２):５３７－５４２.[４]㊀ＡｎｄｅｒｓｓｏｎＬ.Ｔｈｅｕｓｅｏｆａｗｉｌｄｐｉｇˑｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓｔｏｍａｐｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｔｒａｉｔｌｏｃｉ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｒｅｄｉｔｙꎬ１９９７ꎬ８８(５):３８０－３８３.[５]㊀李玉莲ꎬ吴买生ꎬ夏敏ꎬ等.湘沙猪配套系毛色遗传研究[Ｊ].养猪ꎬ２０２１(４):７０－７２.[６]㊀ＺｈｏｎｇＨＷꎬＺｈａｎｇＪꎬＴａｎＣꎬｅｔａｌ.Ｐｉｇｃｏａｔｃｏｌｏｒｍａｎｉｐｕｌａ￣ｔｉｏｎｂｙＭＣ１Ｒｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２２ꎬ２３(１８):１０３５６.[７]㊀ＪｉＲＬꎬＴａｏＹＸ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｐｉｇ￣ｍｅｎｔａｔｉｏｎ:ｉｎｓｉｇｈｔｓｆｒｏｍｌａｒｇｅａｎｉｍａｌｓ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＭｏｌｅｃｕ￣ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１８９(１):１７９－２１３.[８]㊀ＦａｎＹＫꎬＷｕＸＷꎬＬｉＹＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎｔｈｅ５ᶄ￣ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＭＣ１ＲｏｎｆｅａｔｈｅｒｃｏｌｏｒｉｎＴａｉｈａｎｇｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１０１(１２):１０２１９２. [９]㊀Ｇａｒｃíａ￣ＢｏｒｒóｎＪＣꎬＳáｎｃｈｅｚ￣ＬａｏｒｄｅｎＢＬꎬＪｉｍéｎｅｚ￣ＣｅｒｖａｎｔｅｓＣ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ￣１ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００５ꎬ１８(６):３９３－４１０. [１０]ＫｉｊａｓＪＭＨꎬＷａｌｅｓＲꎬＴöｒｎｓｔｅｎＡꎬｅｔａｌ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒ１(ＭＣ１Ｒ)ｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ１９９８ꎬ１５０(３):１１７７－１１８５.[１１]ＫｉｊａｓＪＭＨꎬＭｏｌｌｅｒＭꎬＰｌａｓｔｏｗＧꎬｅｔａｌ.Ａｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａ￣ｔｉｏｎｉｎＭＣ１Ｒａｎｄａｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｓｏｍａｔｉｃｒｅｖｅｒｓｉｏｎｓｃａｕｓｅｂｌａｃｋｓｐｏｔｔｉｎｇｉｎｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００１ꎬ１５８(２):７７９－７８５.[１２]ＦａｎｇＭＹꎬＬａｒｓｏｎＧꎬＲｉｂｅｉｒｏＨＳꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｍｏｄｅｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｔａｃｏａｔｃｏｌｏｒｌｏｃｕｓｉｎｗｉｌｄａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００９ꎬ５(１):ｅ１０００３４１.[１３]王彦平ꎬ林松ꎬ呼红梅ꎬ等.枣庄黑盖猪生长和胴体品质性能测定的初步研究[Ｊ].猪业科学ꎬ２０１９ꎬ３６(５):１３０－１３１. [１４]王继英ꎬ王彦平ꎬ林松ꎬ等.屠宰体重对枣庄黑盖猪胴体及肉质的影响[Ｊ].猪业科学ꎬ２０２０ꎬ３７(９):１３０－１３２. [１５]徐云碧ꎬ杨泉女ꎬ郑洪建ꎬ等.靶向测序基因型检测(ＧＢＴＳ)技术及其应用[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２０ꎬ５３(１５):２９８３－３００４.[１６]ＰｕｒｃｅｌｌＳꎬＮｅａｌｅＢꎬＴｏｄｄ－ＢｒｏｗｎＫꎬｅｔａｌ.ＰＬＩＮＫ:ａｔｏｏｌｓｅｔｆｏｒｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｌｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００７ꎬ８１(３):５５９－５７５.[１７]ＢａｒｒｅｔｔＪＣꎬＦｒｙＢꎬＭａｌｌｅｒＪꎬｅｔａｌ.Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ:ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｖｉ￣ｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬＤａｎｄｈａｐｌｏｔｙｐｅｍａｐｓ[Ｊ].Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００５ꎬ２１(２):２６３－２６５.[１８]ＭａｒｉａｎｉＰꎬＭｏｌｌｅｒＭＪꎬＨøｙｈｅｉｍＢꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｃｏａｔｃｏｌｏｒｌｏｃｕｓａｎｄｔｈｅｌｏｃｉｆｏｒｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐＯａｎｄｔｙｒｏｓｉｎｅａｍｉｎ￣ｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｒｅｏｎｐｉｇｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ６[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅ￣ｒｅｄｉｔｙꎬ１９９６ꎬ８７(４):２７２－２７６.[１９]邓素华ꎬ高军ꎬ任军ꎬ等.猪黑素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因与毛色表型的研究[Ｊ].遗传学报ꎬ２００３ꎬ３０(１０):９４９－９５４.[２０]师科荣ꎬ王爱国ꎬ李宁ꎬ等.中国地方猪种黑素皮质激素受体１基因(ＭＣ１Ｒ)的单核苷酸多态性[Ｊ].中国科学(Ｃ辑:生命科学)ꎬ２００４ꎬ３４(２):１４４－１４９.[２１]张建ꎬ陈伟ꎬ王慧ꎬ等.猪毛色遗传机制的研究进展[Ｊ].猪业科学ꎬ２０１３ꎬ３０(１):１００－１０３.[２２]曾检华ꎬ罗艳凤ꎬ胡杰ꎬ等.不同黑猪杂交组合生产性能研究与分析[Ｊ].养猪ꎬ２０１５(１):６１－６４.７５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究。
山东省农业农村厅关于公布山东省农牧渔业丰收奖获奖项目的通知
山东省农业农村厅关于公布山东省农牧渔业丰收奖获
奖项目的通知
文章属性
•【制定机关】山东省农业农村厅
•【公布日期】2021.06.04
•【字号】鲁农科教字〔2021〕12号
•【施行日期】2021.06.04
•【效力等级】地方规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】农业科技
正文
山东省农业农村厅关于公布山东省农牧渔业丰收奖获奖项目
的通知
各市农业农村局，有关高校、科研院所，厅属有关单位：
根据《山东省农牧渔业丰收奖奖励办法》，经专家评审和公示，共有55个项目获2021年山东省农牧渔业丰收奖，其中，农业技术推广成果奖52项，农业技术推广合作奖3项（详见附件）。
现予公布。
附件：山东省农牧渔业丰收奖获奖项目名单
山东省农业农村厅
2021年6月4日。
青岛海洋科技成果转化典型案例
青岛海洋科技成果转化典型案例
青岛海洋科技成果转化典型案例包括多个领域，以下为您列举其中两个：
1. 金刚石薄膜电极式海洋盐度传感器项目：由山东省科学院海洋仪器仪表研究所牵头，联合山东山科创新股权投资有限公司成立青岛浦泽海洋科技有限公司，推动项目落地转化。
该科研单位及项目团队以知识产权和自有资金持股75%，资方出资1000万元，持股25%。
该相关成果已在国内10家机构得到应用，累计实现经济效益3000余万元，间接经济效益超亿元。
2. 海洋渔业领域：青岛在海洋渔业领域也取得了多项成果，包括刺参“参优1号”育繁推技术体系建设及产业化示范、高质牡蛎“海蛎1号”新品种培育及产业化，以及石斑鱼速生抗逆新种质创制及产业化应用项目等。
这些成果不仅提升了青岛的海洋渔业水平，也为相关产业的发展提供了有力支持。
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2017山东海洋与渔业科学技术奖
2017山东海洋与渔业科学技术奖2017年度山东省海洋与渔业科学技术奖（海洋科技奖、渔业科技奖）拟获奖项目名单序号项目名称项目完成单位完成人一等奖1节能环保型循环水养殖技术研发与示范中国水产科学研究院黄海水产研究所，海阳市黄海水产有限公司，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，中国科学院海洋研究所，中国海洋大学1.曲克明2.刘寿堂3.朱建新4.张宇雷5.崔正国6.尤锋7.刘鹰8.宋协法9.刘晃10.李勇2 克氏原螯虾产业技术研究与试验示范山东省淡水渔业研究院，济宁市水产技术推广站，东平县第一淡水养殖试验场1.朱永安2.孟庆磊3.陈奇5.王兰明6.李娴7.张龙岗8.朱树人9.董俊10.付佩胜11.刘峰12.张广月13.杨玲14.张志山3 斑点鳟健康养殖关键技术研究与应用山东省海洋生物研究院 1.菅玉霞 2.王雪 3.胡发文4.李莉5.刘元文6.潘雷7.高凤祥8.房慧4 水产品中激素及标识残留物测定技术研究及应用山东省海洋资源与环境研究院 1.徐英江2.田秀慧3.张秀珍4.宫向红5.任传博6.黄会7.任利华8.刘小静9.刘慧慧10.薛敬林11.韩典峰12.张华威二等奖1 新型铜合金网衣网围研发与应用示范威海正明海洋科技开发有限公司、荣成市斥山金海渔网绳有限公司、荣成市泓泰渔业有限公司、威海正通海洋科技有限1.姜泽明2.石建高3.常忠岳4.李连森5.田金玲6.刘阳7.刘瑶8.王刚9.张志新10.徐玉珊11.韩淑丽12.王德强2 中华鳖高效生态饲料和生态养殖新模式的开发与应用山东省淡水渔业研究院 1.宋理平 2.冒树泉 3.胡斌4.秦玉广5.吴君6.许鹏7.马国红8.张延华9.王秉利10.王爱英11.卢红12.张媛媛3 黄河三角洲南美白对虾高位水池养殖滨州市海洋与渔业研究所、滨州市渔业技术推广站、山东省1.王玉清2.郑述河3.孙同秋4.张凯5.王淑生6.王冲技术研究与示范友发水产有限公司7.付壤辉8.冯晓9.张新峰4 黄河三角洲刺参池塘稳产关键技术开发与应用山东省海洋资源与环境研究院、山东华春渔业有限公司1.刘相全2.韦秀梅3.冯艳微4.刘义豪5.姜绪6.李斌7.王忠全8.周全利9.刘兆存5 黄海鳕人工繁育与苗种规模化生产技术集成应用山东省海洋生物研究院 1.于道德2.刘洪军3.官曙光4.刘莹5.于超勇6.宋静静7.赵文溪8.李绍彬6 泥鳅苗种繁育及健康养殖技术研究及示范东营市一邦农业科技开发有限公司、东营市农业科学研究院1.范庆明2.袁玲3.王明珍4.薄学峰5.王树海7.杨国岭8.刘金明9.刘菁10.李丽霞11.张茂林12.董晓亮7 黄河入海口滨海湿地生态安全评价与调控技术研究山东省淡水渔业研究院，东营市海洋经济发展研究院1.李秀启2.朱永安3.董贯仓4.刘峰5.陈有光6.张婧一7.高云芳8.冷春梅9.师吉华10.张士华11.朱士祥12.王亚楠8 南四湖渔业资源环境调查与渔业生态修复技术研究济宁市渔业监测站 1.孟娟 2.吴广州 3.蒋帮铜4.张丽娜5.马迎丽6.时彦民7.时兵8.邓晨曦9.魏勋10.孟丽华11.史艳伟12.刘方三等奖1 长蛸规模化繁育与增养殖关键技术集中国海洋大学、烟台市水产研究所、马山集团有限公司1.郑小东2.刘永胜3.王培亮4.王晓东5.陈相堂6.李琪7.刘兆胜8.王鹤2 东平湖鲤种质资源发掘与良种选育山东省淡水渔业研究院，山东大学，山东农业大学1.杨玲2.季相山3.张燕君4.孟庆磊5.赵丽娟6.张婧一7.付佩胜8.张龙岗3 黄河口刺参规模化苗种繁育及池塘生态健康养殖技术研究与集成应用东营海跃水产科技有限公司、东营市黄河口海参产业技术研究院1.薄学锋2.刘金明4.王树海5.张琦6.赵磊7.董晓亮8.刘俊龙 9.李帅帅4 刺参多样性blup复合育种山东安源水产股份有限公司 1.王亮 2.谭杰 3.邹士方4.刘永旗5.刘蓬6.胡丽萍7.孙晓杰8.燕敬平5 鲟鱼良种人工繁育临沂市淡水水产研究所1.孙自军2.孙宝超3.房洁4.刘胜江 5.郭从霞6.葛世成及产业化开发7.张庆杰6 红白锦鲤人工繁育与养殖技术研究济南市淡水养殖科学研究所 1.李翠云 2.娄彝春 3.张波4.杨波5马嵩 6.陈晓7.臧涛7 东平湖黄河鲤选育与推广泰安市水产研究所 1.邹兰柱2.鹿海锋 3.李宝国4.朱宁东5.李剑6.王光友7.赵峰8 海草场修复与构建技术开发与示范山东东方海洋科技股份有限1.江鑫2.潘金华3.李晓捷4.韩厚伟5.彭捷6.崔翠菊7.于深辉 8.王伟伟9 山东省虾蟹类营养与饲料研究山东省淡水渔业研究院 1.曹振杰 2.胡斌 3.李娴4.姜燕5.董俊6.徐海强7.轩子群 8.杨凤香10 沿海大型工程海洋灾害风险排查潍坊滨海旅游度假区防潮堤试点项目山东省海洋工程咨询协会、国家海洋局北海预报中心、中国海洋大学1.贺志鹏2.毕永坤3.刘清容4.赵玲5.蔡伟伟6.张伟11 除藻剂对养殖产业安全性影响评价及烟台市水产研究所、山东省海洋资源与环境研究院、烟台海益苗业有限公司1.孙灵毅2.刘丽娟3.陈相堂4.王田田5.姜向阳6.赵强7.任利华8.王玮云12 山东省浅海底栖渔业资源开发战略研究山东省海洋生物研究院 1.宋爱环 2.邹琰 3.王英俊4.高翔5.刘广斌6.刘童7.李翘楚8.辛美丽13 滨州贝壳堤岛与湿地系统自然保护区生物多样性研究滨州市海洋环境监测站 1.任贵如2.宋瑞强 3.刘鸿艳4.崔达铭5.冯晓6.苏兆军7.刘帅 8.许建方14 鱼的致病性嗜水气单胞菌分离鉴定及浒苔多糖对分离菌株抑制作用的研究山东省潍坊市海洋环境监测中心站、山东畜牧兽医职业学院1.赵迎东2.孙秋艳3.韩伟涛4.吴倩倩15 海参加工副产物的高效利用及功能产品开发山东省海洋资源与环境研究院1.张健2.孙永军3.赵云苹4.鞠文明5.刘京熙6.乔瑞光7.王共明 8.井月欣16 引进“黄选一号”威海市文登区水产技术推广1.王世党2.王海涛 3.郑春波4.王浩5.于夕有梭子蟹池塘生态养殖技术研究与应用站17 黄河三角洲刺参苗种培育关键技术研究与示范山东通和水产有限公司、东营市河口区渔业技术推广站、东营市河口区海洋与水产研究所1.王树海2.许家磊3.常婧4.常越峰5.单宝凯6.于浩平7.孟卫芳 8.宋伟18 吉富罗非鱼引进及海水养殖实验研究与应用滨州市海洋与渔业研究所 1.王冲 2.孙同秋3.王玉清4.张凯5.孙清秀6.尹琳7.李永明8.曾海祥19 渔业水质中同时检测多西环素、四环素、土霉素、金霉素残留量的方法研究及应用济宁市渔业监测站 1.史艳伟2.纪杰善 3.孟丽华4.蒋帮铜5.刘方6.孟娟7.邓晨曦8.吴广州20 大鲵仿生态养殖模式技术构建及人工繁殖技术研究山东省淡水渔业研究院 1.田功太 2.陈晓 3.张金路4.张明磊5.刘飞6.张波7.董俊 8.许国晶。
创伤弧菌溶血素基因vvhA质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１４７~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２０收稿日期:２０２３－０４－０７基金项目:国家重点研发计划 食品安全关键技术研发 重点专项(２０１７ＹＦＣ１６０１４００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００２２)ꎻ泰山学者工程专项经费资助(ｔｓｑｎ２０１９０９１６８)ꎻ山东省自然科学基金青年基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ２２６)ꎻ济南市 新高校２０条 项目(２０２２２８０６２)ꎻ山东省农业科学院国际科技合作专项(ＣＸＧＣ２０２２Ｆ０９)作者简介:袁玮(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物检测技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:７９４３９３６１７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:陈相艳(１９７３ )ꎬ女ꎬ研究员ꎬ研究方向为食源性病原微生物检测及标准物质研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:３１５４７８８４５＠ｑｑ.ｃｏｍ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮１ꎬ２ꎬ陈蕾蕾１ꎬ２ꎬ杨金玉１ꎬ周庆新１ꎬ２ꎬ裘纪莹１ꎬ赵双枝１ꎬ付恩君１ꎬ赵国琰２ꎬ陈相艳１(１.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东师范大学生命科学学院ꎬ山东济南㊀２５００１４)㊀㊀摘要:针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状ꎬ本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作ꎮ首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ的重组质粒ꎬ经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉ꎬ然后对其进行ＰＣＲ定性检测及紫外分光光度计法定量分析ꎮ均匀性检验结果表明ꎬ样品间无显著差异ꎬ均匀性良好ꎬ符合预期目标ꎻ短期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在４ħ㊁３７ħ条件下稳定保存１４天ꎻ长期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ研究结果表明ꎬ创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求ꎬ为创伤弧菌的快速㊁高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质ꎮ将标准样品应用于鱼类㊁贝类等１０份海鲜类食品样品的检测中ꎬ经传统培养法验证ꎬ检测结果准确无误ꎮ本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力ꎬ为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础ꎮ关键词:创伤弧菌ꎻ质粒定性标准样品ꎻ水产品ꎻ检测中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１４７－０９ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｅｒｔｉｆｉｅｄＰｌａｓｍｉｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｆｏｒＨｅｍｏｌｙｓｉｎＧｅｎｅｖｖｈＡｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓａｎｄＩｔ ｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＡｑｕａｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＹｕａｎＷｅｉ１ꎬ２ꎬＣｈｅｎＬｅｉｌｅｉ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＪｉｎｙｕ１ꎬＺｈｏｕＱｉｎｇｘｉｎ１ꎬ２ꎬＱｉｕＪｉｙｉｎｇ１ꎬＺｈａｏＳｈｕａｎｇｚｈｉ１ꎬＦｕＥｎｊｕｎ１ꎬＺｈａｏＧｕｏｙａｎ２ꎬＣｈｅｎＸｉａｎｇｙａｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄ＆ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｖｅｌＦｏｏｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎＣｈｉｎａꎬａｒｅａｄｙ￣ｔｏ￣ｕｓｅｃｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｉｎ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｒｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｏｗｄｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｅｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ.Ｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｗａｓａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｅ￣ｐａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｓｔａｂｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓａｔ４ħｏｒ３７ħꎬａｎｄｆｏｒａｔｌｅａｓｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ－２０ħ.ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ.Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｓｅａｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈ.ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅａｃｃｕｒａｔｅｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ.ＡｂｏｖｅａｌｌꎬｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓꎻＣｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＡｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓꎻＤｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀创伤弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是一种革兰氏阴性菌ꎬ主要特性为嗜盐㊁喜温ꎬ自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２]ꎬ是一种人畜共患病原菌ꎬ容易感染鱼㊁虾㊁牡蛎㊁蛤㊁螃蟹等海产品ꎬ人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品㊁破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３]ꎮ创伤弧菌与霍乱弧菌㊁副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４]ꎬ弧菌感染病例具有明显的季节性ꎬ大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５]ꎮ随着全球气候变暖㊁海洋温度升高等自然条件的变化ꎬ创伤弧菌的感染率也逐年增加ꎮ在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％ꎬ在美国约为３３％ꎬ使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７]ꎮ创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎㊁原发创伤性感染㊁败血症和坏死性筋膜炎等ꎬ免疫力低下或患有糖尿病㊁肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８]ꎮ创伤弧菌伤口感染通常以肿胀㊁红斑和剧烈疼痛为特征ꎬ潜伏期短ꎬ发病迅速ꎬ病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡ꎬ最终引起多脏器衰竭[９]ꎮ创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病ꎮ创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素㊁铁载体㊁金属蛋白酶㊁荚膜多糖等[１０]ꎬ由ｖｖｈＡ基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素ꎬ具有创伤弧菌种属特异性ꎬ可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１]ꎮ当前ꎬ对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数㊁ＭＰＮ法等传统培养法ꎬ这些方法需要进行过夜培养㊁选择性平板分离㊁生化鉴定㊁血清学检测等繁琐的试验步骤ꎬ不仅耗时费力ꎬ同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响ꎮ另外ꎬ由于水产品中的创伤弧菌通常处于 活的且不可培养 的状态[１２－１３]ꎬ传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定ꎬ严重降低了检测结果的准确度ꎮ作为最危险的食源性细菌之一ꎬ创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡ꎬ已成为一个主要的食品安全问题[１４]ꎮ随着食品供应链的全球化ꎬ创伤弧菌的定期监测变得更加重要ꎮ为了满足当下快速㊁高通量检测的需求ꎬ分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用ꎬ但相关的参考物质相对匮乏ꎮ食源性微生物检测即用型标准样品的研制ꎬ有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题ꎬ使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用ꎬ从而摆脱对国外标准样品的依赖ꎮ因此ꎬ建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速㊁高通量鉴定ꎬ对提高水产品的质量安全㊁保证人类健康具有重要意义ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株来源㊀创伤弧菌(ＣＩＣＣ２１６１５)来源于中国工业微生物保藏中心ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司ꎻＰＮＣＣ增菌液基础培养基㊁ＰＮＣＣ添加剂㊁ｍＣＰＣ琼脂基础培养基㊁多粘菌素Ｅ㊁多粘菌素Ｂ购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ㊁Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒ㊁Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋ￣ｅｒ㊁质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司ꎻ５０ˑＴＡＥ缓冲溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ㊁琼脂糖８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司ꎮ１.１.３㊀仪器和设备㊀ＺＨＷＹ－２００Ｈ恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司ꎻＳＷ－ＣＪ－２Ｄ双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司ꎻＣ１０００ＴｏｕｃｈＰＣＲ仪㊁ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司ꎻＪＹ６００Ｃ水平电泳仪㊁ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀重组质粒的获取与验证㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎬ获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ并保存于大肠埃希氏菌Ｔｏｐ１０菌株中ꎮ依据ＧＢ４７８９.４４ ２０２０«食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验»[１５]中创伤弧菌ＰＣＲ检测的引物序列ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表１)ꎮ以重组质粒为模板ꎬ利用创伤弧菌鉴定引物ꎬ对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行胶回收ꎬ使用ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ纯化产物连接至ｐＬＢ－ｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ上ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ置于３７ħ培养箱培养１２ｈꎮ从平板上挑取单菌落ꎬ经ＰＣＲ反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定ꎬ测序结果与预期一致的ꎬ即为验证正确的重组质粒ꎮ将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ħ超低温冰箱中甘油管保存ꎮ㊀㊀表１㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因的引物序列引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)片段大小/ｂｐｖｖｈＡ－ＦＣＣＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡｖｖｈＡ－ＲＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＣＣ５１９１.２.２㊀重组质粒的提取㊀将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻ꎬ接入４ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ放入２００ｒ/ｍｉｎ的振荡摇床中３７ħ培养１２ｈꎬ取２ｍＬ种子液转接于２００ｍＬ的ＬＢ液体培养基中扩大培养ꎬ获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液ꎬ利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性ꎬＰＣＲ验证目的基因ꎬ紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度ꎮ１.２.３㊀重组质粒的含量检测㊀取重组质粒样品１μＬꎬ于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计中检测浓度ꎬ每管检测两次ꎮ１.２.４㊀重组质粒的分装㊀将大提的质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ每管１００μＬ分装至螺口冻存管中ꎬ贴上标签ꎮ１.２.５㊀重组质粒的冷冻干燥㊀由于质粒样品较为稳定ꎬ分装后可直接冻干ꎮ在－２５ħ㊁真空度为５０Ｐａ条件下冻干２０ｈꎮ１.２.６㊀质粒定性标准样品的均匀性分析㊀按照随机抽号系统抽取的号码ꎬ抽取质粒定性标准样品１２管ꎬ用１００μＬ无菌水溶解质粒冻干粉ꎮ取０.５μＬ溶解的质粒样品作为ＰＣＲ模板ꎬ按照１.２.１方法进行基因定性检测ꎻ取质粒样品２μＬꎬ按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性ꎻ取质粒样品１μＬꎬ采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验ꎬ检测样品的浓度ꎬ每管测两次ꎬ核酸含量＝核酸浓度ˑ水化体积ꎬ核酸含量结果统计分析采用方差分析法ꎮ１.２.７㊀质粒定性标准样品的稳定性分析㊀稳定性检验方法同均匀性检验ꎬ核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法ꎮ短期稳定性检验:采取两种短期稳定性试验ꎮ第一种模拟冰袋运输:在４ħ条件下的短期储存稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于４ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎻ第二种模拟高温运输:在３７ħ条件下稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于３７ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天时每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎮ长期稳定性检验:质粒样品经冷冻干燥后ꎬ需要在－２０ħ条件下长期冷冻保存ꎮ为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性ꎬ每次检测时ꎬ从冷冻样品中随机取出３管样品ꎬ每管重复２次ꎮ抽样时间点遵循先密后疏的原则ꎬ分别在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月共７个时间点抽样检测ꎮ１.２.８㊀创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用㊀食品样本的前处理:将购买的食品样本按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求处理ꎬ在无菌条件９４１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用下ꎬ称取鲫鱼㊁偏口鱼㊁银鲳鱼㊁鲤鱼㊁鲅鱼㊁黄花鱼６种鱼类样品的表面组织㊁肠和腮各２５ｇꎬ花蛤㊁海蛎子和生蚝３种贝类样品内容物各２５ｇꎬ明虾的头足部组织２５ｇꎬ分别放入含２２５ｍＬＰＮＣＣ增菌液的无菌均质袋ꎬ用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ制成样品匀液ꎻ将均质袋放入培养箱３７ħ培养１８ｈ获得增菌液ꎬ取距液面１ｃｍ深处菌液１ｍＬ放入离心管中ꎬ９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎻ用１ｍＬＰＢＳ磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎬ重复２次ꎻ加入１ｍＬ无菌去离子水ꎬ煮沸１０ｍｉｎꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎮＰＣＲ分析:将上清液用作ＰＣＲ反应的ＤＮＡ模板ꎻ随机抽取１管创伤弧菌重组质粒定性标准样品ꎬ加入１００μＬ无菌去离子水溶解ꎬ作为阳性对照ꎻ将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３基因组ＤＮＡ冻干粉用３００μＬ无菌水溶解(终浓度为２０ｎｇ/μＬ)后作为阴性对照ꎻ无菌去离子水为空白对照ꎬ按照１.２.１的方法进行ＰＣＲ分析ꎮ创伤弧菌的分离验证:取检测为阳性的食品样本的增菌液ꎬ用接种环将其划线接种于ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征ꎬ即圆形㊁扁平ꎬ光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落ꎬ直径１~２ｍｍꎮ创伤弧菌的生化鉴定:按照ＧＢ４７８９.４４２０２０进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定ꎮ１.３㊀数据统计与分析使用ＳＰＳＳ２６.０软件的ＡＮＯＶＡ法进行单因素方差分析ꎬ统计各处理组之间的差异性ꎬ数据用平均值ʃ标准误 表示ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀创伤弧菌重组质粒的验证以创伤弧菌重组质粒为模板ꎬ对其进行目的基因ＰＣＲ扩增验证ꎬ以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３为阴性对照ꎬ无菌去离子水为空白对照ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增结果(图１Ａ)显示ꎬ创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ基因为阳性ꎬ条带清晰ꎬ片段大小为５１９ｂｐꎬ符合目的条带大小ꎬ说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ重组质粒ꎬ质粒图谱如图１Ｂ所示ꎮＭ:Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｖｈＡ质粒ꎻ２:阴性对照ꎻ３:空白对照ꎮ图１㊀创伤弧菌重组质粒ＰＣＲ扩增(Ａ)及ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ重组质粒图谱(Ｂ)２.２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析取重组质粒１μＬꎬ利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００测定其浓度和纯度ꎬ结果如表２所示ꎬＡ２６０/２８０㊁Ａ２６０/２３０均超过１.８ꎬ说明所提取的质粒纯度高ꎬ无蛋白质和有机物污染ꎻ对其携带的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图２Ａ)显示ꎬ目的基因ｖｖｈＡ条带单一且片段大小符合预期ꎬ质粒完整性分析(图２Ｂ)显示质粒条带完整ꎬ说明所制备的质粒符合预期ꎮ㊀㊀表２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度与纯度样品管号浓度/(ｎｇ/μＬ)Ａ２６０/Ａ２８０Ａ２６０/Ａ２３０ＶＡ１１６７.０１.８６２.２１ＶＡ２１８９.５１.８８２.２９ＶＡ３１７３.６１.８８２.２６ＶＡ４８２.１１.８９２.５３０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍ:Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１~８:ｖｖｈＡ质粒样品ꎮ图２㊀创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ的ＰＣＲ扩增(Ａ)及质粒完整性(Ｂ)分析㊀㊀将４管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ取１００μＬ分装至２ｍＬ螺口冻存管中ꎬ所有质粒溶液分装４５０管后ꎬ置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥ꎬ获得白色粉末状的冻干质粒样品ꎬ设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸ꎬ打印并贴在管外(图３)ꎮ质粒定性标准样品置于－２０ħ冰箱冻存ꎮ２.３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的均匀性分析从４５０管质粒标准样品中随机抽取１２管进行ＰＣＲ定性试验ꎬ结果如图４Ａ所示ꎬ各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性ꎬ条带单一且清晰ꎬ图４Ｂ显示质粒完整无降解ꎮ使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度㊁纯度分析ꎬ对所测数据进行单因素方差分析ꎬ结果如表３所示ꎬ在９５％的置信概率下ꎬＦ值小于Ｆ临界值ꎬ各管间质粒含量无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品均匀性良好ꎮ图３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~１２:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎮ图４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ)及均匀性(Ｂ)分析㊀㊀表３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品均匀性试验方差分析平方和ＳＳ自由度均方ＭＳＦ值Ｆ临界值置信概率Ｐ值组间０.０２１１１０.０２２.７００２.７２０.９５０.０５１组内０.００８１２０.０１２.４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的稳定性分析温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素ꎬ因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件ꎬ以质粒标准样品目的基因阳性检出㊁质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性(运输稳定性)ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品分别在４ħ和３７ħ条件下保存１４ｄꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图５㊁图６)显示第１天和第１４天目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小ꎬ质粒无降解ꎻ质粒含量统计学分析结果如图７所示ꎬ各时间点间无显著性差异ꎬ表明质粒含量无明显变化ꎬ说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的ꎮ因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品可与冰袋(４ħ)一起运输ꎬ也可在温度较高(３７ħ)且无降温装置条件下运输ꎮ１５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~６:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎻ７:阴性对照ꎻ８:空白对照ꎬ下同ꎮ图５㊀４ħ条件下保存１天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图６㊀３７ħ条件下保存１４天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图７㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准㊀㊀样品短期稳定性定量分析为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的长期稳定性ꎬ在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月随机抽取３管样品进行定性和定量分析ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在－２０ħ条件下保存１２个月ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１个月和第１２个月目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小(图８Ａ㊁Ｂ)ꎬ质粒无降解(图８Ｃ㊁Ｄ)ꎮ质粒含量统计学分析结果如图９所示ꎬ各时２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀间点间无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品在－２０ħ条件下稳定ꎬ说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ图８－２０ħ条件下保存１㊁１２个月创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图９－２０ħ条件下创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒㊀㊀定性标准样品长期稳定性定量分析２.５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果ꎬ将其作为阳性对照ꎬ参照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０的方法ꎬ利用ＰＣＲ对１０种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ进行检测ꎬ每种样品取样７次ꎬ每个样品７个重复ꎮ结果如表４所示ꎬ在１０种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ基因阳性ꎮ将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板中ꎬ每种平板重复划线３次ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ平板菌落为黄色㊁圆形且扁平(图１０)ꎮ挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求进行生化鉴定(图１１㊁表５)ꎬ验证此阳性样本感染创伤弧菌ꎮ㊀㊀表４㊀海鲜样品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ检出结果海鲜类型检测份数检出阳性次数鱼类６０贝类３１虾类１０总计１０１㊀㊀表５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本生化鉴定结果项目结果赖氨酸紫色氨基酸对照黄色无盐胰胨水微弱生长６％氯化钠胰胨水生长旺盛８％氯化钠胰胨水不生长１０％氯化钠胰胨水不生长Ｖ－Ｐ半固体穿刺周围扩散增长３５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用图１０㊀ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板创伤弧菌菌落特征图１１㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本菌体的生化鉴定结果３㊀讨论与结论本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ经测序验证后ꎬ将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉ꎮ对其进行均匀性和稳定性分析ꎬ检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小ꎬ质粒样品无降解ꎻ均匀性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品无管间差异ꎬ均匀性良好ꎻ稳定性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品在低温(４ħ)或高温(３７ħ)下可稳定保存１４天ꎻ在－２０ħ下长期存储１２个月ꎬ亦未观测到不稳定性ꎮ将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品应用于１０种海鲜产品的检测ꎬ检出１份阳性样本ꎬ经传统培养法和生化鉴定验证ꎬ证实阳性样本确为创伤弧菌污染ꎬ表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的快速㊁精确检测ꎮ该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白ꎬ为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＹｕｎＮＲꎬＫｉｍＤＭ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔｔｏｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＫｏｒｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ３３(６):１０７０－１０７８.[２]㊀Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣ＣａｂａｎｙｅｒｏＣꎬＡｍａｒｏＣ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆｔｈｅｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２２(１０):４１３３－４１４８.[３]㊀彭钟琴ꎬ黄璐.水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊ꎬ２０２１(３６):１９０－１９２.[４]㊀ＷａｎｇＭＹꎬＨｕＣＪ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆＶｉｂ￣ｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２９(１２):１４７０－１４７３.[５]㊀ＩｗａｍｏｔｏＭꎬＡｙｅｒｓＴꎬＭａｈｏｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１０ꎬ２３(２):３９９－４１１.[６]㊀ＪｏｎｅｓＭＫꎬＯｌｉｖｅｒＪＤ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙꎬ２００９ꎬ７７(５):１７２３－１７３３.[７]㊀ＨｅｎｇＳＰꎬＬｅｔｃｈｕｍａｎａｎＶꎬＤｅｎｇＣＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｕｒｄｅｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９９７.[８]㊀ＨｏｒｓｅｍａｎＭＡꎬＳｕｒａｎｉＳ.ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｋｉｎａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ￣ｅａｓｅｓꎬ２０１１ꎬ１５(３):ｅ１５７－ｅ１６６.４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[９]㊀Ｂａｋｅｒ￣ＡｕｓｔｉｎＣꎬＴｒｉｎａｎｅｓＪꎬＧｏｎｚａｌｅｚ￣ＥｓｃａｌｏｎａＮꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａｖｉｂｒｉｏｓ:ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｒｏｍｅｔｅｒｏｆｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２５(１):７６－８４.[１０]ＬｉＧꎬＷａｎｇＭＹ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｉｔｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐｓｉｓ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０２０ꎬ６５(２):２６５－２７４.[１１]ＧａｖｉｎＨＥꎬＢｅｕｂｉｅｒＮＴꎬＳａｔｃｈｅｌｌＫＪ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｒｅ￣ｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＭＡＲＴＸｔｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｂｉｐｈａｓｉｃｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１７ꎬ１３(１):ｅ１００６１１９.[１２]ＲａｏＮＶꎬＳｈａｓｈｉｄｈａｒＲꎬＢａｎｄｅｋａｒＪＲ.Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｅｓｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ３０(８):２２０５－２２１２.[１３]包秋华ꎬ刘倩宇.基于ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ].食品科学ꎬ２０２３ꎬ４４(５):２４８－２５６.[１４]ＺｈａｎｇＸꎬＧｕｏＢꎬＹａｎｇＬＨꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ１２ａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｏｎｅｔｕｂｅ[Ｊ].ＡｃｔａＢｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０２３ꎬ５５(２):３２２. [１５]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准:食品微生物学检验创伤弧菌检验:ＧＢ４７８９.４４２０２０[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０２０.５５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用。
中国渔业统计年鉴_札记
《中国渔业统计年鉴》读书札记目录一、概述 (2)1.1 书籍背景 (3)1.2 内容概览 (4)1.3 出版意义 (5)二、渔业发展现状分析 (6)2.1 渔业资源概况 (8)2.1.1 水域资源分布 (9)2.1.2 渔业资源种类与数量 (10)2.2 渔业经济现状 (11)2.2.1 渔业产值及增长趋势 (12)2.2.2 渔业产业结构 (13)三、重点问题研究 (14)3.1 渔业生态环境保护问题 (15)3.1.1 渔业水域污染现状 (17)3.1.2 生态环境保护措施及成效 (18)3.2 渔业安全生产问题 (19)3.2.1 安全生产现状及问题 (20)3.2.2 安全管理与应对措施 (22)四、案例分析与解读 (23)4.1 典型案例选取背景及意义 (24)4.2 案例详细分析 (25)4.2.1 案例一 (27)4.2.2 案例二 (28)4.2.3 案例三 (30)一、概述《中国渔业统计年鉴》是一部全面反映中国渔业发展状况的重要文献，通过详实的数据和系统的分析，为渔业从业者、研究人员和政策制定者提供了宝贵的信息资源。
本书旨在记录中国渔业在过去一年的发展轨迹，展示渔业经济的增长、产业结构的变化以及资源保护的书中不仅收录了全国各主要渔区的统计数据，还涵盖了养殖、捕捞、加工、销售等多个环节的信息，全方位展现了中国渔业的整体面貌。
年鉴还详细分析了渔业政策的影响、市场需求的变化以及国际贸易形势对渔业发展的影响，为读者提供了一个观察和理解中国渔业发展的窗口。
在编纂过程中，本年鉴注重数据的准确性和时效性，确保所引用的数据能够真实反映中国渔业的实际情况。
通过规范的数据处理方法和科学的分析手段，提高了年鉴的可读性和实用性，使其成为了一个兼具学术价值和实用价值的参考资料。
《中国渔业统计年鉴》是了解中国渔业现状、把握渔业发展趋势的重要工具书，对于推动中国渔业的持续健康发展具有重要意义。
1.1 书籍背景《中国渔业统计年鉴》是一本关于中国渔业发展的专业性统计资料，由中华人民共和国国家统计局和农业农村部联合出版。
2013年山东省农牧渔业丰收奖
优质高产强抗逆 蚕桑新品种 及配套 技 术 的 推 广 应 用 “ 伏脆蜜”枣选育与标准化示范
枣庄市果树科学研究所
赵元伦
１ ２
机械化保 护性耕 作技术示范与推广 山东省农业机械技术推广站 蓖麻产业化技术研 究与推广 淄博市农业科学研究院
马根众
王光 明
２ ０ １ ３ 年省农牧渔业丰收奖 （ 成果奖 ） 获 奖名 单
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南 四湖湿地功能植物菰茭草的生态 恢复技术研究与开发
蔬菜安全生产 区域控制技术研究集 成 与应用
微 山县农业质量检测 中心 安丘市植物保护站
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王 本 明
蓥 进 河 三 洲 耋 踅 曼 稚 引 滨 州 泰 裕 业 有 限 公 司 示范 、推广及产业化开发 。 麦 。 … “
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孙福 来 崔艳秋 李炳华 王树波 王照红 ３ ． ３ ３ 万 公顷设施 蔬菜简约化栽培新 技术推广应用
济宁市蔬菜工作指导 站
淄博市农业科 学研究 院 威海市 果树 茶叶工作站
山东 省 蚕 业 研 究 所
优质高 产茄子新品种 选育 与推 广 威海市苹果提质增效综合配套 技术
研 究 与 开 发
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２ ０ １ ３ 年山东省衣牧渔业 丰收奖， 经过评审委员会无记名投票，５ ４ 个项 目获２ ０ １ ３ 年山 东省农牧渔业丰收奖，其中，农业技术推广成果奖５ ２ 项 ，农业技术推广合作奖２ 项。