最新构建点突变质粒步骤资料
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
环状质粒 pcr 构建定点突变序列标题：环状质粒PCR构建定点突变序列在遗传工程领域，环状质粒PCR技术被广泛应用于构建定点突变序列，以实现对目标基因的精确控制和调节。
本文将介绍环状质粒PCR构建定点突变序列的原理、步骤以及应用前景。
一、原理环状质粒PCR是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，通过引入特定的引物和模板DNA，可以在特定位点引发突变。
其原理主要包括以下几个步骤：1.设计引物：根据目标基因序列，在突变位点的上下游设计引物，确保能够选择性扩增目标序列。
2.扩增反应：将设计好的引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，进行多轮的循环反应，使目标序列得以扩增。
3.定点突变：在PCR反应体系中加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列进行配对，从而引发突变。
4.纯化和检测：通过凝胶电泳或其他检测手段，验证突变序列的引入是否成功。
二、步骤环状质粒PCR构建定点突变序列的步骤如下：1.设计引物：根据目标基因序列，利用生物信息学工具设计引物，确保引物的特异性和扩增效率。
2.模板制备：从目标基因所在的质粒中提取模板DNA，确保模板的纯度和完整性。
3.反应体系准备：根据PCR反应的需要，准备好反应缓冲液、酶、引物和dNTP等试剂。
4.扩增反应：将模板DNA与反应体系混合，利用PCR仪进行循环反应。
根据目标序列的长度和复杂性，设置合适的扩增程序和循环次数。
5.突变引入：在PCR反应的合适环节，加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列发生配对，引发突变。
6.纯化和检测：通过凝胶电泳等方法，纯化扩增产物并进行突变检测，确认突变序列的引入是否成功。
三、应用前景环状质粒PCR构建定点突变序列具有以下应用前景：1.基因功能研究：通过引入特定的突变序列，可以研究目标基因的功能和作用机制，揭示基因与表型之间的关系。
2.基因工程改良：利用定点突变序列构建新的基因表达载体，可以实现对基因表达的精确调控，为基因工程改良提供技术支持。
定点突变的步骤
定点突变的步骤定点突变是一种在基因研究中超级酷的技术呢。
咱就先来说说最开始要做的事儿吧。
得先确定好你要突变的那个基因序列。
这就像是在一大串密码里，找到你想搞点小把戏的那一小段密码一样。
这个基因序列的选择可不能马虎，得是对整个研究或者实验有重要意义的部分哦。
接着呀，就得设计突变引物啦。
这引物就像是一把特殊的小钥匙，能精准地找到你想要突变的地方。
设计引物的时候可讲究了，要考虑好多因素，什么碱基互补啦，长度合适啦之类的。
就像你搭配衣服，得考虑颜色搭不搭，款式合不合适一样。
有了引物之后呢，就是进行PCR反应啦。
这PCR反应就像是一个小小的基因复印机，不过呢，它可是按照你设计的引物来工作的。
它会把包含你要突变位置的那一段基因大量地复制出来，而且在这个过程中，因为有引物的引导，就会在复制的时候产生你想要的突变。
这个过程就像是一场小小的基因魔法秀，在分子的小世界里悄悄地改变着基因的模样。
PCR反应完了之后，还得对产物进行验证呢。
这就好比做完了一件艺术品，你得检查检查有没有瑕疵。
验证的方法有不少，像是测序之类的。
测序就像是给基因拍个高清照片，然后仔细看看每个碱基是不是都在正确的位置，有没有按照我们想要的突变发生了改变。
要是验证通过了，那就可以把这个突变后的基因放到细胞或者生物体里啦。
这就像是把一个新的小零件装到一个大机器里，然后看看这个新零件会给大机器带来什么样的变化。
也许会产生一些意想不到的效果，也许会按照我们预想的那样改变细胞或者生物体的某些特性。
定点突变虽然听起来很复杂，但就像做一道超级复杂的菜一样。
只要一步一步按照正确的步骤来，精心准备每一个材料，用心操作每一个步骤，最后就能做出一道让自己满意的“基因大餐”啦。
这过程中虽然可能会遇到不少小麻烦，就像做菜的时候盐放多了或者火候没掌握好，但只要不断调整，总会得到想要的结果的。
而且每一次成功的定点突变，都像是打开了一扇通往新知识新发现的小窗户，让人特别有成就感呢。
质粒构建全过程范文
质粒构建全过程范文质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术，用于将目标基因插入到质粒中，进而导入到宿主细胞中。
下面将详细介绍质粒构建的全过程。
第一步：设计引物在质粒构建之前，需要设计引物，包括引物序列的选择和设计。
引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。
引物的选择应考虑到目标基因的特点，如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。
第二步：PCR扩增目标基因通过PCR反应扩增目标基因，此过程中，使用上一步设计的引物。
PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点，如长度和GC含量。
扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第三步：准备载体质粒选择一个合适的载体质粒，根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。
将质粒提取并进行消毒处理，以去除可能的污染物。
第四步：限制性内切酶切质粒与目标基因通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因，以生成互补的黏性末端。
第五步：连接目标基因与载体质粒将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。
此时，两者的黏性末端会互相连接，形成短暂的连接体。
可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。
连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。
第六步：转化宿主细胞将连接后的质粒转化到宿主细胞中，以使宿主细胞具有新质粒。
转化的方法有多种，包括化学法、电渗透法、热冲击法等。
选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。
第七步：宿主细胞筛选与鉴定转化完成后，宿主细胞需要进行筛选与鉴定。
一般来说，可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。
通过培养在含有抗生素的培养基上，只有含有质粒的细胞能够生长。
第八步：验证目标基因的插入通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中，并且在宿主细胞中表达。
可以使用特异性引物扩增目标基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
测序可以进一步验证目标基因的正确性。
第九步：扩增检测阳性菌落通过原核培养使阳性菌落扩增，以获得足够大量的质粒实验使用。
质粒构建步骤
质粒构建步骤
嘿，你问质粒构建步骤啊？这事儿还挺复杂，不过咱慢慢说。
第一步呢，得先确定你要构建啥样的质粒。
就像你要盖房子，得先有个设计图吧。
想好你要把哪些基因放进去，要让质粒有啥功能。
这可不能瞎整，得有个明确的目标。
第二步，准备材料。
你得有合适的载体质粒，就像盖房子得有块地一样。
还有你要插进去的基因片段，这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。
还得有各种酶啊，像剪刀一样把东西剪开再拼起来。
第三步，把基因片段剪下来。
用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。
这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。
得小心点，可别剪坏了。
第四步，把基因片段插进载体质粒里。
这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。
用另一种酶把载体质粒打开一个口子，然后把基因片段塞进去。
再把口子封上，让它们连在一起。
第五步，验证一下你构建的质粒对不对。
可以用一些方法，比如测序啊，看看基因片段是不是插对地方了，有没有弄错啥的。
要是不对，就得重新来过。
比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。
他先想好要把哪个发光基因插进去，找好了载体质粒和各种酶。
然后小心翼翼地把发光基因剪下来，插进载体质粒里。
最后验证的时候发现插对了，可高兴了。
把这个质粒放到细菌里，细菌就真的发光了。
所以说啊，质粒构建可不是件容易的事，得一步一步来，细心又耐心。
咋样，现在知道质粒构建的步骤了吧？。
质粒定点突变操作步骤
质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。
由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。
2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。
2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。
3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。
4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。
定点突变步骤
定点突变步骤嘿，咱今儿就来唠唠定点突变这档子事儿！你想啊，这定点突变就像是给基因这个大拼图来个精准改造。
那这第一步呢，就像是个侦察兵，得先找到咱要下手的那个确切位置。
这可不是随便找找就行的，得瞪大眼睛，仔仔细细，不能有半点马虎呀！不然弄错了地方，那不就白折腾啦！然后呢，咱就得设计出专门对付这个位置的武器啦，也就是所谓的引物。
这引物就像是一把钥匙，得和咱要突变的地方严丝合缝对上才行呢！这可得花点心思，好好琢磨琢磨，可不能马大哈似的随便搞搞。
接下来，就该让这钥匙发挥作用啦！把它和咱的基因模板放一块儿，让它们相互作用。
这过程就好像一场奇妙的化学反应，充满了未知和惊喜呢！等它们反应得差不多了，就得进行扩增啦！这扩增就好比是把小树苗培养成参天大树，让突变的部分不断壮大，变得越来越明显。
扩增完了可不算完事儿哦，还得把得到的产物进行筛选和鉴定呢！这就像是从一堆沙子里找出金子，得有耐心，还得有好眼力。
你说这定点突变是不是很神奇呀？就这么一步步的，就可以把基因按照我们的想法给变一变。
这要是放在以前，那简直是想都不敢想的事儿呢！咱再回过头来想想，这每一步都不容易呀！找位置要准，设计引物要精，反应要恰到好处，扩增要适度，筛选鉴定要仔细。
这就跟盖房子似的，哪一个环节出了问题，这房子都盖不结实呀！所以啊，搞定点突变可不能掉以轻心，得打起十二分的精神来。
不然一个不小心，就可能前功尽弃啦！你说这多可惜呀！总之呢，定点突变就是这么一个神奇又充满挑战的过程。
需要我们有足够的耐心、细心和智慧。
这可不是随便谁都能玩得转的哟！只有真正热爱这一行，愿意钻研的人，才能在这个领域闯出一片天来呢！你准备好迎接这个挑战了吗？。
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。
构建质粒详细步骤
构建质粒详细步骤在基因工程中，构建质粒是一项基础且关键的任务，以下是构建质粒的详细步骤。
1.目的基因获取首先，需要获取目的基因。
目的基因可以通过引物设计和克隆载体构建的方法获得。
引物设计是根据目标基因的序列，通过软件辅助设计出一对特异性引物。
克隆载体构建则是根据目标基因的特点，选择或构建一个适合的克隆载体，以便于目的基因的获取和后续操作。
2.载体质粒选择在获取目的基因之后，需要选择一个合适的载体质粒。
载体质粒的选择应考虑以下几个因素：质粒来源（如细菌、酵母等）、质粒大小（合适的大小能够确保插入的目的基因稳定存在并且可复制）、质粒序列（序列应清晰、稳定，以确保质粒的准确性）。
3.酶切质粒和目的基因获取到的质粒和目的基因需要进行酶切处理。
这一步骤主要是为了将目的基因插入到质粒中。
通常使用限制性内切酶对质粒和目的基因进行酶切，并且需要控制酶切时间和温度，以确保酶切效果良好且不会对DNA造成损伤。
4.T4DNA连接酶连接酶切后的质粒和目的基因需要通过T4DNA连接酶进行连接。
T4DNA连接酶能够将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。
在这个过程中，需要控制DNA的浓度、缓冲液的选择、反应温度以及是否过夜连接等条件，以确保连接的有效性和正确性。
5.转化受体细胞连接完成的质粒需要转化入受体细胞中。
常见的受体细胞包括细菌、酵母、昆虫等。
转化过程需要考虑受体细胞的类型、数量、转化效率和筛选策略等因素。
例如，对于细菌转化，需要选择感受态细胞作为受体细胞，并控制转化温度和时间以确保转化效率。
6.克隆筛选及鉴定转化后的受体细胞需要进行克隆筛选和鉴定，以找出含有正确插入目的基因的克隆。
筛选和鉴定可以通过菌液制备、抗体制备、筛选策略和鉴定方法等步骤实现。
例如，可以通过菌落PCR或抗药性筛选策略筛选出阳性克隆，并采用DNA测序等技术对阳性克隆进行鉴定。
7.质粒大量制备最后，需要对筛选出的阳性克隆进行大量制备质粒的操作。
这一步骤通常采用碱裂解法或热法等常规方法制备质粒。
质粒构建流程
质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术，它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。
在本文中，我们将介绍质粒构建的基本流程，希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。
第一步，设计引物。
质粒构建的第一步是设计引物。
引物是一小段单链DNA，它们的序列与目标DNA的两端相互补。
在构建质粒时，我们需要设计两对引物，分别用于扩增目标DNA的两端。
引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果，因此需要仔细选择引物的序列，确保其具有高度的特异性和稳定性。
第二步，PCR扩增。
设计好引物后，接下来就是进行PCR扩增。
PCR是一种体外合成DNA的方法，通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。
在PCR反应中，我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合，然后进行一系列的温度循环，最终得到目标DNA的扩增产物。
第三步，酶切和连接。
获得PCR产物后，接下来需要进行酶切和连接。
酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子，从而得到特定的DNA片段。
在质粒构建中，我们通常会选择两种不同的限制性内切酶，分别用于酶切目标DNA和质粒载体。
然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接，形成重组质粒。
第四步，转化和筛选。
最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中，然后进行筛选。
转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内，使其在细胞内进行复制和表达。
然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选，筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。
总结。
质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术，它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。
通过本文的介绍，相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。
当然，质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。
希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。
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基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。
（3）重新调整引物长度。
Primer #1: 5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3’
Primer #2: 5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTAR TM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。
1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
2. 准备模板质粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μl
Control primer mix（20pmol/μl）2μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
4. 样品反应体系（50μl反应体系）
5μl
10×Reaction Buffer
2μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng）
Sample primer (F)（10pmol/μl）1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl）1μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
5. PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
[B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。
如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。
1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。
2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。