完整版防腐挑战实验
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
防腐实验方案
防腐实验方案摘要：防腐是一种广泛应用于工业领域的技术，旨在防止物体受到腐败和化学反应的影响。
本文介绍了一个简单的实验方案，以研究不同材料在不同环境条件下的防腐性能。
该实验将探讨材料的防腐性能与温度、湿度和腐败源的接触时间之间的关系，并提供了一些实验步骤和数据分析方法，旨在帮助读者更好地了解和评估防腐技术的应用。
1. 引言防腐是一种重要的技术，广泛应用于许多行业，包括建筑、航空、汽车、船舶以及金属和木材加工等领域。
防腐的目标是延长材料的寿命，减少维护和更换成本，并保护物体免受腐败和化学反应的影响。
因此，在研究和开发新的防腐技术时，实验是一种非常重要的手段。
2. 实验目的本实验旨在通过研究不同材料在不同环境条件下的防腐性能，评估和比较不同材料的防腐特性。
具体目标如下：- 调查温度、湿度对不同材料防腐性能的影响。
- 探讨不同材料与腐败源接触时间对防腐性能的影响。
- 分析和比较各种材料的防腐性能。
3. 实验材料与设备- 材料：选取不同种类的材料进行实验，如金属、塑料、木材等。
- 设备：实验箱、温控器、湿度计、腐败源（如盐水溶液）、计时器、天平等。
4. 实验步骤1) 准备工作：a. 准备不同材料的样品，确保样品形状和尺寸相似。
b. 调节实验箱的温度和湿度，使其符合实验要求。
c. 准备腐败源，例如盐水溶液。
2) 实验组设计：设置几个实验组，每个实验组的材料和环境条件都不同。
例如，可以设置以下实验组：a. 实验组1：金属样品在高温高湿环境中与腐败源接触一段时间。
b. 实验组2：塑料样品在低温高湿环境中与腐败源接触一段时间。
c. 实验组3：木材样品在常温常湿环境中与腐败源接触一段时间。
3) 样品处理：将样品放置于不同实验组的实验箱中，确保样品与腐败源充分接触。
设定一定的接触时间，例如24小时。
4) 数据记录：a. 记录不同实验组的温度和湿度。
b. 记录材料样品在腐败源中接触的时间。
c. 定期记录样品的质量变化情况。
化妆品防腐性能挑战性试验及评价标准
化妆品防腐性能挑战性试验及评价标准化妆品防腐挑战性试验及评价标准投产前对产品防腐体系的可靠性做效能测试是十分必要的，目前，国内外配方设计时普遍采用防腐挑战性试验评价防腐剂的有效性。
防腐挑战性试验更接近实际应用，该方法能够模拟化妆品生产和使用过程中受到高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适宜条件，从而避免由微生物污染造成的损失和为消费者健康提供可靠的保证。
1.CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g （ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。
美国在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准，即，若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100 cfu/g （ml）以下，28天全部为0，则视为效果优良通过挑战试验；若第七天时下降到1000 cfu/g（ml）以下，则视为勉强通过；若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求，防腐体系则评定为无效。
2.国内参照CTFA加菌防腐挑战性试验及评价标准初始接种细菌量1000000 cfu/g（mL）（1）第28天时，样品中含细菌或霉菌＞1000cfu/g（mL）该样品不能通过微生物攻击的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地志到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。
（2）第28天时，样品中含细菌或霉菌在100 cfu/g-1000 cfu/g（mL），该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防霉体系可以使用，否则不能。
微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
防腐挑战性实验方法
防腐挑战性实验规程一、目的本方法及标准摘自欧盟标准BP2002 XVIC EFFICAIY OF ANTIMICROBIAL PRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。
二、材料及工具1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）；2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水；3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基；4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。
三、步骤1.标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。
2.细菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
3.霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。
5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。
防腐挑战测试 标准(一)
防腐挑战测试标准(一)防腐挑战测试是指在特定环境条件下对涂层的耐腐蚀性能进行测试。
这种测试可以帮助生产商评估并改进涂层的性能。
以下是防腐挑战测试的标准。
ASTM B117-16ASTM B117-16标准是一项针对盐雾腐蚀的测试。
该测试要求将待测试试样放入含有5%盐度的盐水中，在特定的环境条件下进行测试，测试时要记录样品在盐雾环境中的腐蚀情况。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在盐雾环境下的使用。
ISO 9227ISO 9227是一项针对雾露腐蚀的测试。
这项测试要求在特定的温度和湿度条件下，将试样放置在压水式雾露设施中，然后观测样品的腐蚀情况。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在潮湿或有雾露的环境下的使用。
ASTM D4585-16ASTM D4585-16是一项针对氙灯老化的测试。
该测试要求将待测试试样放入氙灯光源下进行测试，测试时间取决于试样材料和预测的使用条件。
该标准可以帮助企业确定涂层在室外光照环境下的耐久性。
ASTM G85-11ASTM G85-11是一项针对盐雾、酸雾和湿热环境的测试。
该测试要求将待测试试样放入盐雾、酸雾或湿热环境中，根据试样材料、使用条件和预期寿命等别进行不同时间的测试。
该标准可以帮助企业确定涂层能否经受住在恶劣环境下的使用。
结论通过使用这些防腐挑战测试标准，企业可以确定其涂层的性能，以便改进涂层的配方和应用。
这些测试标准可以确保产品在使用寿命内能够表现出所需的耐腐蚀性能。
其他防腐挑战测试标准除了以上提到的标准，还有一些其他的防腐挑战测试标准可以用于评估涂层的性能，如：•ASTM D2247-15，是一项针对热循环腐蚀的测试，要求将试样在高温和低温之间循环进行测试。
•ASTM D4329-13，是一项针对紫外线老化的测试，要求将试样暴露在紫外线光源下进行测试。
•ISO 20340-2017，是一项针对海水腐蚀的测试，要求将试样放置在海水环境中进行测试。
这些标准都是在特定的条件下对涂层的耐腐蚀性能进行测试，可以帮助企业了解涂层在不同环境中的表现。
细菌防腐剂挑战性实验
摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。
关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。
因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。
1 化妆品的防腐体系化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。
防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。
1.1化妆品防腐剂早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。
这些防腐剂至今很多仍在使用。
近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。
至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。
防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。
表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。
表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分商品名称化学成分Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇Biopure100 咪唑烷基脲Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲Nipacide PX (PCMX) 对氯间二甲苯酚GERMALLⅡ双咪唑烷基脲GERMALL PLUS 双咪唑烷基脲和碘丙炔基氨基甲酸丁酯（IPBC）ALLANTOIN 乙醛双酰脲SUTTOCIDE A 羟甲基甘氨酸钠华科-98、凯松CG、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-2甲基-4-异JX-515、YN-H3 噻唑啉-3-酮GLYDANT 二甲基二羟基乙内酰脲GLYDANT PLUS DMDM和IPBCIRGASAN DP300（玉洁新DP-300）、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚Oletron1.2化妆品的防腐体系的构建1.2.1防腐剂的复配一种万能的防腐剂是不存在的。
化妆品防腐挑战测试 标准
化妆品防腐挑战测试标准化妆品是现代女性日常护肤和美容的必备品，但其中存在着一些挑战和问题，其中之一就是防腐挑战。
化妆品中的防腐剂是为了延长其使用寿命和防止细菌滋生而添加的。
然而，随着消费者对天然和无添加化妆品的追求，防腐剂成为了消费者关注的热点问题之一。
防腐剂的存在是确保化妆品的质量和安全。
化妆品中含有水分和营养成分，这些成分很容易被细菌污染，导致产品腐败和滋生细菌。
为了在使用过程中保证化妆品的安全，防腐剂的添加是必要的。
合理的添加防腐剂可以有效杀灭细菌，保持化妆品的新鲜和卫生。
防腐剂也存在一些潜在的危害和副作用。
一些常见的防腐剂如苯酊、对羟基苯甲酸酯等被怀疑与致敏、激素干扰等问题有关。
这些问题引发了消费者对防腐剂的担忧和对天然无添加化妆品的追求。
同时，长期使用含有一定剂量防腐剂的化妆品是否对人体有潜在风险，也是化妆品行业需要重视的问题。
面对这一挑战，化妆品行业需要采取措施来解决。
首先，对防腐剂进行严格的临床评估和安全性测试是十分重要的。
只有通过科学合理的方法来确定防腐剂的使用剂量和安全性，才能为消费者提供真正的安全化妆品。
其次，化妆品企业应该加强对消费者的教育和宣传工作，提高消费者的安全意识，避免被不合理的宣传误导。
最后，行业监管部门应该加强对化妆品市场的监管，加强对防腐剂使用的限制和标准，确保化妆品真正安全可靠。
除了以上的努力，化妆品行业还可以探索其他替代方案。
一些天然防腐剂如茶树精油、桉树精油等，被认为具有天然的抗菌和防腐特性，可以用于替代传统的合成防腐剂。
此外，包装技术的进步也可以有效延长化妆品的保质期，减少防腐剂的使用。
例如，采用气密式包装，可以有效隔绝外界空气和细菌的进入；采用泵装设计可以减少手部接触，减少污染的机会。
综上所述，化妆品防腐挑战是一个需要行业共同努力解决的问题。
在确保化妆品质量和安全的前提下，可以通过严格的安全评估和监管来提高防腐剂的使用合理性；通过加强消费者教育来提高安全意识；通过研发更安全的替代方案和改进包装技术来降低防腐剂的使用。
电化学腐蚀与防腐措施实验
电化学腐蚀与防腐措施实验电化学腐蚀对于许多材料来说是一个重要的问题，因为它可以导致设备和结构的破坏。
为了解决这个问题，人们采取了各种防腐措施。
本实验旨在探究电化学腐蚀的原理，并验证不同防腐措施的有效性。
实验一：阳极和阴极的腐蚀在这个实验中，我们将使用两个电极：一个作为阳极，一个作为阴极。
我们还将使用一种称为NaCl的电导液体来模拟腐蚀环境。
实验材料：- 金属片（可以选择铜、铁或铝）- NaCl溶液- 电导仪- 电源实验步骤：1. 准备金属片，并优先清洁表面以确保无杂质。
2. 将一个金属片置于NaCl溶液中，作为阳极。
3. 将另一个金属片也置于NaCl溶液中，作为阴极。
4. 将电导仪的阳极引线连接到阳极金属片上，阴极引线连接到阴极金属片上。
5. 打开电源，并逐渐增加电压，记录下电流的变化。
6. 观察金属片表面是否出现腐蚀痕迹，并记录下来。
实验结果：实验结果显示，阳极的金属片的电流逐渐增加，而阴极的金属片的电流变化较小。
此外，阳极金属片的表面出现了明显的腐蚀痕迹，而阴极金属片的表面基本上没有受到损坏。
实验二：防腐措施的有效性比较在这个实验中，我们将比较不同的防腐措施对于减缓金属腐蚀的效果。
我们选择了三种常见的防腐措施进行比较：喷涂防锈漆、热镀锌和电镀。
实验材料：- 金属片（同实验一）- NaCl溶液- 喷涂防锈漆- 热镀锌液- 电镀液- 电导仪- 电源实验步骤：1. 准备金属片，并分别涂上喷涂防锈漆、热镀锌和电镀。
2. 将这些金属片置于NaCl溶液中，并进行相同的电流测试。
3. 观察每个金属片的腐蚀情况，并记录下来。
实验结果：实验结果显示，在相同的腐蚀环境下，喷涂防锈漆和电镀均有效地减缓了金属片的腐蚀速度，而热镀锌效果较差。
金属片上喷涂了防锈漆的部分几乎没有腐蚀痕迹，而电镀处理的金属片也只有轻微的腐蚀痕迹。
结论：通过这个实验，我们验证了电化学腐蚀对金属的破坏性，以及不同防腐措施的有效性。
喷涂防锈漆和电镀被证明是较为有效的防腐方法，可以延缓金属的腐蚀速度。
完整版防腐挑战实验
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g2微生物挑战性实验2.1实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。
（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株菌株美国（药典）美国（ISP公司）英国（药典）德国（Henkel 公司）德国（S&M公司）白假丝酵母V V V V V 黑曲霉V V V V V 红色青霉V绿色木霉V绳状青霉V 大肠埃希氏菌V V V V 镉绿假单胞菌V V V V 金黄色葡萄球菌V V V V V 粪肠球菌V产气肠杆菌V表皮匍萄球菌V 日勾维肠杆菌V洋葱假单胞菌肺炎克雷伯氏菌恶臭假单胞菌荧光假单胞菌表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌至少选一种发酵革兰氏阴性杆菌表皮匍萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌至少选两种非发酵革兰氏阴性杆菌变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌至少选一种酵母恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母至少选一种霉菌近平滑假丝酵母黑曲霉至少选一种产芽孢菌黄绿青霉枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株—种以上2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基2.3 试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3x108cfu/ml, 此悬液再做3 倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。
将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3X 10f^cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1X 108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
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第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品
样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go
2微生物挑战性实验
2.1实验菌株
不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表
国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。
（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株
美国美国英国德国菌株
（药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉
大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V
金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同）
德国
（S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌
恶臭假单胞菌
荧光假单胞菌
表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择
种类菌株数量
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌
至少选一种
发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌
阴沟肠杆菌
大肠埃希氏菌
至少选两种
非发酵革兰氏阴性杆菌
变形菌属
日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋
葱假单胞菌荧光假单胞菌
至少选一种
酵母
恶臭假单胞菌
黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母
至少选一种
霉菌近平滑假丝酵母
黑曲霉
至少选一种
产芽砲菌
黄绿青霉
枯草芽砲杆菌
供选用
生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基
牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置
（1）标准悬液的配制
1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制
实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。
将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止；
此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
（3）霉菌菌悬液的配制
将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡
摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计
数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190〜210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
2.4接种
2.4.1接种方式
（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。
这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。
（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。
2.4.2接种次数和时间
28天。
（一次加菌
（1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期的28天微
生物挑战实验）
（2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）
a法：第21天再接种一次，试验周期为28天。
（有实验表明，第21天接菌
和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）
b法：每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49天；
c法：每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。
（S&M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30个月内的防腐安全）2.4.3操作方法
称取待测样品30g,对应加入0.3ml浓度为1 X107〜lXlO^cfti/m 1的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5± 2.5°C
的培养箱中培养，霉菌在22.5± 2.5°C的培养箱中培养。
a •水溶性样品
10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取lnil样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10"、10・2、10与、10-\ 10'\ 10-\ 10・7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
b.油溶性样品
取10g样品，加入10ml无菌吐温・80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；
吸取1ml己稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为IO" 1、KT?、10』、10山、10_\ 10_6> 10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分
别吸取lml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
2.5培养
细菌放在32.5±2.5°C的培养箱中培养；
霉菌在22.5± 2.5°C的培养箱中培养；
混合菌在28°C的培养箱中培养。
2.6菌落计数
分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。
菌落计数的标准方法：
①先选取平均菌落数在30〜300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选
取平均菌落数在5〜50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；
②有两个稀释度在30〜300之间，求比值。
若比值W 2,报告平均数；若比值＞2,以其中较小的稀释度计算细菌总数；
③所有稀释度都大于300,以稀释度最高的平均菌落数计算；
④所有稀释度都小于30,以稀释度最低的平均菌落数计算；
⑤所有稀释度均在30-300之外，其中一个大于300,而相邻的加一稀释度小于30,则以最接近30或300的平均菌落数计算；
⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；
⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则叮将此平皿菌落计数后X2,以报告全皿菌落数。
2.7评价标准
2.7.1 CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准
CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfti/g ( ml )和
1000000cfti/g ( ml) (CFU为菌落单位),要求在第7天时霉菌降低90%,细菌降低99.9%,并且在28天内菌
数持续下降。
2.7.2美国评价标准
在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。
表3 美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准
2.7.3国内评价标准
国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。
表4 国内所用微生物防腐挑战实验评价标准
第二部分实验室可采取的方案
1实验样品
2微生物挑战性实验
2.1实验菌株
金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽砲杆
菌
2.2培养基
牛肉膏蛋白月东培养基
2.3试验用菌液的配置
实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37°C （细菌）和28°C （霉菌）培养箱屮培养。
细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细
菌（10A8CFU/ml ）和霉菌悬液（l（P6CFU/ml）,置于4°C冰箱储藏备用。
2.4 一次加菌的28天微生物挑战实验
量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10八6〜10TCFU/ml ,霉菌浓度为10八4〜10TCFU/ml ,充分混匀。
将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取
样品分析含菌量（培养计数法）。
2.6评价标准
附：实验屮所需的仪器和药品。