电生理基本技术

电生理基本技术一电刺激。

二生物放大器正确选择，植物性神经冲动幅度多为50-100μV。

不同组织，应采用不同的参数。

如 ECG：振幅0.1-2mV，灵敏度0.5-1mV，时间常数0.1-1.0s，高频滤波1KHz 植物性神经冲动：振幅50-150μV，灵敏度25-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波3-5KHz 中枢神经元单位放电振幅100-300μV, 灵敏度50-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波5-10KHz三玻璃微电极常用尖端0.5-5μm，向细胞内插入时，需小于0.5μm（细胞直径的1/10~1/100），且尖端的倾斜度应相当缓和，一般微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两类。

金属微电极，现多用镀铂钨丝电极（platinum-plated tungsten electrode），在钨丝上镀铂，可极大改善电极的电学特性，噪声可大大降低，加之机械强度大，适合长期体外记录(paré D， Gaudreau H. Projection cells and interneurons of the lateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats. J Neursci, 1996,16(10):3334-3350现要也常用镀银碳纤维电极。

玻璃微电极记录易受机械位移的影响，加之尖端的电解质会漏出或堵塞，不适合半小时以上的长时间记录，玻璃微电极可分单管和多管微电极。

毛坯管在国外多用Pyrex管，国内多用GG-17和95料玻管。

细胞外记录多采用外径1.5-2mm 玻璃，细胞内记录则采用外径1mm细玻管，内外径之比约为2:3或5:6，长6-8cm。

拉制前必须经过清洁处理。

清洁液：用等量的(250ml)王水(可反复应用)。

一般毛坯管捆成把放入清洁液中1-2h，取出自来水冲洗20-30min，再放入无水酒精中洗涤，再放入盛满蒸馏水烧杯中加热煮沸10min，倒去蒸馏水，再换新蒸馏水反复3次，再放入烤箱中烤干，备用，切不可用市售的洗涤剂，以防降低电极充灌液的表面张力而影响冲灌。

充灌液常用3mol/L KCl，为避免Cl-扩散，也可用2mol/L醋酸钾或柠檬酸钾充灌，也有人用0.5-1mol/L NaCl(低浓度)充灌可降低噪音。

细胞外记录时，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁胺天蓝溶液定位。

在膜片钳中还常加钙螯合剂，如EGTA。

阻抗与不同组织相关。

四电生理实验中噪声和干扰的形成和排除。

(一)来源。

1干扰信号与生物电生理信号的鉴别。

准确区分生物电信号与干扰的伪迹是电生理实验的先决条件。

2来源。

主要有三个方面其一。

物理性干扰。

1)静电和电磁的干扰实验室附近高压电，室内日光灯可产生50Hz的静电干扰，尤其是交流电，尤其是50Hz频率干扰最大(电子设备为50Hz)。

其特点是幅度大，波形规则。

2)噪声干扰电子元件本身产生杂乱无章电压和电流称噪声，一般与放大器内部元件的质量与性能有关。

其二。

接地不良。

1)地线电阻应小。

2)仪器故障。

产生漏电电流，在地线上形成电位差，产生干扰。

3)地线行走过程中打圈，形成线圈，易接受电场和磁场的干扰。

4)各仪器设备应采用一点接地的方式，若采用多点接地，形成大地回路，也会引起干扰。

5)地线过长与电源线形成交流环路。

6)误用市电三孔中性线作为大地线(中性线上有4-5A电流)。

其三。

生理性干扰。

1)大脑电活动时，眨眼、眼球运动均对脑电具有干扰作用。

2)实验中环境温度过低，动物寒战、抖动，引起肌电的发放而干扰记录，或因呼吸运动引起记录部位机械位移引起干扰信号。

3)心电干扰，频率与心电一致。

(二)排除。

1物理性干扰。

1)屏蔽法用于低频电和静电干扰，屏蔽线分布电容较大，线与线之间不可平行排列，更不可为了美观而将多线扎在一起，这会加大分布电容，易偶合高频干扰噪声。

2)远离法。

3)改变位置法。

依电流方向相反，产生反向磁场的原理，改变各个仪器的位置或放大器输入的方位，会使干扰磁场抵消，微电极放大器探头阻抗高，易引入干扰，实验前可反复调整其方向和位置。

4)微电极记录时尽量减少微电极本身的阻抗，减少输入阻抗及干扰信号在这个阻抗上形成干扰电压降，微电极到探头的连线<5cm。

5)用监听器监听噪声，以便及时排除。

2仪器质量，尽量改进。

3 接地不良。

地线应尽量短粗，不能与电源线平行或打圈，不要接在电源线的中性线上，地线单独埋设，埋置处应较潮湿，附近无大型变压电动机，并在坑内加些食盐。

4检查各仪器是否漏电。

5慢生物电变化时用乏极化电极，实验对象宜安静，勿受振动。

(三)刺激伪迹过大及防止。

1)尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。

2)在动物体或标本上，尽量延长刺激部位的距离，在刺激电极和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。

注微电极中高浓度充灌液易蒸发，造成电极回路的开路，因此常在微电极插入Ag-AgCl丝或铂金丝后，在微电极尾部开口处涂上一层凡士林，防止水分蒸发。

动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃.记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。

记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。

五细胞内微电极记录多用幼年离体标本，其原因1)幼年动物骨骼骨化不完全，结缔组织少，神经组织易于分离，标本耐缺氧能力强，有的标本可存活数小时至数天，但标本也可能发育不完全，如背根和脑干到脊髓的投射纤维要到三周动物才完全。

神经纤维髓鞘化不全，其药理作用与成年动物也不同。

从实验角度上讲，脊髓背腹根短，不利于电生理刺激记录。

小鼠一般应小于15g，制备标本才有可能成功，而这样小鼠背腹根神经节不利于电生理实验。

最适合的动物是金黄地鼠(hamster)，介于大小鼠之间，制备标本活性很好，可能与其冬眠习性有关，而且其脊髓背腹根长达20-25mm，利于电生理记录。

动物选择仍依实验而定，同一标本，不同中枢结构对缺氧耐受力也不同。

金黄地鼠，若观察脊髓背角神经元活动，可用150-160g体重的鼠均可，但要研究腹角神经元，则体重不宜超过30g。

离体标本的灌流注，如ACSF。

其中缓冲液成分有两种，一是重碳酸盐(bicarbonate)温度低(4℃)，配方有利于降低组织兴奋性。

二是磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液其优点是接近于人体环境。

各种缓冲液一般都先配母液，临用前一天，或临用前稀释脑片膜片钳实验方法脑片膜片钳实验方法文献综述一1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动(1966a, b)，证实了脑组织在体外也能存活，并保持很好的活性状态。

此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理学领域突飞猛进的发展奠定了基础。

1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术，这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。

在脑片电生理记录中，实验者可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等另外，实验者还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极，同时，可借助一些特殊的加药装置，将一定浓度的药物加到整个脑片或是脑片上的特定区域上，研究电信号沿神经环路的传递规律。

在电生理学实验结束后，活性较好的脑片还可用于生物化学或解剖学的分析。

这些优点使实验者能获得准确的神经生理学的研究结果，也是其应用较在位大脑广泛的原因所在。

海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。

其原因有以下几点:1、海马与脑的其它部位相对隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应另一方面，这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。

这些都使海马成为电生理学研究的理想标本。

本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。

一、海马脑片的制备脑片制备中，海马分离应在断头后10分钟内完成，5~6分钟为宜。

在分离海马时，还应注意不要扭转或撕扯海马，更不要损伤海马。

分离海马的速度和质量是保证海马脑片制备成功的关键所在。

评价脑片活性最简单的方法是记录脑片上的群峰。

在一个状态良好的脑片上记录到的群峰在一个很宽的刺激强度范围内始终是单峰的。

出现多个群峰往往提示抑制性突触功能已受损，这是脑片最早的病理生理学改变。

如果仅存在突触前纤维群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突触后反应，这提示脑片活性极差，有活性的突触已所剩无几，为激发突触反应需要更多的突触前纤维参与，需中止实验。

在活性较好的脑片中，FV峰几乎探测不到，或远远小于突触后反应。

有时会莫名其妙地出现一些问题，突触标本中突触后神经元看上去状态良好，但做了很多天甚至几周都没有得到有用的数据。

在这种情况下，须要耐心地思考失败的原因，并设法解决。

首先，应该检查溶液，用其它实验室制备的标本或更换实验动物。

对于脑片的制备而言，切片机出现的机械故障会损坏脑片的质量。

总之，在实验的全过程中能尽量注意每一个细节问题，出现问题后反复尝试，实验就会容易起来。

二、海马脑片的膜片钳记录1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近在突触传递的研究中，应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号，虽然，并不是所有突触前神经元胞体的动作电位均可传导至突触 (Vincent, 1996)。

由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较困难，因此，需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。

用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或轴突诱发动作电位。

另外，还可以用局部施加神经递质的方法来诱导动作电位，如用短促的压力、离子电泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上，可以诱导出多个动作电位。

用电极刺激在神经元培养皿中，可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经元。

在这种情况下，通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极，防止刺激电流的逸出。

通过膜片钳放大器给脉冲刺激的优点是，它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role, 1987)。