纯化后的α-淀粉酶米氏常数的测定
淀粉酶的提取--α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。
气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。
20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。
淀粉酶测定原理
淀粉酶测定原理
淀粉酶测定原理是通过测定淀粉酶对淀粉水解产生的可测定产物，从而确定淀粉酶的活性。
淀粉是由α-葡萄糖分子组成的多糖，在水中形成胶凝物质。
而淀粉酶（也称为α-淀粉酶）是一类能够水解淀粉为糊化淀
粉和可溶性糖的酶。
在淀粉酶测定中，一种常用的方法是使用淀粉酶在一定条件下水解淀粉，然后通过测定产生的可测定产物——糖的含量来确定淀粉酶的活性。
具体的测定过程如下：
1. 准备一定浓度的淀粉溶液和适当的淀粉酶溶液。
2. 将一定量的淀粉溶液加入反应容器中，加入适量的缓冲液，使得反应体系pH恒定。
3. 在恒温条件下，加入一定量的淀粉酶溶液，开始反应。
4. 反应一定时间后，取出反应液。
5. 通过加入某种试剂（如碘液或若干酶法根据反应机理决定），可使未被淀粉酶水解的淀粉与试剂发生反应，有颜色的复合物生成。
6. 通过测定复合物生成的颜色强度或光吸收度，可以定量测定淀粉酶对淀粉的水解量。
7. 依据测定结果，计算淀粉酶的活性。
需要注意的是，在测定中，一般会设置对照组，即不加淀粉酶的反应体系，以消除其他因素产生的影响。
这样，通过测定淀粉酶对淀粉的水解程度，进而通过一系列计算，可以得到淀粉酶的活性值。
这个活性值反映了淀粉酶在一定条件下水解淀粉的能力，能够用于酶的性质研究和酶活性的定量测定。
α-淀粉酶动力学常数的测定
α-淀粉酶动⼒学常数的测定实验三α-淀粉酶动⼒学常数的测定⼀、实验背景及⽬的α-淀粉酶，系统名称1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖⽔解酶，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶，可以⽔解淀粉内部的α-1,4-糖苷键，⽔解产物为糊精、低聚糖和单糖。
在酶促反应动⼒学中，以最简单的⽆别构中⼼的酶（后称⽶⽒酶）展开合理分析，建⽴⽶⽒公式，由⽶⽒公式得到了与酶本质相关的两个最重要的动⼒学常数K m和 V max。
【1】对α-淀粉酶⽔解淀粉的测定，可通过⽣成麦芽糖的浓度来确定α-淀粉酶的最⼤反应速度和⽶式常数Km的值。
进⽽了解⽶式常数在动⼒学研究的意义，了解K m和V max的常⽤测定⽅法以及原理，利⽤双倒数作图法学习掌握α-淀粉酶⽶式常数和Vmax的测定步骤。
【2】⼆、实验原理当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加⽽迅速增加。
当底物增⾄⼀定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。
这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故，这时反应速度与底物的浓度⽆关，是零级反应。
⽶⽒⽅程的推导:【3】【4】【6】【7】K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES]整理得:（2）令：（⽶⽒常数）则（2）变为([Et]-[ES])[S]=K m[ES] 整理得：（3）将（3）代⼊（1）得（4）当底物浓度很⾼，将酶的活性中⼼全部饱和时，即[Et]=[ES]，反应达到最⼤速度V max=K3[ES]=K3[Et] （5）将（5）代⼊（4）得⽶⽒⽅程式：K m值的推导：当反应速度为最⼤反应速度⼀半时得 K m=[S]K m值的含义：[11]①K m是酶的特征性常数之⼀，与酶的性质有关，与酶的浓度⽆关②K m可近似表⽰酶对底物的亲和⼒③同⼀酶对于不同底物有不同的K m值，可判断最适底物浓度。
K m值与V max值的测定：【9】【10】【11】【12】三、实验材料、仪器和试剂1.仪器：722型可见光分光光度计、恒温⽔浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、沸⽔浴锅、微量移液器2.试剂：（1）4 U/ml的α-淀粉酶溶液（2）pH 5.0柠檬酸缓冲液（3）1%淀粉溶液（4）1 mg/ml麦芽糖溶液（5）0.4M NaOH 溶液（6）3，5-⼆硝基⽔杨酸四、实验步骤：取13⽀平⼝试管，按下表进⾏操作：表1.不同底物浓度下的酶促反应体系制作取7⽀15 ml刻度试管，按下表进⾏操作：五、数据整理及结果计算图1.标准曲线OD520由标准曲线：y=0.5679x，即A=0.5679C（其中A为吸光度，C为麦芽糖浓度）将不同浓度底物OD值代⼊其中得对应麦芽糖浓度C。
α-淀粉酶测定标准操作程序
α－淀粉酶测定标准操作程序1.摘要α－淀粉酶试剂盒适用于定量测定人血清、肝素化血浆、尿液样本中α－淀粉酶的活力。
2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中α－AMY的浓度。
3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定α－AMY浓度的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司的α－AMY试剂测定采用CNPG3方法。
5.原理底物CNPG3在α－AMY催化下产生的 2－氯－4－硝基苯酚（CNP）引起波长405nm 处吸光度上升，上升的速率与α－淀粉酶的活力成正比。
5CNPG3−−→−AMY3CNP+2CNP2+3G3+2G6.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：MES缓冲液（PH6.0）、醋酸钙、硫氰酸钾、CNPG3。
表面活性剂、防腐剂7.3试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
试剂打开后冷藏于分析中可保存28天。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
8.3质控数据管理：按程序对检验后的质控后结果进行转换，及时质控数据进行分析处理，如出现失控值，应及时分析失控原因，并填写好相关失控记录。
8.4质控判断规则：按《Westgard多规则质控方法测定标准操作程序》8.5室间质评：分别参加某地区室间质评，对回报的室间质评结果按《室间质量评价程序》进行处理。
米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL 或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code 1 2 3 4 5 6 7TimeTMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10V01Code 1 2 3 4 5 6 7TimeH2O2 2 4 6 8 10 16 32 64V01二、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。
淀粉酶的提取-α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chroma togra phy)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromat ograp hy, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Mart in 为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
α淀粉酶测定方法
α淀粉酶测定方法嘿，咱今儿就来聊聊α淀粉酶测定方法这档子事儿。
你知道吗，α淀粉酶就像是个勤劳的小工匠，在我们身体里默默工作着，对很多生理过程都有着重要作用呢！那要怎么知道它工作得好不好呀，这就得靠测定方法啦。
比如说有一种比色法，就好像是给α淀粉酶来一场特殊的“考试”。
把样本放进去，然后通过一系列的反应和观察颜色的变化，就能大致了解它的情况啦。
这就好比你看一个人做事，通过他完成任务后的成果来判断他干得怎么样。
还有一种黏度法呢，就像是感受α淀粉酶工作时带来的“阻力”变化。
通过测量样本的黏度变化，就能推测出α淀粉酶的活跃程度啦。
这有点像观察水流的顺畅程度来判断有没有东西在里面捣乱一样。
酶联免疫吸附法也挺有意思，它就像是专门去捕捉α淀粉酶的“小侦探”。
通过特定的抗体和反应，精准地找到α淀粉酶并进行检测。
这就好像警察抓小偷，有着专门的手段和工具呢。
你想想看呀，如果没有这些测定方法，我们怎么能知道身体里这个小家伙工作得好不好呢？这可关系到我们的健康呀！要是它出了啥问题，咱不就麻烦啦？所以这些测定方法就像是我们了解身体内部情况的小窗口，透过它们，我们能更好地掌握身体的状态呢。
那这些方法难不难呢？其实呀，只要认真去学，也没那么难啦。
就跟你学骑自行车似的，一开始可能觉得摇摇晃晃不好掌握，但多练习几次，不就会啦？而且这些方法都是科学家们经过研究和实践才找到的呢，肯定是有道理的呀。
咱可不能小瞧了这些测定方法哦，它们可是帮了大忙呢！能让医生及时发现问题，及时治疗。
你说这多重要呀！所以呀，了解α淀粉酶测定方法真的很有必要呢，你说是不是呢？咱得重视起来呀，毕竟这关系到我们自己的身体呢！不管是比色法、黏度法还是酶联免疫吸附法，它们都有着独特的作用和价值，就像我们生活中的各种工具一样，各有各的用处。
那我们就得好好利用这些方法，让它们为我们的健康服务呀！。
纯化后的α-淀粉酶米氏常数的测定
0.05 20 1 0 1 5 1 10 2 5 25
0.1 10 1 1 1 5 1 10 2 5 25
0.15 6.67 1 2 1 5 1 10 2 5 25
0.20 5.0 1 3 1 5 1 10 2 5 25
0.25 4.0 1 4 1 5 1 10 2 5 25
0.30 3.33 1 5 1 5 1 10 2 5 25
0.35 2.86 1 6 1 5 1 10 2 5 25
0.40 2.5 1 7 1 5 1 10 2 5 25
方法步骤
4、各取1ml预热5分钟（温度以最适反应温度） 5、加入1ml稀释好的酶液，混匀后，保温反应 10分钟 6、反应结束后加入2mL DNS试剂，沸水浴显 色5分钟，冷却后定容至25mL 7、540nm比色测定OD值 8、根据OD540和回归方程计算相应麦芽糖的量 （mg），再计算出反应速度（V）及1/V 9、利用双倒数作图法（或称为LineweaverBurk作图法）求出Km和Vmax。利用1/[S] 和1/V进行直线回归，根据截距=1/Vmax；斜 率=Km/Vmax分别计算出Vmax、Km。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ作表
1/[S] 底物浓度（mg/mL） 20mg/mL马铃薯淀粉溶液用量（mL） 缓冲液用量（mL） 配制好的底物吸取量（mL） 水浴预热时间（min） 加入稀释好的酶液（mL，预热） 保温反应时间（min） 加入DNS试剂（2mL） 沸水浴时间（min） 冷却定容（mL） OD540 计算求出麦芽糖的含量（mg） 计算出反应速度V（mg/min） 1/V
Vmax [S] V Km [S]
利用不同底物浓度（[S]），在一定条件下，测 定其酶促反应速度（V）； 将米氏方程由双曲线转变为直线方程，再通过相 应作图法，求出Km和Vmax。