寻常型银屑病患者维甲酸受体α基因第6外显子碱基突变

第25卷第1期2004年2月西安交通大学学报(医学版)J o u r n a l o fX i 'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s )V o l .25N o .1F e b .2004寻常型银屑病患者维甲酸受体α基因第6外显子碱基突变楚瑞琦,彭振辉,谭升顺,杨闰平,刘 平,王冬云,袁景奕(西安交通大学第二医院皮肤科,陕西西安 710061)摘要:目的 分析寻常型银屑病患者维甲酸受体α基因序列。

方法 选取对维甲酸有不同反应性的寻常型银屑病患者有核细胞,提取其基因组D N A ,通过聚合酶链反应扩增维甲酸受体α的第6外显子序列,并对扩增产物进行序列测定。

结果 第6外显子第93位碱基存在差异,出现C ,G 的改变。

但从我们选取的对维甲酸反应性不同的寻常型银屑病患者中,未发现彼此间外显子碱基序列存在差异。

结论 银屑病患者维甲酸受体α第6外显子碱基序列发生突变,但目前还不能确定突变点在维甲酸反应性差异中的作用。

关键词:外显子;维甲酸受体;寻常型银屑病中国分类号:R 758.63文献标识码:A文章编号:1671-8259(2004)01-0061-03M u t a t i o n i n e x o n 6o f r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r a l ph a i n p a t i e n t s w i t h p s o r i a s i s v u l ga r i s C h uR u i q i ,P e n g Z h e n h u i ,T a nS h e n g s h u n ,Y a n g R u n p i n g ,L i uP i n g ,W a n g D o n g y u n ,Y u a n J i n g yi (D e p a r t m e n t o fD e r m a t o l o g y ,S e c o n dH o s p i t a l o fX i 'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y ,X i 'a n 710004,C h i n a )A B S T R A C T :O b j e c t i v e T oa n a l y z en u c l e o t i d es e q u e n c eo f t h e g e n eo f r e t i n o i ca c i dr e c e pt o ro f p a t i e n t sw i t h p s o r i a s i s v u l g a r i s (P V ).M e t h o d s T h ek a r yo t e so fP V p a t i e n t sw e r e s e l e c t e d ,a n dt h eD N Ao f t h e g e n o m ew a s e x t r a c t e d ,t h e na m p l i f i e dw i t h p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n t o e x a m i n e t h e s e qu e n c e o f i t s e x o n .R e s u I t s D i f f e r e n c e w a s f o u n d i n 93r dn u c l e o t i d e ,i n d i c a t i n g c h a n g eo fC ,G.H o w e v e r ,n od i f f e r e n c ei nt h en u c l e o t i d es e qu e n c eo f t h e s ee x o n s w a s d e t e c t e d i n a l lt h e s e s e l e c t e d P V p a t i e n t s w h o h a d d i f f e r e n t r e a c t i o n s t o r e t i n o i c a c i d .C o n c I u s i o n M u t a t i o no c c u r s i n t h ee x o n 6o f r e t i n o i ca c i dr e c e pt o r αf o r p a t i e n t sw i t hP V.T h ef u n c t i o no f t h e m u t a t i o n i n t h en u c l e o t i d e s e qu e n c e f o r t h ed i f f e r e n t r e a c t i o n s t o r e t i n o i c a c i d i s n o t c e r t a i n .K E Y W O R D S :e x o n ;r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ;p s o r i a s i s v u l g a r i s 收稿日期:2003-03-25 修回日期:2003-09-18基金项目:国家自然科学基金资助(N o .30070699)作者简介:楚瑞琦(1968-),男(汉族),博士研究生,住院医师,主要从事银屑病及维甲酸受体的研究.E -m a i l :c h u r u i q i @h a o yi s h -e n g.c o m.c n 维甲酸(r e t i n o i c a c i d ,R A )类药物是近年来皮肤科在治疗寻常型银屑病中经常使用的一线药物。

我们在临床观察中发现,寻常型银屑病患者对R A 反应性存在明显差异,并且有R A 抵抗和R A 不耐受患者存在。

因此,本研究分析了对R A 反应不同的银屑病患者维甲酸受体(r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ,R A R )αl 基因外显子,发现其第6外显子(e x o n6,E 6)存在一个单核苷酸突变,现将结果报告如下。

1 材料和方法1.1 病例选择 选取对R A 抵抗、耐受和不能耐受银屑病患者各1名,抽取静脉血各5.0m L ,枸橼酸钠抗凝,以公布的R A R α基因序列为对照[1]。

采用日本T a k a r a 公司生产的全血基因组纯化系统提取纯化人全基因组D N A ,聚合酶链反应引物根据公布的R A R α基因序列设计[1],靶序列为人R A R α基因第6外显子,全长327b p 。

引物序列为:5l C T C C T G C T G C C T C T T C C C A A 3l 、5l G G A G A G G A A G G GC A G A C A T T 3l ,由大连宝生物工程公司合成。

T a q DN A 聚合酶、d N T P 、D N A 分子量M a r k -e r 、D N A 纯化回收系统由大连宝生物工程公司提供,序列测定由大连宝生物工程公司完成。

1.2 方法1.2.1 人全基因组D N A 提取 取枸橼酸钠抗凝血各200µL ,分别加入各管,各管加入G e nT L E 溶解液Ⅰ1000µL ,迅速振荡20s ,静置10m i n ,室温12000r ·m i n -1离心5m i n ,除去上清。

加入G e nT L E 溶解液Ⅱ1000µL ,轻轻颠倒混合2～3次,室温西安交通大学学报(医学版)第25卷12000r·m i n-1离心5m i n,除去上清。

加入G e n T L E溶解液Ⅲ500µL,迅速振荡10s,室温12000 r·m i n-1离心5m i n。

将上清移入新试管中,与等量异丙醇充分颠倒混合,4j12000r·m i n-1离心5m i n,除去上清。

加入70%(体积分数)乙醇1000µL,反复颠倒数次,4j12000r·m i n-1离心5m i n,移去上清,40j、-100k P a真空离心干燥10m i n。

加入T E缓冲液100µL,轻轻混悬沉淀物。

分别吸出上述混悬液各40µL,分别用T E缓冲液160µL稀释。

取10µL稀释混悬液10g·L-1琼脂糖凝胶电泳10m i n,观察纯度,将剩余稀释混悬液用分光光度计测定其浓度。

1.2.2P C R扩增R A Rα1第6外显子将T a k a R a L A T a q酶1µL,2×G C缓冲液50µL,d N T P16µL, 5l端引物1µL,3l端引物1µL,模板2µL,去离子水29µL混合于反应体系中。

94j变性1m i n,98j 15s,55j30s,72j30s,30个循环后,72j延伸5m i n。

1.2.3扩增产物的纯化与精制将100µL聚合酶链反应产物、10µL3m o l·L-1醋酸钠、1µL2m g·m L-1糖原、250µL分析纯无水冷乙醇混合,颠倒混匀,-80j静置10m i n,4j13800r·m i n-1离心15m i n。

弃去上清,沉淀物中加入250µL70%(体积分数)冷乙醇,4j 13800r·m i n-1离心5m i n,去上清自然干燥。

加入8µL 去离子水使沉淀物溶解,用3g·L-1琼脂糖凝胶电泳10 m i n。

将主要电泳条带胶条切下放入试管中,加入3倍量溶胶缓冲液,50j水浴10m i n,使胶溶解,释放D N A。

加入与胶等量的异丙醇,混匀,放入D N A分离柱,室温13000r·m i n-1离心1m i n,倒掉离心液。

加入P E缓冲液500µL静置1m i n,室温13000r·m i n-1离心1m i n,将分离柱放入新的试管中。

加入7µL溶解缓冲液,静置5m i n,室温13000r·m i n-1离心1m i n,1g·L-1琼脂糖凝胶电泳。