为什么NCCN指南对20外显子插入突变提示可能耐药

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s u r v i v a l d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n EGFR mutation median PFS (range)A763_Y764insFQEA 5.5 months (3.9-18)other exon 20 insertions 1 month (0.8-9)
一个问题 为什么NCCN 指南对20外显子插入突变提示
“可能预测临床对TKIs 耐药”？
EGFR ２０ 外显子插入突变通常认为对TKI 耐药，NCCN 指南并没有给出一个完全耐药的提示。

下面两个研究会使我们对这一位点有更准确的理解。

一项来自2013年发表在《Sci Transl Med 》对肺癌中２０外显子 插入突变的结构、生化和临床特征的研究。

先来看下２０外显子插入在EGFR 结构上的位置，２０外显子在激酶结构域上构成C-螺旋和环，即图1黄色螺旋和后面紫色环状。

再直观看下２０外显子不同插入位点所处结构位置，见图1右图所示。

这些不同类型的２０外显子插入位点对TKI 药物反应如何呢？研究者分析了19例不同２０外显子插入类型经吉非替尼或厄罗替尼治疗的患者。

其中3例携带EGFR A763_Y764insFQEA 的患者2例部分缓解，1例稳定，见图2。

尽管患者总数少， A763_Y764insFQEA 的RR 达到了66.6% (2/3)，对比其他C-螺旋上或以外的位点RR 为0%(0/16;p=0.0175)，同样A763_Y764insFQEA 患者的PFS 比其他类型２０外显子插入的也更长（5.5月vs 1.0月），见图3。

图2.不同２０外显子插入位点患者对TKI 的疗效：黄色表示部分缓减（PR ），蓝色表示疾病稳定（SD ），红色表示疾病进展（PD ），*表示患者PD 但病灶无法测量。

右表是每一个患者对TKI 的响应情况。

图3. Kaplan-Meier ＰＦＳ曲线分析。

数据分析来自A763_Y764insFQEA 突变的３例 NSCLC
对比１６例其他２
０外显子的插入。

研究者在患者临床试验前也在体外测试了含不同２０外显子插入突变的细胞系对TKI 的敏感性，选取了Ｃ－螺旋内2种A763_Y764insFQEA 和Y764_V765insHH ，Ｃ－螺旋末端环内的M766_A767insAI, A767_V769dupASV [等同于 V769_D770insASV], D770_N771insNPG, D770_N771insSVD [等同于S768_D770dupSVD] 和 H773_V774insH [等同于P772_H773insH])。

细胞成活实验结果显示非典型的A763_Y764insFQEA 和EGFR-delL747_P753insS 和 L858R 一样 厄罗替尼抑制浓度低于0.1μM (图
4)，而其他的EGFR ２０外显子插入类型和L858R-T790M IC50s 均超过2 μM 厄罗替尼。

图4．表达EGFR-delL747_P753insS, delL747_P753insS+T790M,A763_Y764insFQEA, Y764_V765insHH,
M766_A767insAI, A767_V769dupASV,D770_N771insNPG, D770_N771insSVD, H773_V774insH, L858R and
L858R+T790M 的 Ba/F3细胞生长抑制剂量依赖实验。

表达不同突变类型ＥＧＦＲ的Ba/F3厄罗替尼处理７２小时，分析细胞成活。

每个样品重复３次，ＩＣ５０是３次实验的平均值。

研究者又从蛋白晶体结构层面对耐药的２０外显子插入和不典型的A763_Y764insFQEA 做了分析，TKI-不敏感的突变以D770_N771insNPG 为代表，晶体结构提示这种类型因为插入的残基在C-螺旋末端形成一个“楔子”导致结合ATP 的“口袋”不能变化，意味着这种突变活化ＥＧＦＲ但不能增加对ＥＧＦＲ－ＴＫＩ的亲和性，也就对ＴＫＩ不敏感。

不典型的A763_Y764insFQEA 未能得到晶体结构，通过模型分析提示插入片段使Ｃ－螺旋往Ｎ端迁移，Ｃ－螺旋上重要的Ｅ７６２也恰
好被ＦＱＥＡ中的Ｅ替代（图５）。

在这个基础上，Ｃ－螺旋的迁移使Ｉ７５９被丙氨酸所替代，Ｉ７５９，Ｌ７４７，Ｌ８５８和Ｌ８６１都是稳定蛋白非活性构型的疏水基团（图６）。

L858R 和 L861Q 是敏感突变，Ｌ７４７突变也是。

据此推测ＦＱＥＡ插入引起的I759A 与L858R 和 L861Q 活化ＥＧＦＲ的机制类似，也同样对ＴＫＩ敏感，只是敏感程度有差异。

图５．Ｃ－螺旋区域野生型和 FQEA 插入序列的比对。

插入的FQEA 残基 (黑体)可能迁移Ｃ－螺旋往Ｃ端方向（上面）也可能往Ｎ端方向（下面） ，Ｎ端方向可以保持关键活性位点７６２仍然是谷氨酸，Ｎ端迁移将拉长Ｃ－螺旋前面的环 (β3-αC)。

图６．ＥＧＦＲ非活性构型时ＦＱＥＡ插入的同源模型。

疏水基团簇（黄色侧链）对于非活性构型的稳定 是非常重要的，Ｌ８５８Ｒ和Ｌ８６１Ｑ都是该簇的一部分。

ＦＱＥＡ插入将导致Ｉ７５９Ａ，还会改变 β3-αC 的长度和构象，这区域正是１９外显子缺失的位置。

这个研究也得到了法国ERMETIC-IFCT 协作组多中心观察研究的认证。

法国的研究是对10117例NSCLC EGFR 18外显子和20外显子的罕见突变回顾分析 ，文章中指出20外显子突变占所有EGFR 突变的4%，其插入的形式和位置多变（3-12 bp ，该研究观察到18种类型）。

20外显子后端的插入（A767-C775）与EGFR-TKI 耐药相关，前端插入（ E762-Y764 ）与EGFR-TKI 疾病控制有关 。

这就解答了最初提出的问题。

指导意义：如果采用测序方法检测到A763_Y764insFQEA
的患者可以考虑使用ＴＫＩ治疗；但目
前市售ＡＲＭＳ试剂盒只涵盖三种20外显子后端的插入（V769-D770insASV ，H773-V774insH，D770-N771insG），因此ＡＲＭＳ方法检测出的２０外显子插入都是耐药突变。

文献来源：
1.Structural, biochemical and clinical characterization of
epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 insertion
mutations in lung cancer
Hiroyuki Yasuda et al.
Sci Transl Med. 2013 December 18; 5(216)
2.Rare EGFR exon 18 and exon 20 mutations in non-small-cell lung cancer on 10117 patients: a multicentre observational study by the French ERMETIC-IFCT network. Beau-Faller M et al.
Ann Oncol. 2014 Jan;25(1):126-31。