外显子捕获
wes全外显子测序原理
wes全外显子测序原理WES（全外显子组测序）是一种高通量测序技术，可以高效地检测人类基因组中的所有编码蛋白质的外显子区域。
WES的基本原理是使用特定的引物（半万通量、数百个碱基对）引导DNA聚合酶在DNA模板上扩增外显子区域，并将扩增片段测序获取DNA序列信息。
WES使用两个主要的步骤：DNA片段化和文库制备、测序和数据分析。
DNA片段化是WES过程中的第一步。
在这个步骤中，科学家将DNA切割成小片段，以便将其放入文库中。
这些DNA片段通常是相对较小（100-300bp）的，这样可以提高测序的覆盖率和可靠性。
在该步骤中，使用不同的酶切割，例如剪刀酶，谷氨酰胺酰化酶等。
文库制备、测序和数据分析是WES过程的第二步。
在这个步骤中，科学家将切割好的DNA片段与引物匹配，每个引物匹配一个外显子。
一些引物刻意设计为靠近外显子边缘，以提高捕获的精密度和覆盖率，使测序产生的数据内容更为丰富。
在测序过程中，DNA片段经过PCR扩增和链分析，得到大量的读取长度为50nt-300nt的测序数据。
随后，这些测序数据经过对比分析，人们可以重建出原始DNA的序列，从而识别具体基因并分析其序列。
数据分析可以使用各种软件和工具进行。
相对于基因组测序，WES具有一些优势。
首先，外显子仅占人类基因组的1%-2%，相对于基因组，WES测序时间相对较短。
其次，外显子通常比内含子更加功能性，这些区域通常是与特定疾病相关的。
WES可以检测的区域是与人类疾病之间的关联更加密切。
最后，WES通常是更经济和有效的，因为需要处理的DNA量较小。
但是，WES方法也有一些限制。
首先，WES仅限于已知的外显子和靶区域，对于一些变异位于外显子间区域或非编码序列区域，他们将无法被检测到。
其次，WES在检测某些类型的变异时，如重复序列的扩增，G-富集区域和GC含量高的区域时可能不是非常敏感。
最后，由于WES是针对外显子进行测序的，不能覆盖整个基因。
在一些研究中，必要时，研究人员需要选择其他技术或方法来检测某些特定的基因区域。
7解读基因组序列-1
• 三项改良 1、密码子偏倚
生物有时更加偏爱地使用一个或者一组密码子的现象。这 是在进化过程中基因复制的差异所产生的结果。如人类基 因中，亮氨酸大多被CUG编码，缬氨酸多由GUG编码。
7
2、外显子-内含子边界
外显子/内含子边界符合的GT-AG规则
3、上游调控序列
8
基因定位的实验技术
• 种属间印记
表型
基因型
• 同源重组可以灭活特定基因
目的基因的染色体 DNA与载体携带的破 坏基因重组，结果目 的基因失活。
17
缺失框
缺失框包括抗性基因和其前面 在酵母中表达所需的启动子序 列以及两侧的限制性位点。 目的基因的首尾两侧插入限制 性位点中，将载体导入酵母细 胞中。 载体上的基因片段与染色体目 的基因之间重组，使后者失活。 发生基因破坏的细胞可以鉴定， 因为它们表达抗生素抗性基因， 可以在含抗生素的琼脂糖培养 基中生长。
大肠杆菌基因平均长度：317个密码子 酿酒酵母基因平均长度：483个密码子
人类基因平均长度：450个密码子 • 最简单的ORF扫描方式是将100个密码子作为假定
基因长度的下限，并记录所有大于此值的ORF。
3
ORF扫描是细菌基因组基因定位的有效方法。此序列包含2个真基因—lacZ和 lacY，用直线表示。真基因比假ORF（波浪线）长得多。
20
RNA干扰(RNA interference)用于目的基因失活
与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是 双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与 同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
21
基因过表达也可用来研究基因功能
外显子查找方法范文
外显子查找方法范文外显子（exon）是基因组中编码蛋白质的片段，它们是基因转录后的成果。
外显子查找是基因组学领域的一个重要任务，它可以帮助我们了解基因的功能和结构，以及鉴定和研究基因突变和遗传疾病。
在过去的几十年里，外显子查找方法经历了多次技术革新，从最早的Sanger测序到现在的高通量测序技术。
下面将介绍几种常用的外显子查找方法。
1. Sanger测序：Sanger测序是一种经典的测序技术，通过反复合成DNA链并在每个碱基上加入一种特殊的标记物来测定DNA序列。
借助Sanger测序，我们可以逐个测定DNA的碱基顺序，并通过比对已知外显子序列来确定外显子的位置。
2. 基于EST序列的外显子查找：EST（Expressed Sequence Tag）是从cDNA文库中得到的短序列片段，它们通常来自于外显子区域。
利用EST序列可以通过比对已知外显子序列来推断新的外显子。
3. 基于数据库的外显子查找：利用已知的外显子序列建立外显子数据库，如Ensembl、NCBI等，可以快速比对新的DNA序列来鉴定外显子。
4. 基于高通量测序的外显子查找：高通量测序技术的发展使得我们可以快速测定大量的DNA序列，从而推断编码蛋白质的外显子序列。
常用的高通量测序技术包括二代测序技术（如 Illumina、Iontorrent）和三代测序技术（如 PacBio、Nanopore），它们通过将DNA序列拆解成短片段并进行平行测序来提高测序速度。
5. 基于RNA-Seq的外显子查找：RNA-Seq是一种利用高通量测序技术直接测定RNA序列的方法。
由于RNA是从基因组DNA转录而来的，因此RNA-Seq可以直接测定外显子序列。
此外，由于RNA-Seq还可以检测到转录后修饰和剪接等信息，因此它成为目前外显子查找的主要方法。
总的来说，外显子查找是基因组学研究中的一项重要任务。
不同的外显子查找方法有不同的优缺点，在实际应用中需要根据研究的目的、样本的可得性和测序平台的要求来选择合适的方法。
rnaseq原理
rnaseq原理RNA-seq是一种广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术，可以用于揭示转录组的全面信息。
本文将介绍RNA-seq的原理、方法和应用。
一、RNA-seq原理RNA-seq的原理基于测序技术，通过将RNA样本转录成cDNA，然后进行高通量测序，最后利用计算方法分析测序结果。
具体步骤如下：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA等各种类型。
2. RNA片段化：将提取的RNA进行片段化处理，通常采用酶或碱性水解等方法。
3. cDNA合成：利用反转录酶将片段化的RNA转录成cDNA，其中可以选择引入barcode或UMI等标记，用于区分不同样本或纠正测序误差。
4. 文库构建：将cDNA进行末端修复、连接接头、PCR扩增等步骤，构建文库。
5. 高通量测序：使用高通量测序技术对构建好的文库进行测序，通常采用Illumina测序平台。
6. 数据分析：对测序产生的原始数据进行质控、比对到参考基因组、表达量计算、差异表达分析等一系列的数据分析步骤。
二、RNA-seq方法1. 转录组测序：全转录组测序是最常见的RNA-seq方法，旨在全面分析细胞或组织中的所有转录本。
这种方法可以发现新的转录本、揭示基因调控网络等。
2. 亚转录本测序：亚转录本测序是一种针对转录本的特定区域进行测序的方法，可以研究剪接异构体、外显子区域等细节信息。
3. 单细胞转录组测序：单细胞转录组测序是一种能够对单个细胞进行转录组分析的方法，可以揭示细胞间的差异和异质性。
三、RNA-seq应用1. 基因表达分析：RNA-seq可以计算基因的表达量，通过比较不同样本之间的表达量差异，可以发现差异表达基因，从而研究基因调控与疾病发生的关系。
2. 剪接异构体分析：RNA-seq可以揭示转录本的剪接异构体，即同一基因在不同组织或发育阶段中产生的不同转录本，有助于理解基因功能的多样性。
3. RNA编辑分析：RNA-seq可以检测RNA的编辑现象，即RNA 分子中碱基的改变。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
第七章 高通量基因组测序技术介绍11-25(1)
SOLiD 5500xl
• ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化 磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
C 磁珠富集 转到测序玻片
• ABI SOLiD测序原理
• ABI SOLiD荧光结合和结果示例
@SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078 @SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 T202312302.3333130131131322113203131 +SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 !9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,
扩增反应完成后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同 的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以 放入到PicoTiterPlate板（一种光纤载板）的样品孔内供后继测序使用了。 在光纤PicoTiter Plate板样品孔内还有测序过程所需的酶类及引 物（引物与DNA片段末端的接头序列互补），当未经荧光标记的核 苷酸流经过样品孔时，每次只允许一个互补dNTP接入，进行互补 新链的合成。
每当一个核苷酸连接到新链上时，就会释放一分子的焦磷酸
盐（PPi），而后PPi与相应底物反应形成1分子ATP，ATP再驱
动荧光素酶转变为氧化荧光素酶，而氧化荧光素酶可以发出可见 光，可被检测仪器捕获，形成峰图。该技术的序列阅读长度介于
wes检测原理和过程
wes检测原理和过程WES检测原理和过程一、WES检测概述全外显子测序（Whole Exome Sequencing，WES）是一种高通量的基因组学技术，它可以对人体的所有编码蛋白质基因进行测序。
WES技术是通过对人体DNA样本进行捕获和测序，以发现与疾病相关的遗传变异。
WES技术的应用范围广泛，包括罕见遗传疾病、肿瘤、药物反应等方面。
二、WES检测原理1. WES技术流程WES技术流程主要包括DNA提取、文库制备、捕获和测序四个步骤。
（1）DNA提取：从患者血液或组织中提取DNA样本。
（2）文库制备：将DNA样本随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
连接器上含有引物序列，这些引物可以用于寻找特定区域的DNA片段。
（3）捕获：使用探针或引物来捕获感兴趣的外显子区域。
这些探针或引物可以选择性地捕获编码蛋白质所需的所有外显子区域。
（4）测序：将捕获的DNA片段进行高通量测序，并将结果与参考基因组进行比对，以确定每个外显子的序列。
2. WES技术原理WES技术的原理是利用高通量测序技术对所有编码蛋白质基因进行测序。
人类基因组中约有1%的区域编码蛋白质，这些区域被称为外显子。
WES技术可以通过选择性捕获所有外显子区域来实现对编码蛋白质基因的全面测序。
在WES技术中，DNA样本首先随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
连接器上含有引物序列，这些引物可以用于寻找特定区域的DNA片段。
然后，使用探针或引物来捕获感兴趣的外显子区域。
这些探针或引物可以选择性地捕获编码蛋白质所需的所有外显子区域。
最后，将捕获的DNA片段进行高通量测序，并将结果与参考基因组进行比对，以确定每个外显子的序列。
三、WES检测过程1. DNA提取WES检测需要从患者血液或组织中提取DNA样本。
DNA提取是WES检测的第一步，其目的是从样本中分离出DNA，并将其纯化，以便后续步骤的进行。
DNA提取方法包括化学法、机械法等多种方法。
2. 文库制备文库制备是WES检测的第二步，其目的是将DNA样本随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
分子生物学L1-L6 问题及答案
L11. Nucleic acid is the genetic material (to explain via four examples)(1)DNA是细菌的遗传物质：细菌转化实验为DNA是遗传物质提供了首要证据。
从第一个菌株抽提DNA，然后加入到第二个菌株中，能使遗传特性从一个细菌菌株传递到另一个菌株。
肺炎球菌属能引起肺炎导致老鼠死亡，其荚膜多糖有S型和R型两种，S型肺炎球菌能与活的S型菌一样，能同时杀死老鼠，这说明其中存在一种转化物质，这种转化物质纯化后发现是DNA，所以DNA是细菌的遗传物质。
(2) DNA是病毒的遗传物质：噬菌体感染大肠杆菌的实验证明DNA是病毒的遗传物质。
当细菌的DNA和蛋白质组分被标记上不同的放射性同位素32P及35S时，实验后发现仅有DNA被传递到感染细菌所产生的子代噬菌体中，这就很好的证明了DNA是病毒的遗传物质。
(3) DNA也是动物细胞的遗传物质：当DNA加入到某种在培养基中培养的真核单细胞生物群落中，核酸就会进入到细胞中去，其中有一部分就会合成出一些新的蛋白质。
例如胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的合成实验，DNA 被导入受体细胞中后，便成为受体细胞的一部分，与其他部分按相同的方式遗传，导入DNA的表达将使细胞产生一些新的特性，初期这些实验仅仅在那些培养基中培养的单细胞中获得了成功。
现在人们已经成功的通过显微注射技术将DNA导入老鼠的受精卵并使之成为其遗传物质的一个稳定的组成部分。
这些实验直接说明DNA不仅是真核生物的遗传物质，而且能够在不同物种间相互转移并保持功能活性。
(4)有一些病毒如烟草花叶病毒（TMV）等就使用另一种核酸——核糖核酸（RNA）作为遗传物质，其化学组成结构与DNA只是略有不同。
烟草TMV重建实验很好的说明了RNA在生命体中起着相同的作用。
由此可见，遗传物质的本质就是核酸。
实际上，除了一些RNA病毒外，其余生物的遗传物质都是DNA。
2.(1)3'—即一个核苷酸中五碳糖第3个C原子所连接的羟基端，它可与另一分子核苷酸的5′-磷酸基形成3′,5′- 磷酸二酯键。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
TruSeq Exome Library Prep Kit
片段大小：150bp 实验周期：2.5天
TruSeq Rapid Exome Library Prep Kit
优势：试剂盒包含所有流程反应 试剂，周期缩短至1.5天
外显子疾病检测
四种测序试剂盒比较
ENSEMBL、RefSeq：
RNA databases
综合评价:
从目标数据广度上来说，illumina 含有更多UTRs、RefSeq、 CCDS以及 Ensembl外显 子数据，其次是NimbleGen 和 Agilent. 从产物捕获效率上来说，Agilent 大于 NimbleGen 大于 illumina 从产物覆盖度上来说， Agilent 大于 NimbleGen 大于 illumina 从GC含量分析， illumina Nextera试剂盒效果较差 从SNP 变异检测性能分析，NimbleGen 大于 illumina 大于 Agilent，结果与目标产 物大小有关 需要根据研究目的具体选择试剂盒进行试验
在不同测序深度条件下 进行5-50 million数据覆 盖率分析
总体而言， Agilent覆盖率最高 Truseq 和Nimblegen相似 Nextera最差
产物GC含量检测
随测序深度增加，高 GC含量的数据都显著降低 除了Nextera，主要原因是 转座酶打断的应用。
SNP检测
产物总变异数检测： Nimblegen 大于 Illumina 大于 Agilent
Roche
罗氏2008 年推出 NimbleGen 序列捕获2.1M 外显子组芯片，随之在 2009 年底推出的 EZ 外显子组序列捕获能提供液相的工作流程并以 DNA 液相探针杂交来捕获目的片段。 SeqCap EZ Human Exome Library使用高密度探针的方法，主要是利用 杂交和 DNA 微阵列技术基因分离原理来捕获目标区域。产物可以覆盖 20000个以上的基因，超过二百万个DNA寡核苷酸探针捕获目标区域，覆 盖区域的总大小可以达到64 Mb，编码区覆盖度达到97%以上，而且检测 灵敏度较高。
外显子捕获
外显子测序简介
外显子 是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并 可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 在人类基因中大约有180,000个外显子，占人类基因组的1%，约30MB。 人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。 外显子测序 是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉 并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码 序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已 知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。 对肿瘤基因突变检测具有显著意义，因为外显子测序容易提高深度， 可以轻易达到100X、200X。 而因为外显子捕获是有偶然性的，对小片段结构变异、拷贝数变异 很难检测。
Agilent
SureSelectXT Human All Exon V6
1 SureSelect Library Prep Kit. 2 SureSelect Target Enrichment Kit Indexing Hyb Module Box #2 3 Herculase II Fusion DNA Polymerase 4 SureSelect Target Enrichment Kit Box #1 片段大小：150-200bp 测序平台： Illumina HiSeq、 MiSeq 实验周期：2天
随机选取50 million 数据进行分析产物覆盖率 Nimblegen、Agilent、Truseq、Nextera A：用个产品本身设计的目标区域 96.5% 、99.8%、96.9%、98.2% B：四种试剂盒所共享的数据区域 98% 、 99.8%、98.8%、99.5% 技术重复性都很好
共同目标区域变异检测： Aglient 大于 illumina 大于 Nimblegen 非编码区变异检测： Illumina 大于 Nimblegen 大于 Agilent
SNP与目标区域大小有关
Indels 检测 产物总变异数检测： Truseq 大于 Nimblegen 大于 Nexera 大于 Agilent 共同目标区域变异检测： Aglient 大于 illumina 大于 Nimblegen 非编码区变异检测： Illumina 大于 Nimblegen 大于 Agilent
目前市场主要外显子捕获试剂盒
SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 （Roche） SureSelectXT Human All Exon V6 （Agilent） TruSeq Exome Library Prep Kit （Illumina）
TruSeq Rapid Exome Library Prep Kit （Illumina）
KAPA Library Prep Kit SeqCap Pure Capture Bead Kit SeqCap Adapter Kit (A and/or B) KAPA HiFi HotStart ReadyMix SeqCap Hybridization and Wash Kit DNA Covaris打断仪 DNA 真空浓缩仪 金属浴 片段大小：180－220bp 测序平台：Illumina Genome Analyzer II、HiSeq 或MiSeq 测序仪 实验周期：2天
CCDS：
protein-coding databases
UTRs： 非编码区
illumina外显子捕获试剂盒 可以捕获大量UTRs序列， 是其它试剂盒不具备的。 Agilent 试剂盒捕获的数据 更为集中
数据的有效性 A：平均读136.8 million数据，匹配数据占97.4% 、97.7% 、97.6%、98.95% 筛选后有效数据占54.8%、66.0%、71.7%、40.1% B：无效读数包括：非目标区域、PCR复制出来的相同分子、同一区域重复、错配
illumina
Illumina, TruSeq Exome Enrichment Kit 是近年来刚推出的一种溶 液型的序列捕获方法，利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显 子区域。 通过与目标区域特异的生物素标记DNA探针杂交，富集目标区域， 富集的DNA片段随后从磁珠上洗脱，并杂交进行第二次富集反应，从 而提高目的片段捕获的特异性。 而且较其他产品，illumina