基因外显子与内含子的查找方法
基因外显子与内含子的查找方法
基因的内含子和外显子的序列
在NCBI找到基因序列之后，要确定其内含子和外显子的序列是比较简单的。如果是RefSeq 序列的话，那就更加容易了。简单的思路就是跟基因组序列比对就行了。
% 用NCBI的Splign工具，详见：图解：如何在NCBI上找到HNF-4基因第4个外显子的序列。
% 但由于猪KIT(FJ938289)基因不是Refseq序列。这就比较难了，由该序列的注释可知（/chromosome="8），该序列是属于第8号染色体。
% 所以先确定猪（Pig，Sus scrofa）的第8号染色体是否已经测完序了。先在Taxonomy 数据库搜索，得到Taxonomy ID: 9823。直接用关键词txid9823[Organism:noexp] 搜索Genome数据库。猪有19条染色体，结果为11。看图：
% 但其中并没有第8号染色体的。所以要确定猪KIT(FJ938289)基因的内含子和外显子的序列，好像就不大可能了。反正我是没办法了。
基因结构图
1，NCBI提供的Graphics工具
在NCBI搜索FJ938289之后，接下来用NCBI提供的Graphics工具来查看，就能知道基因的内含子和外显子的序列了（同时也是一个基因结构图哦）。看图：
人全外显子组序列捕获及第二代测序
人全外显子组序列捕获及第二代测序 概述 外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。外显子组序列捕获及第二代测序是一种新型的基因组分析技术：外显子序列捕获芯片（或溶液）可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，后续利用Solexa/SOLiD/Roche 454测序直接解析数据。 与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的DNA 即可，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。可用于寻找复杂疾病（如：癌症、糖尿病、肥胖症等）的致病基因和易感基因等的研究。同时，基于大量的公共数据库提供的外显子数据，我们能够结合现有资源更好地解释我们的研究结果。 目前，SBC提供的外显子组序列捕获芯片是NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array及Agilent SureSelect Target Enrichment System（Human Exome）。 技术路线 以Nimblegen外显子捕获结合Solexa测序为例加以说明：基因组DNA首先被随机打断成500bp左右的片段，随后在DNA片段两端分别连接上接头。经过PCR库检合格后的DNA 片段与NimbleGen 2.1M Human Exome Array芯片进行杂交。去除未与芯片结合的背景DNA 后，将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来。这些DNA片段又随机连接成长DNA片段
后，再次被随机打断并在其两端加上测序接头，经过LM-PCR的线性扩增，在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。 外显子组测序的实验流程示意图（https://www.360docs.net/doc/135781957.html,） 生物信息学分析流程图 研究内容 1．外显子组捕获与测序 将基因组DNA随机打断成片段，通过与人全外显子捕获芯片杂交富集外显子区域，通过第二代测序技术对捕获的序列进行测序。 2．基本数据分析 数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。 3. 高级数据分析 高级数据分析内容包括： （1）Clean reads序列与参考基因组序列比对； （2）目标外显子区域测序深度分析； （3）目标外显子区域一致序列组装；
全外显子组检测技术参数要求
附件：全外显子组检测技术参数要求 一、公司资质： 1.拥有先进的高通量二代测序平台和高性能计算平台； 2.具有短期处理大量样本，进行全外显子组和全基因组测序的经验； 3.实验室具有国内或国外权威机构的资质认证； 4.*应标的公司必须通过医学遗传中心选送的样本测试（三个以上生物学重复），并且需交 付原始下机数据，以中心提供的标准化流程统一进行质量评估。 二、技术参数： 1)污染防控 具有独立的实验方法进行样本身份鉴定，可追溯样本间发生的错误 2)测序质量 1.Q20平均比例在90%以上。 2.Q30平均比例在85%以上。 3.GC content 分布无明显偏移。 3)测序深度、覆盖度统计 下文涉及的数据均为经过去接头、比对、排序和去重后的有效数据。数据统计涉及的相关软件除特别说明外，应使用默认参数。 1.数据质量要求： 1)Mapped unique reads相对总reads的比例（PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED）不得低于
99% 2)有效数据总量（PF_UQ_BASES_ALIGNED）不得低于10G 3)On targeted bases相对总bases的比例（PCT_USABLE_BASES_ON_BAIT）不得低于50% 4)On and near targeted bases相对总bases的比例（PCT_SELECTED_BASES）不得低于 80% 5)全外显子碱基10X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_10X）不得低于95% 6)全外显子碱基30X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_30X）不得低于80% 7)全外显子组各区域覆盖的一致性统计要求：80%以上的target region的normalized coverage值不得低于0.3 三、项目内容： 500例耳聋患者全外显子组测序技术服务
寻找基因外显子、内含子的几种方法
寻找基因外显子、内含子的几种方法 以人类的wnt3a基因为例 一、https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene 1、进入ncbi的gene数据库【网址： https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene】 2、在for栏输入wnt3a，点击limits 3、在All fields 栏选择Gene Name，在Homo sapiens前打勾，点击go 4、出现下图，点击wnt3a 5、鼠标左键点击NC-000001.9，选择Genbank
或在Genomic栏下点击Genbank【图中圈出的部分】 6、出现下图，图中画线部分就是外显子的位点【注意不是图中圆圈的部分】外显子分别为1～149 15617～15858 43606～43871 51936～54210
二、https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/ 1、进入https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/的网页 2、点击Gene Sorter 3、在genome栏输入human，在search栏输入wnt3a，点击go
4、出现下图，点击图中圈出来的部分： 5、出现下图，点击sequence 6、出现下图，点击Genomic 7、出现下图，点击submit
8、出现序列，其中外显子用大写字母，内含字用小写字母。 9、将其拷贝到word中，鼠标定位到大小写接头的位点，进行定位统计。 疑问：奇怪的是得出的结果与方法一、方法三不符，不知是什么原因？请大家指点，看看是哪里错了。 这种方法的介绍见：https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/bbs/actions/archive/post/6145797_1.html 三、https://www.360docs.net/doc/135781957.html,/
华大智造外显子捕获测序解决方案
华大智造外显子捕获测序解决方案 概述 随着测序技术发展和成本降低，临床外显子组测序(cWES)和全外显子测序(WES)在遗传病检测领域崭露头角。外显子测序借助捕获探针(DNA或RNA)对人基因组约1-2%的区域测序，可覆盖绝大多数基因的编码序列和>99%（临床基因组资源库，ClinGen）疾病相关区域。华大智造基于自有的探针合成平台和高通量测序仪（MGISEQ/BGISEQ 系列），能为客户提供外显子测序一站式解决方案。 图1 外显子测序示意图（以MGI测序平台为例）
MGIEasy 外显子组捕获V5探针试剂套装 MGIEasy 外显子组捕获V5探针试剂套装除了涵盖传统外显子探针覆盖的区域，还有针对性的做了探针优化，保证了生育健康、新生儿、心脑血管、遗传性肿瘤、单基因病、安全用药、个人基因组、遗传性耳聋、免疫缺陷、线粒体缺陷等致病基因的全覆盖。 产品亮点 ●探针区域69Mb ●更多的疾病致病位点 ●更优的数据利用率 ●稳定而高效的捕获效率 技术优势 数据库覆盖情况 MGI V5与竞品（Vendor A6/N3/I）比，有更多的独有区域，涵盖了华大自主研发的 图2 CCDS、GENCODE、UCSC、miRBase和RefSeq数据库基因数量覆盖情况 基因覆盖更全面
MGI V5能100%覆盖的基因数达到455个，远高于A5 (125个)、N3 (33个)和I (357个)，其独有100%覆盖基因数达到160个，是A5和N3之和。 BBS10基因是巴比二氏综合征的致病基因，MGI V5完整涵盖了基因区和内含子区，其中包括ClinVar数据库中报道的已知临床突变位点。 基因覆盖均一性更优 MGI V5在测序深度达到100x时，96%的区域覆盖度均能达到20X以上。与竞品N3和I共有的区域，MGI V5显示了更优秀的覆盖均一性。 性能比较 图3 100%覆盖的基因数和BBS10基因覆盖情况 图4 >96%区域达到20X覆盖图5 共有区域的覆盖更均一
外显子捕获结题报告
外显子捕获结题报告2010-11-22
内容 1 项目信息 (1) 2 工作流程介绍 (2) 2.1 Agilent液相捕获平台 (2) 2.2 NimbleGen 液相捕获平台 (3) 2.3 生物信息分析流程 (4) 3 分析报告 (5) 结果 (5) 3.1 标准生物信息分析 (5) 3.1.1 数据产出统计 (5) 3.1.2 目标区域单碱基深度分布图 (6) 3.1.3外显子捕获测序的均一性 (7) 3.1.4一致序列组装和SNP检测 (7) 3.1.5 SNP注释 (8) 3.1.6插入/缺失(indels)检测 (9) 3.1.7插入/缺失(indels)注释 (9) 3.2个性化分析 (9) 3.2.1氨基酸替换预测 (9) 3.2.2群体SNP检测和等位基因频率估计 (12) 3.2.3孟德尔遗传病分析 (13) 3.2.4 NGS-GW AS 分析 (14) 3.2.5正向选择信号的检测 (14) 4 数据分析方法说明 (15) 4.1信息分析软件及常用参数介绍 (15) 4.2参考数据库 (16) 4.3数据文件格式 (17)
1 项目信息 PROJECT NAME CONTRACT NUMBER SAMPLE INFORMATION Species Information Genome Information Additional Information CUSTOMER INFORMATION PI Contact Person Company Name Contact Methods Name Tel E-mail Name Tel E-mail CONTACT INFORMATION (BGI) Sales Information Name Tel E-mail Name Tel E-mail Customer Service Name Tel E-mail Name Tel E-mail PROJECT DIRECTOR APPROVAL THE RESULTS HAVE BEEN APPROVED AND CAN BE SUBMITTED Signature: Date:
人外显子测序
人外显子测序 药明康德基因中心，陆桂1. 什么是外显子测序（whole exon sequencing）？ 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究基因的SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 2. 外显子捕获试剂盒有哪些？ 目前主要有Roche、Illumina和Agilent三家的外显子捕获试剂。Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针，化学性质稳；Agilent的捕获试剂盒是RNA探针，有可能RNA 不是很稳定。 3. 外显子捕获效率是什么？ 外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。 Nimblegen大约是70% Agilent大约是60% Illumina大约是50% 4. 外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？ 一般做100X或者150X。较高的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现小比例的突变。另外，外显子测序的覆盖不是很均匀，这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。 5. 外显子测序能够测出多大的片段缺失？ 大致能测出50bp的片段缺失。目前的测序主要还是用Hiseq 2000,单侧的测长就是100bp。由于外显子测序的覆盖很不平均，所以如果有大段的缺失，无法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。目前能够测到的，就是在一个read中发现的缺失。一个read的长度也就是100bp，所以大到50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。 6. 外显子捕获可以做CNV吗？ 外显子测序因为有一个杂交捕获的过程，这样就会有一个杂交捕获效率的问题。各个外显子的杂交效率是不同的，其同源竞争的情况也不同，所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。所以一般情况下，外显子测序不能用于CNV的检测。但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测CNV。 现在我们有另外两种常规方法来检测CNV，一种是全基因组重测序，另外一种是用Affymetrix SNP6.0的芯片来测。其中Affymetrix SNP6.0的检测费用大约只有全基因测序费用的1/10，是一个相对经济的手段。 7. 外显子测序的优点是什么？
基因捕获
什么是基因陷阱或基因捕获 （gene trap）？ 基因陷阱或基因捕获（gene trap）是通过在基因组中创造随机插入突变，来直接获得分子特征。基因陷阱或基因捕获载体包含一个无启动子的报告基因或选择标记，它能在插入位置（内含子）激活所在基因表达。因这系列方法酷似以报道基因为诱饵来捕获基因，故得名基因陷阱或基因捕获。换言之，它主要依靠报告基因的随机插入来产生融合转录物或融合蛋白，通过检测报道基因而推知基因及其功能。一般常用的报道基因有GUS、绿色荧光蛋白（GFP）、Lc基因。 在此基础上，还发展了启动子陷阱或启动子捕获（promoter trap）与增强子陷阱或增强子捕获（enhancer trap）。启动子陷阱或启动子捕获是通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上，如果发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达，则可推知该报道基因附近有启动子。增强子陷阱或增强子捕获是将某报道基因与一个精巧的启动子相连，组成增强子陷阱重组体，它不会自主起始转录，需要由被插入的细胞基因组中的增强子帮助才可转录。若报道基因得以表达，则可推知插入位点附近有增强子或有基因。 图1：在被“捕获”基因的启动子的转录控制下，报告基因与插入位置的内源基因整合。融合的转录体由上游外显子和报告基因组成。在载体中，多聚腺苷酸信号限制到内源转录单位的最后一个外显子。通常采
用外显子陷阱和内含了陷阱两类。内含子陷阱包括一个剪接接受子序列（splice acceptor，SA）（在无启动子报告基因最上游）。外显子陷阱没有剪接接受子序列，在插入外显子后激活报告基因表达。（Figure 1.Integration within an endogenous gene places the reporter gene under the transcriptional control of the "trapped" gene's promoter. A fusion transcript is generated between upstream exons and the reporter gene. The polyadenylation signal (pA) within the vector defines the final exon of the endogenous transcription unit. Two types of vectors are commonly used, each of which can be introduced by electroporation or retroviral infection. The "intron trap" includes a splice acceptor sequence immediately upstream of a promoterless reporter gene that is activated following insertions in introns of genes. The "exon trap" lacks a splice acceptor and is designed to activate the reporter following insertions in exons.） 更多的信息参阅国际基因陷阱或基因捕获联合会（IGTC, International Gene-Trap Consortium）网站：http://www.igtc.ca/FAQ.html 基因陷阱或基因捕获有什么特点、优 势和劣势？ 基因陷阱和启动子陷阱都有位置限制。基因陷阱重组体由报道基因和剪接接受子或部位（splice acceptor，SA）组成（接受体剪接部位在报道基因上游），该重组体需要插入到细胞基因组的内含子中随着基因转录和表达。如能检测到融合转录物或融合蛋白，就可证明插入位置附近有基因存在。启动子陷阱或启动子捕获需插入到内含子。因为增强子的作用特点，其位置与基因的位置可近可远，所以增强子陷阱不易定位基因。另外，对启动子陷阱和基因陷阱而言，插入可能导致基因失活。基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和
基因捕获技术
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)项目(N o. 2001C B509901) 作者单位:200025,上海交通大学医学院遗传学教研室 通讯作者:王铸钢(E2mail:zhugangw@https://www.360docs.net/doc/135781957.html,)?综述? 基因捕获技术 党素英 王铸钢 【摘要】 基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、发展现状及远景。 【关键词】 基因捕获; 基因捕获载体; 表达筛选 “G ene2trapping”T echnique. DANG Su2ying,WANG Zhu2gang. (Department o f Medical G enetics,Shanghai Jiao Tong Univer sity Medical School,Shanghai200025,P.R.China) Corresponding author:WANG Zhu2gang. E2mail:zhugangw@https://www.360docs.net/doc/135781957.html, 【Abstract】 G ene2trapping is an advantageous technique for generating gene mutations massively which is im2 portant to identify the functions of large quantities of gene sequence.In this review,the basic theory,study strategies, the development and future directions of gene2trap mutagenesis are discussed. 【K ey w ords】 G ene2trapping; G ene2trapping vector; Expression screens 随着人类和其他一些重要动、植物序列数据的快速积累,我们面临着如何鉴定这些序列数据所代表的生物学功能的巨大挑战。基因捕获(gene2trap2 ping)技术通过报告载体随机整合到基因组、标签插入位点、产生插入失活突变并揭示基因表达模式及其功能,已成为建立高通量、大规模基因突变模型的一种便利手段。随着多种新型载体及捕获策略的出现,基因捕获技术已被成功应用于克隆诸如特异组织发育相关基因、特殊信号传导途径相关基因等多种研究中,在功能基因组学研究中具有广阔的应用前景。 1 基因功能研究的策略 基因芯片、组织表达谱分析等多种传统的分子遗传学方法对于揭示基因功能及复杂的发育事件具有重要意义,但阐释某一基因功能的直接策略是基于对该基因突变后细胞或动物模型的表型分析。因此,X射线、化学诱变、逆转录病毒转染及转基因技术等多种产生突变的方法相继出现并被应用于基因功能研究。但这些方法都带有不稳定性,如经常影响多个基因或引起染色体重排,或不能提供分子标记来克隆突变基因[1]。在胚胎干细胞(embry onic stem cell,ES)内利用同源重组产生特定基因突变的基因打靶技术,即基因敲除和敲进技术(knock2out or knock2in)是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一。然而,由于同源重组几率低、动物繁育耗时费力且产生的功能失活突变(无义突变,null mutations)常常与疾病中发现的分子损伤类型不同,因此,随机突变筛选策略更受研究者青睐。 基因捕获是一种结合随机突变与对分子信息明确的基因突变二者之优势的突变策略,即“随机基因打靶”,广泛应用于植物、线虫、果蝇及小鼠的研究中。 2 基因捕获的基本原理 基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR的一些方法鉴定,同时还可能
外显子组测序
技术参数 样品要求捕获平台测序策略 测序深度 项目周期 外显子组测序 37天 1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序 HiSeq PE150 Agilent SureselectXT Custom Kit 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本） ≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本）样品浓度：≥20 ng/μl 参考文献 外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突 变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。 1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量 技术优势 生物信息分析 基本信息分析 1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度 3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本） 高级信息分析（单基因病） 高级信息分析（复杂疾病） 高级信息分析（癌症） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析 1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测11. NovoDR耐药突变筛选12. 基因组变异Circos图展示 案例解析 ［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。 ［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13] 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找De novo mutatio n 。发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实CREST突变与ALS相关。 ［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。 [1] Krawitz PM, Schweiger MR, R?delsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572. [3] Wei A H, Zang D J, Zhang Z, et al. Exome sequencing identifies SLC24A5 as a candidate gene for nonsyndromic oculocutaneous albinism[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2013, 133(7): 1834-1840. [4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.[5] Musunuru K, Pirruccello J P , Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227. [6] O'Roak B J, Deriziotis P , Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589. [7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-231. [8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315. [9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116. [10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J]. Science, 2012, 337(6090): 64-69. [12] Caburet S, Arboleda V A, Llano E, et al. Mutant cohesin in premature ovarian failure[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(10): 943-949.[13] Chesi A, Staahl B T, Jovicic A, et al. Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(7): 851-855.[14] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multi region sequencing[J]. Science, 2014, 346: 256-259. 群体研究 藏族人高原适应性研究[10]；深度解析人类罕见遗传变异[11]；…… 图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置） 图2 ALS家系图及CREST突变功能验证 图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序 介绍 外显子（exon）是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。全部外显子被称为“外显子组”（Exome）。外显子组测序（Exome sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1%，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。 该项技术可用于以下研究 1）检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点； 2）配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因； 3）在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因； 4）用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。 我们能提供详尽的全基因组重测序数据的处理和分析服务。 如您没有标准化的数据、只需流程中的局部分析内容或要求特立独行的数据分析思路，我们亦能满足您的要求。 数据处理和分析流程图
预期结果示例图 示例图1 各类型SNV在样本中的个数统计。 示例图2 不同类型外显子区域上的SNV类型统计。 示例图4 融合基因预测[1]
示例图4 大量样本的GWAS分析结果[2] 示例图5 肿瘤样本高频率突变基因统计[3] 示例图来源文献 [1]. Kangaspeska, S., et al., Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms. PLoS One, 2012. 7(10): p. e48745. [2]. Craig, J.E., et al., Rapid inexpensive genome-wide association using pooled whole blood. Genome Res, 2009. 19(11): p. 2075-80.
外显子、内含子、mRNA、CDS、ORF区别与联系
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 外显子、内含子、mRNA、CDS、ORF区别与联 系 1、DNA复制：以DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，将四种游离的dNTP按照碱基互补配对原则合成新链DNA 转录：以DNA为模版，在DNA指导的RNA聚合酶的作用下，将四种游离的NTP按照碱基互补配对的原则合成RNA 翻译：以mRNA为模板，在核糖体内合成蛋白质的过程 特点： DNA复制：模板为双链DNA，合成的新链与模板链一模一样，原料为四种dNTP，为半保留复制，需要引物 转录：模板为双链DNA，为半不连续转录需要引物，原料为四种NTP，合成的新链除了把DNA上的T改为U外，其他一样 翻译：模板为mRNA，原料为20中游离的氨基酸，3个碱基决定一个氨基酸 2、mRNA
mRNA （messenger RNA，信使RNA） 信使RNA是由DNA经hnRNA剪接而成，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。 3、基因DNA分为编码区和非编码区，编码区包含外显子和内含子，一般非编码区具有基因表达的调控功能，如启动子在非编码区。编码区则转录为mRNA并最终翻译成蛋白质。 外显子和内含子都被转录到mRNA前体hnRNA中，当hnRNA进行剪接变为成熟的mRNA时，内含子被切除，而外显子保留。实际上真正编码蛋白质的是外显子，而内含子则无编码功能， 内含子存在于DNA中，在转录的过程中，DNA上的内含子也会被转录到前体RNA中，但前体RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行翻译前被切除。 4、CDS Sequence coding for amino acids in protein 蛋白质编码 区CDS是Coding sequence的缩写，是编码一段蛋白产物的序列，是结构基因组学术语。 与开放读码框ORF的区别 开放读码框是从一个起始密码子开始到一个终止密码子结束的一段序列；不是所有读码框都能被表达出蛋白产物，或者能表达出占有优势或者能产生生物学功能的蛋白。 CDS，是编码一段蛋白产物的序列。 cds必定是一个orf。但也可能包括很多orf。 反之，每个orf不一定都是cds。
200X有效深度肿瘤全外显子组测序
诺禾重磅 200X有效深度全外显子组测序 肿瘤基因组研究新标准 惊爆价 货真价实Agilent SureSelect V5 捕获平台 唯一一款单样本捕获的液相杂交捕获平台，50M目标区域的捕获效率可以达到60%以上，性价比远高于自合成探针及PCR富集平台。 PE150 测序读长及覆盖深度更进一步 测序读长由PE125升级至PE150，测序数据量直线升级至20Gb，保证200X有效深度，高灵敏扫描瘤内低频突变，精准解析瘤内异质性。 基本信息分析，低价特惠 基于模拟数据及真实数据进行检出率及一致性评估，诺禾信息分析团队搭建了最佳的Somatic变异检测分析流程。我们不创造变异，我们是准确基因组变异的搬运工。 肿瘤异质性与克隆进化专项分析工具 EXP ANDS等利用Somatic SNVs及CNAs作为亚克隆区分标记，不仅可以静态绘制单个样本瘤内亚克隆结构全景，还可以记录转移及复发灶相比原发灶的亚克隆动态进化过程。 样本数量：单个项目≥20个样本 活动价格：￥9900 /样本（建库及测序），￥100/G（基本分析）项目数量：100个（中国大陆范围） 活动要求 Agilent ￥100/Gb 200X EXP ANDS 9900 Agilent SureSelect 单样本捕获 ￥
参考文献 1）Andor N. EXPANDS: expanding ploidy and allele frequency on nested subpopulations. Bioinformatics, 2013, 30(1):50-60.2）Ding L, Ley T J, Larson D E, et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome seq－ uencing. Nature, 2012, 481(7382):506-510. 3）Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multireg－ ion sequencing. Science, 2014, 346(6206):256-259. 应用方向 图3.高深度测序描绘肿瘤复发亚克隆进化路线
全外显子组检测技术参数要求
附件：全外显子组检测技术参数要求 样本量：500个样本 一、公司资质： 1.拥有先进的高通量二代测序平台和高性能计算平台； 2.具有短期处理大量样本，进行全外显子组和全基因组测序的经验； 3.实验室具有国内或国外权威机构的资质认证； 4.*应标的公司必须通过医学遗传中心选送的样本测试（三个以上生物学重复），并且需交 付原始下机数据，以中心提供的标准化流程统一进行质量评估。 二、技术参数： 1)污染防控 具有独立的实验方法进行样本身份鉴定，可追溯样本间发生的错误 2)测序质量 1.Q20平均比例在90%以上。 2.Q30平均比例在85%以上。 3.GC content 分布无明显偏移。 3)测序深度、覆盖度统计 下文涉及的数据均为经过去接头、比对、排序和去重后的有效数据。数据统计涉及的相关软件除特别说明外，应使用默认参数。 1.数据质量要求：
1)Mapped unique reads相对总reads的比例（PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED）不得低于 99% 2)有效数据总量（PF_UQ_BASES_ALIGNED）不得低于10G 3)On targeted bases相对总bases的比例（PCT_USABLE_BASES_ON_BAIT）不得低于50% 4)On and near targeted bases相对总bases的比例（PCT_SELECTED_BASES）不得低于 80% 5)全外显子碱基10X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_10X）不得低于95% 6)全外显子碱基30X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_30X）不得低于80% 7)全外显子组各区域覆盖的一致性统计要求：80%以上的target region的normalized coverage值不得低于0.3
外显子组测序技术的原理及应用概述
生物学教学"01B年(第43卷)第"期+ 77 +外显子组测序技术的原理及应用概述 李法君（山东省潍坊科技学院2627〇〇) 摘要外显子组测序是利用序列捕获技术将基因组外显子区域捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。近年来，该技 术被广泛应用于单基因遗传病和肿瘤等复杂疾病的检测以及动植物等领域的研究。本文综述了外显子组测序技术的基本原理及 其在相关领域研究中的应用。 关键词外显子组测序技术基因组单基因疾病肿瘤 随着社会生活水平的提高，健康问题越来越多地 受到关注。传统遗传疾病的鉴定多采用染色体显带分 析、核型分析和遗传标记等方法来寻找与疾病相关的 DNA变异。这些方法虽然各有特点，但都存在效率低 下、工作量大和分辨率低等问题。21世纪初，随着人 类基因组计划和国际人类基因组单体型图计划的相继 完成以及高通量生物芯片技术的快速发展，研究人员 得以利用全基因组关联研究（genome-wideassociation study，GWAS)的方法来筛选复杂疾病的易感基因，并 取得了举世瞩目的成就，掀起了人类基因组研究的第 三次浪潮[1]。但GWAS技术也存在自身的局限性，如 对稀有的变异和结构变异不敏感，易出现假阳性结果 等[2,3]。与此同时，研究人员还意识到对疾病及性状表 型起着关键作用的变异主要来源于编码区，即外显子 的差异[4’5]，而前期的研究则多聚焦于非编码区的变 异，对外显子变异的关注度较欠缺。由于全基因组测 序费用高昂，因此在研究可用的财力资源一定的条件 下，外显子组测序技术更适合探索高深度测序数据的 大批量样本研究。基于上述原因，众多研究者开始优 先关注编码区的信息，从而加速了外显子组测序技术 的出现。 外显子是蛋白质的编码区，是真核生物基因组的 一部分，含有合成蛋白质所需的遗传信息，基因组中的 全部外显子称为外显子组。如人类基因组大约有1.8X105个外显子，总长30 Mb，尽管只占人类基因组 的1%，但存在与个体表型相关的大量功能变异。研 究表明，人类85%以上的致病基因都是由外显子碱基 突变造成的[4]。2009年8月，外显子组测序技术第一 次成功应用于疾病致病基因的鉴定，Ng等[']对4名无 亲缘关系的弗里曼谢尔登综合征患者[已知该病的致 病基因为肌球蛋白重链3基因（FFH?)]及8名对照组 的DNA样本进行外显子组测序，通过对12个样本的 测序数据进行比较分析，准确找出了位于FFH?中的 致病突变，这也预示了其作为遗传学研究的重要工具，具有广阔的应用前景。 1外显子组测序技术的原理 外显子组测序主要包括外显子序列的捕获富集、DNA测序和数据统计分析三个主要步骤。 1.1外显子组的捕获富集目前，主要通过罗氏(NimbleGen)[7]和安捷伦（Agilent)[8]两种捕获芯片对 外显子序列进行富集。其基本原理是：首先将基因组 DNA随机打断成200 ~ 300 bP左右的片段，随后进行 DNA片段平末端修复，5'端加磷酸基团，3'端加P1+A 尾，通过T A连接将接头序列加到片段两端，经过一轮 PCR*增后成为完整的片段文库;然后将这些DNA片 段与捕获芯片进行杂交，从而得到富集的目标片段;随 机把目的片段连接成长链DNA片段，然后再次随机打 断并在其两端连接上测序接头，然后用与接头相匹配 的序列为引物进行PCR扩增，经质量检测合格后的外 显子组文库即可上机测序。 1.2 DNA测序外显子组的测序以二代测序技术为主，其中大部分报道的外显子组测序技术确定的致病 基因使用的平台是Illumma测序仪。其测序的基本原 理是边合成边测序，用不同颜色的荧光标记四种不同 的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并 经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序 列信息。随着测序技术的发展，第三代测序技术也用 在外显子组的测序方面。第三代单分子测序仪不需要 扩增建立DNA文库，而是边合成边测序将随机打断后 的片段3'末端加上P+yA，通过合成互补链技术对数百 万个DNA片段进行测序。第三代测序仪测序通量高，测序读长较长，可达到10kb，更加有利于基因组的拼 接，但其错误率也相对较高，需要进行高覆盖度测序以 确保较高的测序精度。 1.3数据统计分析虽然外显子组测序得到的数据较全基因组测序要少许多，但仍会产生大量的数据。在如此庞大的数据中发掘出有意义的信号依然是一个 巨大的挑战。数据分析主要包括常规的图像信息数据 分析和生物信息学分析。图像信息数据分析主要包括 图像的去噪音、锐化、定位和偏移校正、依据光强度获 得碱基等;生物信息学分析的目的是挖掘变异位点，包 括单核昔酸多态性（single nucleotidepolymorphisms，SNP)和短的插入/缺失片段（short insertion/deletions ，