猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT_PCR检测方法的建立及初步应用

通讯作者：程福亮，E-mail：cfl_0428@
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中国生物制品学杂志 2013 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chin J Biologicals March 2013，Vol. 26 No. 3
98. 2%，while those of amplified PRRSV to ten representative PRRSV strains were 94. 1% ~ 97. 9%. Conclusion A multi－ plex RT-PCR method for detection of CSFV and PRRSV was successfully developed，which laid a foundation of early diag－ nosis and epidemiological investigation of classical swine fever and porcine respiratory and reproductive syndrome. Key words： Classical swine fever virus（CSFV）; Porcine respiratory and reproductive syndrome virus（PRRSV）; Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction
中国生物制品学杂志 2013 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chin J Biologicals March 2013，Vol. 26 No. 3
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猪瘟和猪蓝耳病病毒多重 ＲＴ-ＰＣＲ 检测方法的 建立及初步应用宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000
摘要： 目的 建立猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和猪蓝耳病病毒（Porcine respiratory and reproductive syndrome virus，PRRSV）多重 RT-PCR 检测方法，并进行验证及初步应用。方法 根据 GenBank 中登录的 CSFV 和 PRRSV 疫苗株基因组序列，分别设计针对 CSFV 和 PRRSV 的两对引物，建立多重 RT-PCR 检测方法，并进行敏感性 及特异性验证。用建立的多重 RT-PCR 法检测 20 份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料，并与市售 RT-PCR 试剂盒 的检测结果进行比较；检测病料的部分 PCR 产物测序后，与 9 株具有代表性的 CSFV 毒株和 10 株具有代表性的 PRRSV 毒株进行核苷酸序列同源性比对。结果 以 CSFV 和 PRRSV 混合引物扩增，分别可扩增出 286 和 664 bp 的特异性条带。建立的多重 RT-PCR 检测方法可检出 100 倍稀释的病毒 RNA；该方法可检出 CSFV、PRRSV 及 CSFV 与 PRRSV 混合病毒，而猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastro-enteritis virus，TGEV）、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和猪 伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的检测结果均为阴性；该方法检测 20 份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合 感染病料的结果与市售 RT-PCR 试剂盒比较，灵敏度达 100%；选取的两份 CSFV 扩增片段与 9 株具有代表性的 CSFV 毒株的核苷酸序列同源性在 92. 3% ~ 98. 2%之间，扩增的 PRRSV 与 10 株具有代表性的 PRRSV 毒株的核苷 酸序列同源性在 94. 1% ~ 97. 9%之间。结论 成功建立了 CSFV 和 PRRSV 多重 RT-PCR 检测方法，为猪瘟和猪蓝 耳病的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。 关键词： 猪瘟病毒；猪蓝耳病病毒；多重逆转录聚合酶链反应
猪瘟是由黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pesti virus）的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）［1］ 引起的猪高致死性烈性传染病，该病以高热稽留、全 身广泛性出血、败血症、母猪繁殖障碍为主要特征［2］。 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine respiratory and reproductive syndrome，PRRS）又称猪蓝耳病，是由动脉炎 病 毒 科（Arteriviridae）动 脉 炎 病 毒 属（Arterivirus）猪 繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）［3］引 起的一种猪高度接触性传染病，该病以母猪发生流 产、产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、高死 亡率等为特征［4］。目前很多猪场均同时存在这两种 疾病，严重影响猪的生产［ 。 5-6］
中图分类号： S852. 65 + 1 S851. 34 + 7. 1 ／ . 7-1 文献标识码： A 文章编号：1004-5503（2013）03-0425-05
Development and preliminary application of multiplex RT-PCR for classical swine fever virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus
1. 2 主 要 试 剂 rTaq DNA 聚 合 酶 、dNTP Mixture （各 10 mmol ／ L）、DNA marker DL2000、反转录酶 M-MLV（Rnase H-）和 RNA 酶抑制剂 RNase Inhibitor 购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol 试剂购自上 海英骏生物技术有限公司；RNA 吸附柱为北京百泰 克生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产试剂。 1. 3 引 物 设 计 及 合 成 根 据 GenBank 中 登 录 的 CSFV（JQ411591）和 PRRSV（EF635006）疫 苗 株 的 基因组序列，应用 Primer 5. 0 软件各设计 1 对引物， 见表 1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司 合成。
CHEN Tian-tian，CHENG Fu-liang，LIANG Jin，SU Zhi-rui，FAN Qun-ping Shandong Baolai Bioengineering Co. Ltd.，Tai’an 271000，Shandong Province，China
Corresponding author：CHENG Fu-liang，E-mail：cfl_0428@ Abstract： Objective A multiplex RT-PCR method for detection of classical swine fever virus（CSFV）and porcine repro－ ductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）was developed，verified and preliminarily applied. Methods According to the genomic sequences of CSFV and PRRSV reported in GenBank，two specific pairs of primers were designed，based on which a multiplex RT-PCR method was developed and verified for sensitivity and specificity. Twenty suspected sam－ ples with CSFV，PRRSV or mixed infection were detected by the developed method，of which the results were compared with those by commercial RT-PCR kit. The PCR products of partial samples were sequenced，and analyzed for homolo－ gies of nucleotides to those of representative nine CSFV strains and ten PRRSV strains. Results Specific gene fragments at lengths of 664 and 286 bp respectively were amplified by RT-PCR using the mixed primers for CSFV and PRRSV. The viral RNA at a dilution of 1 ∶ 100 was detected by the developed method. The detection results of CSFV，PPRSV and mixture of the two viruses were positive，while those of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV），transmissible gastro-en－ teritis virus（TGEV），porcine circovirus（PCV），porcine parvovirus（PPV） and porcine pseudorabies virus（PRV） were negative. Compared with that of commercial RT-PCR kit，the sensitivity of the developed method for 20 suspected sam－ ples was 100%. The homologies of nucleotides amplified CSFV to those of nine representative CSFV strains were 92. 3% ~