产淀粉酶枯草芽孢杆菌
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
浙江师范大学微生物实验报告 产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。
关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。
其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。
α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。
芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。
芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。
例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。
此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。
笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。
1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。
常见几种芽孢杆菌产淀粉酶的比较
目前!微生态制剂及饲料添加剂中常用的芽孢杆菌有地衣芽孢杆菌"蜡样芽孢杆菌"枯草芽孢杆菌及纳豆芽孢杆菌#前三种菌都是药准字使用的菌种$为了探讨这!种菌产淀粉酶的能力!筛选和制备用于草食及杂食动物的微生态制剂及饲料添加剂使用菌种!于"##!年$月进行了!种常见芽孢杆菌产淀粉酶能力的比较试验$现将试验结果报告如下$!材料与方法!"!材料菌种%地衣芽孢杆菌&枯草芽孢杆菌&蜡样芽孢杆菌均系山东省农业科学院实验室保存菌种!纳豆芽孢杆菌是从临沂八宝豆豉中分离得到的菌种$培养基%普通营养琼脂培养基和淀粉酶试验培养基$试剂%鲁格尔氏碘溶液’革兰氏染色用碘溶液(#!"#方法%&"&%试验步骤首先做好淀粉酶试验培养基!即在普通营养基琼脂中加%’的可溶性淀粉!制成平板备用#将!种芽孢杆菌分别接种营养肉汤液体培养基的试管中!$(!培养"!)!中间摇震$*+次#将上述培养好的液体管菌种!分别划线接种于淀粉酶试验培养基中!每个菌种接两个板!争取平板上一定要出现+个以上的单个菌落!以易于观察测量和计算透明圈#将接好的上述平板置于恒温箱中$(!培养"!)#将培养好的平板取出!分别滴加现配制的鲁格尔氏碘溶液!直至全部弥漫平板#稍停片刻!观察其菌落形成的透明圈#%&"&"结果测定出现透明圈即表明该菌能产生淀粉酶#细菌产生的淀粉酶将周围的淀粉分解!因此当滴入鲁格尔氏碘溶液时!菌落周围出现透明圈!其他部分则呈现蓝色#取有透明圈的$个菌落分别测量菌落的直径和透明圈直径!取菌落和透明圈直径的平均值!然后计算出透明圈面积与菌落面积之比#比值越大!说明产淀粉酶能力越强##结果试验结果表明!常见四种芽孢杆菌都产生淀粉酶!以蜡样芽孢杆菌所产生的淀粉酶最多!纳豆芽包杆菌&枯草芽孢杆菌次之!地衣芽孢杆菌较少!详见表%#从表%可以看出!蜡样芽孢杆菌产淀粉酶的能力几乎比纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌多%倍!比地衣芽杆菌多两倍多!这为草食动物和杂食动物选择微生表!常见$种芽孢杆菌产淀粉酶的比较!!!!!菌种菌落平均直径’,,(透明圈平均直径’,,(透明圈与菌落面积比值蜡样芽孢杆菌-&#%"&$!&"#纳豆芽孢杆菌$&.-&$"&(+枯草芽孢杆菌!&$(&#"&-+地衣芽孢杆菌$&(!&.%&-.收稿日期："##!/#-0%+作者简介：王世荣’%1$(0(!男!教授!研究员!主要从事医学&微生态学和动物微生态学研究#常见几种芽孢杆菌产淀粉酶的比较王世荣１，徐龙１，张树华２，杨震国１!!!!（%&山东省农业科学院，山东济南"+#%##；"&齐鲁动物保健品厂，山东济南"+#%##）!!摘要：探索地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌产生淀粉酶的能力，以筛选和研制动物微生态制剂和饲料添加剂的使用菌种。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种在垃圾堆、陆地和淡水中常见的细菌，它可以合成淀粉酶，参与食品加工和制药等领域。
为了深入研究芽孢杆菌产淀粉酶的机制，本文旨在克隆和表达枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，为今后的更深入研究奠定基础。
研究中，我们首先从枯草芽孢杆菌的形态学特性中确定菌株，然后利用定点突变技术，以外源基因引入枯草芽孢杆菌，以达到调控基因表达的目的。
实验中，通过对枯草芽孢杆菌分离介质DNA的提取、限制性内切酶扩增以及后续的PCR扩增，我们能够从大量杂合DNA中克隆出淀粉酶基因的片段，然后进行终止密码子转录、酶切以及连接方面的实验，最终可以将淀粉酶基因克隆入宿主细菌质粒中，从而表达淀粉酶蛋白。
经过蛋白质免疫印迹分析，可以看到从枯草芽孢杆菌中克隆和表达的具有淀粉酶功能的蛋白质，在不同pH条件下具有较强的淀粉水解能力，与未经克隆表达的芽孢杆菌菌株相比，淀粉酶产量有了显著提高。
基于以上结果，我们总结出了枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达的技术方案，为今后的深入研究提供基础，也为特定乳酸菌淀粉酶防护剂的研发提供参考价值。
本文通过介绍枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达，探索了枯草芽孢杆菌淀粉酶的分子机制，证明了定点突变技术对淀粉水解能力的增强作用，为淀粉酶的进一步研究提供了可靠的技术手段。
未来，
我们将借助于新的基因技术等技术平台，进一步深入研究芽孢杆菌淀粉酶的功能、结构和稳定性，以期能更好地利用该酶的乳化作用，为食品加工和药物制造等领域提供支持。
产淀粉酶枯草芽孢杆菌
“生物制药技术实训”课程研究报告项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌一实验原理枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。
由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。
利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。
根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。
二材料灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。
三操作步骤1.包平板2.配生理盐水3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。
取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。
9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究
枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究摘要：淀粉是一种广泛存在于植物细胞中的高分子碳水化合物，具有丰富的能量和营养。
枯草芽孢杆菌是一种在自然界中广泛存在的产气厌氧菌，可以分解多种有机物质，包括淀粉。
本研究旨在通过淀粉酶的定向进化，提高枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
1. 引言随着人口的增长和生活水平的提高，对粮食的需求也在不断增加。
利用高效的淀粉水解酶进行玉米粉加工，可以提高淀粉的利用率和食品生产的效益。
2. 方法与材料2.1 枯草芽孢杆菌的培养与体外筛选首先，从自然环境中分离枯草芽孢杆菌，并通过连续传代培养。
然后，制备含有淀粉的琼脂培养基，通过扩展成分筛选培养出具有较高淀粉酶活性的菌株。
2.2 淀粉酶基因的筛选与克隆采用PCR技术，从高淀粉酶活性菌株中扩增出淀粉酶基因。
将扩增的目的基因与表达载体质粒进行连接，并转化到大肠杆菌中进行蓝白斑筛选。
2.3 淀粉酶的定向进化策略通过PCR技术，在淀粉酶基因的特定区域引入随机突变。
然后，选取淀粉酶活性较高的突变体，并继续进行下一轮突变和筛选工作，最终得到活性更高的定向进化淀粉酶。
2.4 玉米粉的水解实验将定向进化淀粉酶转化到枯草芽孢杆菌中，并对其进行培养。
然后，将玉米粉加入到培养基中，利用玉米粉的水解情况评估定向进化淀粉酶对玉米粉的水解能力。
3. 结果与讨论通过筛选和定向进化，我们获得了一株具有较高淀粉酶活性的定向进化淀粉酶。
将该基因转化到枯草芽孢杆菌中，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
4. 结论本研究通过淀粉酶的定向进化，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。
这为进一步提高玉米粉的利用率和淀粉的加工效益提供了新思路。
5.通过连续传代培养和扩展成分筛选，我们成功获取了具有较高淀粉酶活性的菌株。
通过PCR技术，我们扩增出了淀粉酶基因，并成功将其连接到表达载体质粒上，并进行了蓝白斑筛选。
通过淀粉酶的定向进化策略，我们引入了随机突变，并筛选出了活性更高的突变体。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验化学与生命科学学院摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。
通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。
关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。
通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
实验材料和方法一、实验材料：（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）（二）培养基：1、种子培养液葡萄糖 1%Tryptone(胰蛋白胨)：1%,Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。
2、产淀粉酶发酵培养液玉米粉 2 .0 %黄豆饼粉1 .5%CaCl 2 0 .02 %MgSO4 0 .02%NaCl 0 .25%K2HPO4 0 .2%柠檬酸钠0 .2%硫酸铵0 .075%Na2HPO4 0 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管二、实验1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。
2、种子斜面及种子液准备– A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。
– B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。
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“生物制药技术实训”课程研究报告
项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌
一实验原理
枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。
由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。
利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。
根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。
二材料
灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。
三操作步骤
1.包平板
2.配生理盐水
3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基
4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min
5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。
取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h
6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌
7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min
8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。
9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h
10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
11. 在无菌操作下，用接种环挑取有透明圈较为明显的菌落，于载玻片上，加入生理盐水，在高倍镜下进行观察，在观察前对菌种用番红进行染色，是观察较为容易。
发现这次镜检的产淀粉酶枯草芽孢杆菌较为清晰显杆状，这次我们认定这应该是我们所需菌种。
12.对所认定的这几个培养基中的菌种进行菌种纯化，再配培养基，将菌种接种到培养基上，培养20h。
四实验结果
培养后发现无杂菌，挑取菌落镜检，发现为杆状细菌
参考文献：
[1] 张建云. α-淀粉酶原因的体外定向进化研究[D]河南农业大学, 2004
[2] 李金霞. 耐高温α-淀粉酶基因的克隆、表达及突变[D]天津科技大学, 2004 .
[3] 张强. 耐高温α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶学性质研究[D]四川大学, 2005 .
[4] 朱何东. 高温α-淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究[D]四川大学, 2006 .
[5] 杜承. 产耐高温α-淀粉酶基因工程菌的构建及酶学性质研究[D]吉林大学, 2007 .
[6] 赵子如. 古菌Sulfolobus sofaltaricus P2嗜热嗜酸淀粉酶基因的克隆和表达
[D]南京农业大学, 2006 .
生物制药0801
张静。