枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究
4种抗生素对枯草芽孢杆菌的体外联合抑菌试验
4种抗生素对枯草芽孢杆菌的体外联合抑菌试验王育娜;耿慧敏;李春歌【摘要】In order to study the combined antibacteria effect of four antibiotics on E. subtilis in vitro ,drug susceptibility tablets on the beef extract peptone agar plate were used to evaluate the drug bacteriostasis by measuring antibacterial circle diameter. Each single antibiotic drug was used as a control. The results showed that B. subtilis was middle-degree susceptible to combined use of penicillin sodium and levofloxacin hydrochloyide injection with 12. 8 mm of antibacterial circle diameter. A higher-degree susceptibility was showed to ceftriaxone sodium for injection combined with penicillin sodium or levofloxacin hydrochloyide injection, whose average antibacterial circle diameter was between 18 mm and 19 mm. The average susceptibility degree to other combinations was higher, with diameter lager than 20 mm. Not all the average antibacterial circle diameters were bigger than the four single used antibiotics.%为研究4种抗生素类药物两两混合使用对枯草芽孢杆菌的体外抑菌作用,以4种抗生素类药物单独使用作为对照,通过测量牛肉膏蛋白胨琼脂平皿上药敏片的抑菌圈直径来确定药物的抑菌作用.结果表明,青霉素钠与盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径为12.8 mm,枯草芽孢杆菌对其表现出中度敏感,注射用头孢曲松钠分别与注射用青霉素钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用的抑菌圈平均直径在18～19mm,枯草芽孢杆菌对它们表现出高度敏感,而其他组合对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径均大于20 mm,枯草芽孢杆菌对它们表现为极度敏感,但并不是所有的联合抑菌圈平均直径都大于单独使用的抑菌圈平均直径.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2012(041)008【总页数】3页(P177-179)【关键词】抗生素;联用;枯草芽孢杆菌;抑菌【作者】王育娜;耿慧敏;李春歌【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022【正文语种】中文【中图分类】S816.7枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是具有典型芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌，为嗜温、好氧、产芽孢的杆状细胞，分布广泛，易培养，抗逆性能强，且不会产生对人和动植物有害或污染环境的产物。
臭豆腐卤水中的主要发酵菌株及发酵研究
第 7 卷 第 2 期2021 年 4 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.7 No.2Apr. 2021臭豆腐卤水中的主要发酵菌株及发酵研究范博望，任翊，樊青青，周易枚，慕妮，陈丹丹*（南通市食品药品监督检验中心，江苏南通 226000）摘要：通过微生物分离纯化，对臭豆腐制造过程中的发酵菌株进行分离，并通过测序确定了其中数量最多的6种微生物。
在相同条件下，分别使用纯种菌及混合菌株进行臭豆腐发酵实验，发现单一菌株发酵所得臭豆腐感官评定结果不如混合菌株。
在纯种菌株发酵中，枯草芽孢杆菌发酵制得臭豆腐样品成色较好，风味最为浓郁。
关键词：臭豆腐；微生物分离；微生物鉴定；发酵中图分类号：TS2；R77 文献标识码：AMain Fermentation Strains of Stinky Tofu Brine and the FermentationFAN Bowang, REN Yi, FAN Qingqing, ZHOU Yimei, MU Ni, CHEN Dandan*(Nantong food and drug supervision and inspection center, Jiangsu Nantong 226000)Abstract: The microbes of stinky tofu brine was isolated,and identified by bacterial 16S rRNA identification. The results showed that the main fermentation strain was classified into Lactobacillus plantarum, Leuconostoc, Streptococcus lutetiensis, Weissella confuse, Bacillus subtilis, Kurthia gibsonii.In the same condition, single strains and multi-strains were used in the stinky tofu fermentation. Sensory evaluation results showed that the stinky tofu fermented by single strains was not as good as multi-strains . In the single strains fermentation ,the product fermented by Bacillus subtilis was better in color and flavor.Keywords: stinky tofu; microbial isolation; microbial identification; fermentation臭豆腐是我国典型发酵食品之一，富含易被人体吸收的蛋白质和氨基酸，具有很高的营养价值。
枯草芽孢杆菌的功效和作用
枯草芽抱杆菌的功效和作用芽抱杆菌是一种可形成芽抱的好氧革兰氏阳性菌，具有耐温度变化、快速复活和较强分泌酶等特点，已被越来越多地研制成微生物制剂，从而成为畜牧研究和生产中最常见的微生态制剂之O其制剂具有防病抗病、提高动物生产性能及对动物无毒无害、无残留等特点，是一种优质、高效、低残留、无污染、绿色环保的新型饲料添加剂。
枯草芽泡杆菌产品以内生泡子的形式存在，对干燥、高温、高压、氧化等不良环境的抵抗力很强。
枯草芽匏杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。
1肉鸡：在日粮中添加枯草芽抱杆菌可提高仔鸡增重，显著提高21、30、40日龄肉鸡平均日增重及肉鸡生长全期（0〜6周龄）的平均日增重。
同时可显著提高肉仔鸡饲料转化效率及生长全期（0〜6周龄）的饲料转化率。
枯草芽泡杆菌可显著提高钙、磷和粗灰分的利用率。
在较高营养水平的肉鸡日粮中使用枯草芽抱杆菌制剂可以很好地促进肉鸡生长，提高饲料转化效率和经济效益，对肉鸡胴体品质和鸡肉的营养成分无不良影响，并且可改善鸡肉氨基酸组成，提高鸡肉氨基酸总量、必需氨基酸和鲜味氨基酸含量，增加鸡肉的鲜味。
除日粮中添加之外，在肉鸡饮水中添加禽用枯草芽泡杆菌同样可提高出栏质量，提高日增质量，增加采食量，显著降低料肉比，添加0.5kg∕t的禽用枯草芽袍杆菌效果最佳。
蛋鸡：枯草芽匏杆菌制剂具有改善料蛋比、降低死淘率、显著降低鸡蛋破损率，有提高个蛋重和蛋壳厚度的趋势，且枯草芽抱杆菌制剂可显著提高日粮粗蛋白和有机物消化率。
肉鹅：在肉鹅饲料中添加250g∕t的枯草芽抱杆菌，可提高干物质和能量存留率，对肉鹅的促生长效果与5mg∕kg黄霉素相当。
肉鸭：枯草芽泡杆菌可降低肉鸭料肉比0.06~0.07,降低幅度为2.4%~2.7%；对药费成本的影响方面，不同添加量、不同试验条件变化较大，药费每羽降低0.08~0.30元，降低幅度为11.4%~40.0%o 同时，芽泡杆菌具有提高肉鸭生长速度、降低耗料及提高成活率的趋势。
中性蛋白酶在生活中应用
中性蛋白酶在生活中的应用中性蛋白酶是蛋白酶中的一种，在日常生活中应用广泛。
众所周知，蛋白酶是一种活性酶是生物体内的一种酵素（酶），通过打断肽键有效催化分解蛋白质，是一种最重要的工业酶制剂，可催化蛋白质和多肽的水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
大量使用于干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中。
目前在焙烤工业中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶和植物蛋白酶。
面包生产中使用蛋白酶能改变面筋性能，其作用形式和面包调制时力的作用及还原剂的化学反应不同。
蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。
蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。
由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵。
而中性蛋白酶是指能够在中性或弱酸、弱碱性环境中发挥作用的一类蛋白酶，最适pH 值介于6.0～7.5，能催化蛋白质肽键的水解，具有催化反应速度快、无工业污染、反应条件适应性宽等优点。
根据催化机制不同，中性蛋白酶又可分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶等四大类。
中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌发酵而来的，其用途广泛。
例如可用于动植物蛋白的水解、生产高级调味品和食品营养强化剂。
再比如，可利用各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物(骨素)、水产提取物、蛋白胨、肽等，并可研究开发一些高附加值的功能食品。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油的生产中，添加中性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质分解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂。
这是由于中性蛋白酶可以水解面团蛋白胨、肽和氨基酸，从而减弱面团的强度，使其具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰和美丽的版画。
同时还可提高产品的光泽，使饼干节清楚，结构均匀，口感清爽舒适。
中性蛋白酶还能水解大豆分离蛋白成小分子肽，大大提高了大豆分离蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分离蛋白的功能特性。
解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的区别
解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的区别介绍如下：
1.形态特征：解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，常呈短棒状或球
状。
而枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，通常呈长棒状。
2.生长条件：解淀粉芽孢杆菌适宜生长温度为30-37℃，最适生
长温度为37℃，在中性或微碱性环境中生长；而枯草芽孢杆菌适宜生长温度为25-40℃，最适生长温度为30-37℃，可以在中性、碱性或酸性环境中生长。
3.生理特性：解淀粉芽孢杆菌能够分泌淀粉酶，可分解淀粉为葡
萄糖，还能分泌蛋白酶和脂肪酶等酶类；而枯草芽孢杆菌则不能分泌淀粉酶，但具有分解纤维素和蛋白质的能力。
4.应用领域：解淀粉芽孢杆菌广泛应用于食品、制药等工业中，
可以用于酿造啤酒、酵母、干酪等；而枯草芽孢杆菌则多用于土壤修复、化学品分解和消化道疾病治疗等领域。
总之，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在形态、生长条件、生理特性和应用领域等方面存在差异。
中性蛋白酶的测定方法
中性蛋白酶的测定方法中华人民共和国行业标准（QB1805.3-93）1 主题内容与适用范围本标准规定了工业用蛋白酶制剂的技术要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存要求。
本标准适用于采用表1中的菌种，以发酵法生产经提纯制取的蛋白酶制剂。
表1类别代号生产菌酸性蛋白酶 537 宇佐美曲霉(asperigillus usamii No.537)3350 黑曲霉（asperigillus niger No.3350）中性蛋白酶 1.398 1.398为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.1.398)3942 39423为栖土曲霉(aspergillus terricola No.3942)166 166放线菌(actinomyces No.166)碱性蛋白酶 2709 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.2709)CW301 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.CW301)209 为短小芽孢杆菌(bacillus pumilus N0.209)SMJ 为嗜碱短小芽孢杆菌(alkaliphilic bacillus No.SMJ)CW302 为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.CW302)2 引用标准QB/T1803 工业酶制剂通用试验方法QB/T1803 工业酶制剂通用检验规测和标志包装、运输、贮存3 产品分类3.1 产品按形态分为固体酶和液体酶两种剂型3．2 产品按作用的pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶三种，其代号与生产菌分别见附表14 技术要求4.1 外观要求固体剂型：黄褐色粉末，无结块，无潮解现象。
液体剂型：棕褐色液体，允许有少量凝聚物中性蛋白酶活力测定方法（国家标准）1 定义1 g固体酶粉（或１ｍl液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min 水解酪素产生1 ug 酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
常用13类微生物菌种介绍
常用13类微生物菌种介绍一、枯草芽孢杆菌1、在芽孢状态下稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温，能长期耐 60℃高温，在 120 ℃温度下能存活 20 分钟以上；耐酸碱，在酸性环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击。
2、枯草芽胞杆菌以芽孢状态进入土壤中后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，并能产生大量抑菌物质，建立微生态平衡，抑制有害病原菌的生长。
3、在快速繁殖过程中，还可以产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等活性产品，能降解土壤中复杂的有机物，从而促进作物吸收，提高肥料利用率。
4、安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗菌性农药的使用，增强植物免疫力。
5、对果树、瓜类、茄果类、姜、马铃薯、麻山药、三七、人参等作物的枯黄萎病、根腐病及马铃薯晚疫病、香蕉巴拿马病等土传病害有很好的防治效果。
二、侧孢短小芽孢杆菌1、侧孢短芽孢杆菌可促进植物根部有益菌大量生长，抑制病原菌繁殖，促进植物根系生长，增强根系吸收能力，并能活化土壤养分（固氮、解磷、解钾），提高作物产量，改善品质。
2、由于侧孢短芽孢杆菌具有耐高、耐盐、耐酸碱的特点，适合工业生产（与生产复合肥条件相同）。
使用侧孢芽孢杆菌生产复合肥的无机养分可以达到30％，且可以减少氮肥施用量。
3、它的抗病能力非常强，尤其对真菌性病害和线虫病非常明显。
有“抗重茬金刚”之美誉。
4、菌种在 12 个月之内衰减率低于 20%。
三、胶冻样类芽孢杆菌1、可促进磷酸根离子和钾离子溶解，有利于矿质元素从难溶态转化为可溶态，丰富土壤中有效态的磷和钾。
2、作为植物根及微生物，它能够产生生长素、细胞分裂素等生物活性物质刺激植物生长。
3、能够产生抗生素类物质，有效降低作物病害，胶胨芽孢杆菌在作物根际形成优势菌群能够抑制病原菌生长。
4、产生大量的胞外多糖，促进土壤团粒结构形成，改善土壤质地，改良土壤。
5、以胶冻样类芽孢杆菌为主要成份的生物钾肥在缺钾土壤上对各种农作物表现出较好的增产效果。
芽孢杆菌代谢产物研究进展(479)
芽孢杆菌代谢产物研究进展方晓翠（2009123479）摘要：本文通过高效液相色谱、硅胶柱、凝胶柱、硫酸提取等方法，对芽孢杆菌代谢产物进行了定性与定量分析，测定其中的主要成分极其有效成分的作用，探究芽孢杆菌在医药、饲料、生防等各个方面的利用价值和潜在的经济效益。
本文在专业知识的基础之上，基于对芽孢杆菌属真菌研究现状的宏观了解和把握，所做出的总结性的概述。
前言：对微生物研究利用的步伐从未停止过，微生物具繁殖快、体微小、好培养等突出的优点。
因此，人类竭尽全力让微生物为己所用，为人类谋福利。
对微生物极其代谢产物几十年研究中，科研人员发现了一些具有利用前景的微生物，芽孢杆菌便是其中的一种。
芽孢杆菌属(Bacillus) 是一类好氧或兼型厌氧、可以产生抗逆性内生芽孢的杆状细菌。
多数是腐生菌,分布在植物体的表面、土壤及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学物质有强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境［8］。
芽孢杆菌中存在很多特殊功能的菌株，可产生许多种活性物质，如多肽，环肽，氨基酸，蛋白酶及香豆素等。
［7］由于具有以上特性，目前芽孢杆菌属的各类细菌已被广泛应用于工业、农业、军事、畜牧业、医学等多个领域。
正文：1.芽孢杆菌在农业方面的研究情况对于芽孢杆菌的研究利用在农业上较全面也较广泛。
农业上，主要应用芽孢杆菌产生蛋白质伴孢晶体，其作用机理主要是产生几丁质酶使鳞翅目、鞘翅目等幼虫的肠道损坏致死，还可溶解真菌细胞壁防治病害的发生［20］。
从1905年从家蚕体内分离出苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis)，到现在苏云金芽孢杆菌被制成多种生物农药。
多次实验证实，其制剂针对线虫在内的4个门、节肢动物门的9个目的生物有杀伤活性［9］。
其形成的蛋白晶体毒素（Insecticidal crystal poteins,ICPs）能够对鳞翅目（lepidoptera）、膜翅目（Ｈymenoptera）、双翅目（Ｄiptera）、鞘翅目（Ｃoleoptera）、食毛目（Ｍallophaga）、直翅目（Ｏrthoptera）等９个目５００多种害虫具有毒害作用[25]，现今已发现的具有杀虫活性的芽孢杆菌的种共有11个(见表1) [10]。
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枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究
摘要产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌在前期培养基质优化的基础上, 采用了分阶段溶氧控制策略，在5L发酵罐中进行过程控制,即在0～13 h控制溶氧为40%，13～21 h控制溶氧为50%，13 h后控制溶氧为40%。
探索分阶段溶氧对枯草芽孢杆菌发酵过程的影响。
利用单因素法对一株枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基成分进行优化，确定发酵培养基各成分最适宜配比。
最后确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/ 100 mL)：酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.3 ,CaCl2 0.3 ,F e2+0.5;最适摇瓶发酵条件为: 菌龄12h,接种量3.5 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达507.53 U/ mL, 比在其他无机盐条件下的产量都高。
此外,还进行了5 L 罐放大实验,装液量为3 L,在5 L 罐所确定的最适工艺条件下,发酵单位可达520.2 u/ mL 。
关键词：碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；液体培养基
引言碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,主要应用.于生产加酶洗涤[1] ,另外,在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化学试剂等领域也有应用。
我国在20 世纪70 年代初期就成功开发了碱性蛋白酶,并实现了工业化生产[2]。
目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL 以上,与国外先进水平相差甚远[3]。
本实验所采用的产碱性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌,其实验发酵单位为22 000 u/ mL,与国外大型酶制剂公司所报道的生产水平30 000 u/ mL 相差较大[4]。
本实验对该菌株的发酵培养基利用单因素实验确定其基本成分，选择出适合该菌株发酵的最适培养基，从而使其酶活有一定的增长,为其工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养基
1.1.1 菌种
枯草芽孢杆菌(Baci11us subti1is)由农业与生物技术学院发酵工程实验室提供。
1.1.2培养基
1.1.
2.1 种子培养基
胰蛋白胨5g, 酵母浸粉5g, 葡萄糖10g, K2HPO410g
1.1.
2.2 发酵培养基
酵母浸粉5g, 麦芽糊精20g, 柠檬酸钠3g, CaCl23g, F e2+0.5g
1.2 试剂及仪器
酪氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、棉籽饼粉、酵母浸粉、麦芽糊精、柠檬酸钠、CaCl2、K2HPO4、KCl；pH计、722 分光光度计、恒温水浴锅、离心机。
1.3 方法
1.3.1以无机盐为单因素优化发酵培养基
取牛肉膏0.5g、葡萄糖0.5g、用水定溶至150mL，pH 值自然。
将以上中的培养液分别装入6个三角瓶中（各25mL），将FeSO4 0.02% ,Fe2(SO4)3 0.02%, MgSO4、溶液分别加入到其中5个三角瓶中并标记。
灭菌，121℃高压灭菌20min。
接种
在已灭菌的六个三角瓶中接入菌种，放入振荡培养箱在37℃下培养48h，转速200r/min。
在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐成分。
1.3.2碱性蛋白酶活力的测定
取培养液于1200r/min离心15min 取上清液稀释至10和50倍，采用福林法测定蛋白酶活力[5]。
取试管7支（一支为空白对照，样品重复两次）各加入稀释的样品1mL，40℃水浴预热3min，再加入同样预热过的1%干酪素1mL，精确反应10min，加0.4mol/ L三氯乙酸2 mL终止反应，混匀水浴沉淀15 min后过滤，吸取滤液1 mL加入0.4mol/ L的 Na2CO35 mL 混匀，再加入1 mL 福林试剂摇匀置40℃水浴20min，空白测定同上，但在加干酪素之前先加
0.4mol/ L的三氯乙酸2 mL，波长下以空白为对照，用分光光度计680nm波长下测定样品的A680
酶活力单位定义为：在温度55℃ pH10.0 条件下，1min 水解酪素产生1μg 酪氨酸所需酶量定义为1 个酶活力单位，以U 表示。
样品的酶活力X(U/ml)＝A680×K×n×4/10
式中：A—样品平行实验的平均吸光度
K—吸光常数
4—反应试剂的总体积(ml)
10 —反应时间(min )
n—稀释倍数
1.3.2 根据以上发酵培养基的优化，选择有利于产酶的无机盐为主要影响因素配置发酵培养基进行发酵罐控制发酵，在发酵前要进行电机的标定，发酵罐的实消。
1.3.3 发酵到10小时后每隔2小时利用福林发测酶活。
2 结果与分析
2.1 碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线
碱性蛋白酶测定的标准曲线结果如图1 所示。
由该曲线求得线性回归方程为：
Y=89.317X-2.048，R2=0.9935,K=104.6459本法在酪氨酸浓度0～60μg/ml 范围内有良好的线性关系。
2.2 无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的影响
由图2可知无机盐离子Fe2+对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白的影响比较显著，原因是Fe2+离子是生物氧化必需的。
Fe2+离子影响了枯草芽孢杆菌菌体的生长，从而影响了枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶。
查阅文献知道Mg2+也是菌体生长的必需的无机盐离子，由图2可以看出Mg2+对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响不是很明显，这是因为Mg2+和Fe3+ 一样在配制的过程中形成了沉淀。
Fe2+有利于芽孢杆菌产碱性蛋白酶。
2.3 5L发酵罐过程控制
在摇瓶实验基础上,进行了5 L 罐中的放大实验。
接种量: 3.5 % , 温度:32 ℃,转速:300 r/ min。
对发酵过程中的菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600进行了测定,所绘发酵曲线如图3 所示。
5 L罐发酵单位最高可达507.53 U / mL 。
●--DO▲—酶活■—OD600图3发酵过程曲线
由图3可知发酵到14小时后取发酵原液测出其OD600、酶活和PH都很高。
15-21h，酶活和OD600都迅速减小，PH也在下降，这段时间中可能是由于加入了消泡剂而引起了染菌或是溶氧降低造成的结果。
22-27h，酶活一直在持续增加，PH相对减小的比较缓慢，OD600在稳定一段时间后突然增加。
28-35h，酶活开始持续降低，PH和OD600也在跟着减小。
3 讨论
采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用单因素试验确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为（g/L）酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.3 ,CaCl2
0.3 ,F e2+0.5;最适摇瓶发酵条件为: 菌龄12h,接种量3.5 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达507.53 U/ mL。
本实验采用5 L 发酵罐、装液量为3L,研究了芽孢杆菌产碱性蛋白酶的扩大培养条件。
在摇瓶水平的基础上，结合本实验室5 L 小型发酵罐具体情况和相关文献，以菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600，考察它们对碱性蛋白酶产率的影响。
结果表明，较优发酵条件是，菌体PH 6.09、粗酶液中酶活力520.2U/mL和发酵液中OD600 0.371。
查阅文献资料目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL 以上，所以本次实验的酶活是偏低的，原因主要有第一：培养条件的优化不是很合理，导致发酵罐里的菌种没有良好的生长，有的菌体因为营养不良提前死亡。
第二：加入消泡剂的用量太多，导致溶氧降低，枯草芽孢杆菌生长的不好，不产生大量的碱性蛋白酶。
参考文献：
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