20110101325程雪峰三种方法提取猪苓菌核基因组的比较

毕业论文三种提取猪苓菌核基因组方法的比较学院：农学院专业：植物检疫年级： 2011级姓名：程雪峰指导教师：胡春艳职称：讲师二〇一五年五月学士学位论文（设计）原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

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学位论文作者签名（亲笔）：年月日导师签名（亲笔）：年月日三种提取猪苓菌核基因组方法的比较摘要：通过3种方法提取山西和顺猪苓菌核DNA的比较，即试剂盒Omega Fungal DNA D3390-01提取法、CTAB法、改良的CTAB法，结果表明只有试剂盒法提取出了猪苓菌核DNA，而且方法简便，效率很好,但有一定降解。

用试剂盒法所提取的猪苓菌核DNA作为模板，进行PCR扩增，得到了清晰的扩增条带，可用于PCR等后续实验。

关键字：猪苓菌核；DNA提取；试剂盒法；CTAB法；PCRComparison of three extraction methods Polyporus sclerotium genomeAbstract: Comparing the extracted DNA Shanxi Heshun Polyporus sclerotium by three methods, The kit Omega Fungal DNA D3390-01 extraction, CTAB method, extraction method modified CTAB method, tThe results showed that only kit out Polyporus sclerotia extracted DNA, and the method is simple, good efficiency, but there is a certain degradation. Kit method Polyporus sclerotia extracted DNA as a template for PCR amplification to obtain a clear amplification bands, can be used for PCR and other follow-up experiments..Key words: sclerotia of Polyporus umbellatus; DNA extraction ;The kit Omega D3390-01 Fungal DNA; CTAB method; PCR1 前言 (1)1.1猪苓 (1)1.2菌核 (1)1.3猪苓的生长条件 (1)1.4猪苓的形态学分类 (1)1.4.1猪苓的经典分类学分类 (2)1.4.2猪苓的现代分类学研究 (2)1.5提取真菌基因组的方法 (2)2.1材料 (2)2.1.1供试菌种 (2)2.1.2实验仪器 (2)2.1.3实验试剂 (2)2.1.3.1试剂盒法所用试剂 (2)2.1.3.2 CTAB法所用试剂 (3)2.1.3.1 CTAB改良法所需试剂 (3)2.2实验方法 (3)2.2.1试剂盒法提取DNA (3)2.2.1.1实验准备 (3)2.2.1.2提取方法 (3)2.2.2 CTAB法 (4)2.2.2.1 CTAB法试剂的配置 (4)2.2.2.2实验准备 (5)2.2.2.3实验步骤 (5)2.2.3 CTAB改良法 (5)2.2.3.1 CTAB改良法试剂的配置 (5)2.2.3.2实验准备 (6)2.2.3.3实验步骤 (6)2.3 结果测定 (7)2.3.1琼脂糖核算凝胶电泳 (7)2.3.1.1实验材料 (7)2.3.1.2实验仪器 (7)2.3.1.3实验溶液及配置 (7)2.3.1.4实验步骤 (7)2.3.2 PCR扩增 (8)2.3.2.1实验材料 (8)2.3.2.2实验仪器 (8)2.3.2.3实验试剂 (8)2.3.2.4实验步骤 (8)3.1三种方法提取出基因组结果见图1-A、B、C (9)3.2 PCR扩增后的结果见图2 (10)4结论与讨论 (10)参考文献 (13)致谢 (15)程雪峰：三种提取猪苓菌核基因组方法的比较1 前言1.1猪苓猪苓，是真菌门Eumycophyta、担子菌纲Busidiomyceres、多孔菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、猪苓属Grifola、学名是Grifola umbellatus[1]。

它在我国中医药领域有着很强的药用价值，据研究表明猪苓可以促进肾排泄K+、Na+、C l-, 而抑制C a2+排泄和抑制尿草酸钙的生长与凝聚的作用, 同时表现出明显的利尿和抑制结石形成的能力，并可保护肾功能。

猪苓可应用于利尿、预防尿结石和肾衰竭[2]。

猪苓的成长要经过担孢子、菌丝体、菌核和子实体这几个阶段。

菌核生长在地下，块状，不规则，外表皮黑色,里面白色或淡黄色；菌核作为药材在我国有2000多年的历史[3]。

现代的药理证明，猪苓多糖具有抗肿瘤作用，对血红细胞的免疫功能恢复具有显著的促进作用，保肝作用，抗辐射作用，抗菌作用，治疗寻常型银屑病，治疗慢性乙型肝炎[4]。

本文旨在通过对药用真菌猪苓的提取方法的研究，以期为猪苓的提取工作进行优化。

1.2菌核真菌生长到时间，菌丝体不断分化，相互纠缠在一起形成一个颜色比较深而且很硬的菌丝体颗粒，内层为疏松组织，外层为拟薄壁组织，表皮细胞壁厚、色深、较坚硬[5]。

在形成的初期为营养组织，到一定的阶段后能行成繁殖组织，即子实体。

菌核的形状大小差别极大，小得如鼠粪，大的似人头，都很坚硬，可耐高温，低温及干燥[6]。

条件合适时萌发产生子实体。

菌核的功能主要是抵御不良环境。

当环境适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体[7]。

1.3猪苓的生长条件猪苓具有喜阴凉湿润，怕干旱的特性。

在地表温度5-25℃条件下均生长。

西北产区地表温度在17-19℃时生长很好，10℃时开始萌发，22℃时子实体开放。

华北产区平均地表温度达9.5℃时萌发，12℃左右时猪苓生长，14℃左右时新苓萌最发多，个体增长快[8]。

土壤的含水在30-50%，PH值5-7腐殖质土、砂壤土，最适合生长[9]。

1.4猪苓的形态学分类山西农业大学毕业论文（设计）1.4.1猪苓的经典分类学分类猪苓的菌核一般呈三种形态：一种分枝较少，长型，块儿状，体型大，表面很光滑，俗称“猪屎苓”；一种为不规则的球形，俗称“铁蛋猪屎苓”；另一种分枝较多，凹陷很深，体形很小，与姜的形状类似，形状很像鸡爪，俗称“鸡屎苓”[10]。

1.4.2猪苓的现代分类学研究陈文强、邓百万等人从陕西留坝取得3种不同的猪苓菌核，从中分离出了他们的营养丝，利用对其酯酶（EST）和过氧化物酶（POD）的研究和基于 rDNA 和β-tubl序列对不同形态猪苓菌核间亲缘关系的研究发现，虽然这三种猪苓形态存在很大差异，但是在进化地位上仍然同属同一个物种[11]。

1.5提取真菌基因组的方法国内外用于真核生物基因组DNA提取的方法很多，植物病原真菌基因组DNA提取主要借鉴植物基因组DNA的提取方法，常用的方法有尿素提取法、CTAB提取法、氯化苄提取法、CTAB 改良法、SDS法和试剂盒提取基因组法等[12]。

我主要参照了Guo等[13]和Saghai等[14]CTAB法，CTAB改良法和试剂盒提取基因组法进行对猪苓基因组提取，对这三种提取的方法进行比对，以得到能够提取出并快速便捷的提取出猪苓菌核基因组DNA的方法。

2.材料与方法2.1材料2.1.1供试菌种新鲜山西和顺猪苓菌核（Grifola sclerotium），山西农业大学病理实验室提供2.1.2实验仪器离心机（Centrifuge 5814R）、1.5ml离心管、数显恒温水浴锅（LKTC-B1-T HH-2）、超纯水器（PW VLTRA-PURE WATER SYSTEM）、移液枪（0.5-10ul、5-50ul、20-200ul、100-1000ul）、各种型号枪头、枪架、涡旋仪（MS2）、分析天平（BSA224S）、制冰机、计时器、烧杯、量筒、灭菌锅、研钵、热空气消毒箱（GR-240）2.1.3实验试剂2.1.3.1试剂盒法所用试剂程雪峰：三种提取猪苓菌核基因组方法的比较试剂盒Omega Fungal DNA D3390-01（EB-Buffer、WB-Buffer、Buffer FG1、Buffer FG2、Buffer FG3）、无水乙醇、异丙醇、超纯水（ddH₂O)、蒸馏水、RNA酶、液氮等。

2.1.3.2 CTAB法所用试剂Nacl、CTAB、Tris·cl、EDTA、疏基乙醇、Tris酚、异戊醇、氯仿、70%乙醇、异丙醇、TE Buffer以及超纯水、液氮。

2.1.3.1 CTAB改良法所需试剂Nacl、CTAB、Tris·cl、EDTA、疏基乙醇、Tris酚、氯仿、异戊醇、蛋白酶、RNA酶、70%乙醇、TE Buffer以及超纯水、液氮2.2实验方法2.2.1试剂盒法提取DNA2.2.1.1实验准备（1）将研钵、离心管、枪头放入灭菌锅中进行高温高压灭菌处理。

（2）将新鲜猪苓菌核外皮用蒸馏水冲洗干净，用刀片将外皮（拟薄壁组织）刮下，切成微小块状，用滤纸包好，放入热空气消毒箱中，以40℃烘干12小时。

（3）将猪苓菌核干样品至于研钵中，加入液氮进行快速研磨，直至研磨成粉状。