蛋白酶K酶活力及杂质检测方法
蛋白酶K活性单位测定proteinase K unit assay(超详细 含英文原文)
酶活力单位测定
Enzymatic Assay
蛋白酶 K
Proteinase K
（译自 SIGMA 标准方法）
2021-03-08
原理:
蛋白酶 K 活性单位测定方法
血红蛋白+H2O
蛋白酶 K
TCA 可溶性肽和氨基酸
条件：T = 37℃，pH = 7.5，A750nm，Light path = 1cm
Blank 2.5 5.00
标曲：
Std 1
Std 2 Std 3
溶液 G（L-酪氨酸标液） 0.05
0.10
0.30
溶液 H（HCl）
2.45
2.40
2.20
溶液 E（NaOH）
5.00
5.00
5.00
充分涡旋混匀。各加入 1.5 mL 溶液 F(FC）于各个管中。
Std 4 0.50 2.00 5.00
（tips：某些微量核酸测定仪也可测定，且样品量只需 1-2μL）
方法：比色法
A. 1M 磷酸钾 buffer（pH = 7.5 at 37℃） 配制方法：称取 27.2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4)溶于 190 mL 无菌水中，预热 至 37℃并置于 37℃水浴锅中，用 1M KOH 调节 PH 值至 7.5，用无菌水定容 至 200mL。
Folin, O. and Ciocalteu, V. (1927) J. Biol. Chem. 73, 627-650
样品计算:
∆A750nm Sample = A750nm Test - A750nm Standard Blank 将样品 y = ∆A750nm Sample 代入标准曲线公式，可计算出 x，即蛋白酶 K 水解 血红蛋白经蛋白酶 K 水解后释放的酪氨酸的量（单位：µmoles）。
蛋白酶K溶液(Proteinase K,20mgml)
北京雷根生物技术有限公司
蛋白酶K 溶液(Proteinase K,20mg/ml)
简介：
Proteinase K 中文名为蛋白酶K ，不含DNase ，不含RNase ，可直接用于消化各种蛋白以及常见的分子生物学、细胞生物学等相关实验，例如基因组DNA 抽提、酶的消化去除等。
酶活力:其含量>30U/mg, 在37℃以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1μM 酪氨酸Folin 阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K 的量，定义为一个单位蛋白酶K 酶活力。
有效的pH 范围为pH4.0～12.5，最佳pH 范围为pH7.5～8.0。
Leagene 蛋白酶K 的最佳反应温度为65℃，大于65℃蛋白酶K 会迅速地降解，一般采用反应50～55℃。
在0.2～1%SDS 或约10mM 尿素存在的情况下，蛋白酶K 显示更高的酶活性，常用工作浓度。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据具体实验要求操作。
2、 一般工作浓度。
注意事项：
1、根据所用缓冲液是否含有SDS 、尿素、pH 是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。
2、常用浓度的EDTA 、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl 、盐酸胍对蛋白酶K 活力影响不大。
3、应避免反复冻融，以免酶活力下降。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
编号 名称 NH0058 NH0058 Storage Proteinase K Solution(20mg/ml) 1ml 5ml -20℃
使用说明书 1份。
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述:蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。
由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。
包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。
蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。
蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。
工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。
本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。
它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。
酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。
从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。
这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。
（酸性蛋白酶537容易失活）简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。
1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml.2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5使用方法1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。
蛋白酶K检测方法
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。
该酶在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)均有活性，用于质粒或基因组 DNA、RNA的分离。
在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使 DNA游离在溶液中，随后用不同方法进行抽提，除去杂质，收集DNA。
EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。
蛋白酶K贮存液一般为10mg/ml或20mg/ml。
贮存于一20°C。
蛋白酶K溶液为无色透明，如出现沉淀就不能使用。
蛋白酶K检测方法：
吸取2mL酶液至10mL离心管中，于55度锅中2分钟。
加入2mL10g/L酪蛋白溶液，混均匀后置于55度锅中浴温5分钟。
在加入4mL0.4 mol/L三氯乙酸溶液混均匀，终止反应，静止5分钟。
快速滤纸过滤，吸取
3mL滤液置于比色皿275nm测量其吸光度数值。
测量前先用2mL相应缓冲液代替酶液进行反应后，将滤液置于275nm处凋零。
蛋白酶K活性检测方法建立
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2013年 第 38卷 第 2期
蛋白酶K活性检测方法建立
林 霖，李 淅，潘兰芳，张 宇，兰全学，杨武* (深圳市计量质量检测研究院，深圳 518131)
摘要：蛋白酶K常用于核酸提取实验中，其作用为去除基因组中的组蛋白以及去除核酸中的DNA 酶和 RNA 酶 。 目前已有许多国家标准采用分子生物学技术检测食品中的转基因成分 、 动物属 性、食源性致病菌、病毒等，其中核酸提取均需使用蛋白酶K。然而由于目前缺乏统一的蛋白酶 K活性检测标准，各个厂家均有各自的活性检测方法，其采用的底物、缓冲液、pH值、温度均 大不相同，这也导致了酶活性定义大不相同，这使得所购买的蛋白酶K酶活性不统一，间接也影 响了核酸提取的质量导致影响了检测结果。在现有国标蛋白酶活性检测标准基础上对检测方法 进行改进，使其更接近使用的条件和温度，为标准建立提供参考。 关键词：蛋白酶K；活性检测；丝氨酸蛋白酶；紫外分光光度法 中图分类号：TS 207 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0266-05
*通讯作者 收稿日期：2012-06-06 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2009BAK61B04)。 作者简介：林霖(1987—)，女，硕士，工程师，研究方向为食品生化检测。
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食品科技
2013年 第 38卷 第 2期 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
蛋白酶K家族是一个由真菌、酵母、革兰阴 性细菌分泌的细胞内肽酶，其中细菌分泌的酶有 高度的序列相似性(>55%)，由林伯氏白色念球菌
(Tritirachium album Limber)分泌的蛋白酶K是该家 族的模式蛋白[1-2]。蛋白酶K拥有典型的丝氨酸活 性位点：Asp39-His69-Ser224[3]。蛋白酶K对大多
简述蛋白酶活力测定的原理
简述蛋白酶活力测定的原理蛋白酶活力测定是一种用于评估酶分解蛋白质的能力的方法。
蛋白质是生命活动不可或缺的重要分子，然而，它们需要在体内被分解为较小的分子才能被利用。
其中，蛋白酶是一种特殊的酶，它能够将蛋白质分解为较小的肽链或氨基酸。
蛋白酶活力测定的原理主要基于蛋白质分解后的产物——氨基酸的检测。
在这个测定中，蛋白质被蛋白酶分解为氨基酸，然后这些氨基酸与一些特定的化学物质反应，产生一种有颜色的产物，这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。
通过测量溶液的吸光度，可以定量地测定蛋白酶的活力。
具体来说，测定蛋白酶活力的步骤如下：1.准备测试样品：将待测的蛋白酶与适当底物（即待分解的蛋白质）混合，置于适宜的反应条件下。
2.设定反应时间：在一定时间内，蛋白酶将底物分解为氨基酸。
为了确保反应在最佳条件下进行，需要设定一个适当的反应时间。
3.终止反应：在反应达到设定时间后，需要终止酶促反应，以便停止蛋白质的分解。
通常使用一种称为终止液的化学物质来实现这一步骤。
4.显色反应：终止液中的化学物质将与氨基酸反应，生成一种有颜色的产物。
这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。
5.吸光度测量：使用分光光度计测量溶液的吸光度。
吸光度的大小与溶液中氨基酸的浓度成正比，因此可以用来计算蛋白酶的活力。
通过这种测定方法，可以评估不同样品中蛋白酶的相对活力，并了解在不同条件下的酶促反应动力学。
这对于研究蛋白质分解过程、优化蛋白质分解反应的条件以及生物工程等领域都具有重要意义。
此外，蛋白酶活力测定也可以用于诊断和治疗某些与蛋白质分解相关的疾病，如胰腺炎等。
总之，蛋白酶活力测定的原理是基于蛋白质分解后的氨基酸形成染料，通过测量溶液的吸光度来定量测定蛋白酶活力。
这种方法在生物学、生物工程和医学等领域具有广泛的应用价值。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。
酶粉及饲料：取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1.蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。
1.2蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30℃，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。
1.3试剂1.福林试剂（已配）2.0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
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蛋白酶K酶活力及杂质检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154061-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、河北农业大学、浙江工商大学等单位共同组成。
二、目的及意义丝氨酸蛋白酶是一类裂解肽键的蛋白酶，其活性中心的亲和氨基酸为丝氨酸，它们在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。
丝氨酸蛋白酶超家族被分为胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶两个大家族，蛋白酶K（EC 3.4.21.14）属于枯草杆菌蛋白酶家族，是由林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）产生的一类主要蛋白酶。
因其能消化角蛋白（keratin），故将其称作蛋白酶K。
蛋白酶K拥有典型的丝氨酸活性位点：Asp39-His69-Ser224。
蛋白酶K具有稳定的结构、极高的酶活力和广泛的底物特异性，但偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端连接的肽键，因而被广泛应用于工业、农业和科学研究领域，也因此吸引了来自学术界、工业和农业团体的研究兴趣。
基因工程技术的发展依赖于生物技术用的一些酶类，这些酶对与基因工程技术的作用，就如同CPU对与电脑的重要性一样，它们是现代生物技术产业中用于研究和开发基因工程产品和分子生物学研究的最基础物质。
如果我国没有独立的生物技术用酶的生产体系，就不会有独立的现代化生物技术产业。
作为一个大国，我国应该建立自主的蛋白酶K生产体系，以适应生物产业的快速发展。
在政府监管中，标准的重要价值在于它架起了法律与科学之间的桥梁，提高了行政决定过程的公开性与结果的准确性，为规范和控制行政裁量权提供了工具。
目前我国在诚信制度没有健全、存在巨大经济利益诱惑的情况下，对于生物产业的监督，政府主管部门才是最有公信力和最能承担责任的。
因此，开展蛋白酶K技术标准研究是政府实施科学监管、有效监管的必要技术支撑。
通过研究制定基因工程常用蛋白酶K国家标准，有利于加快分子生物学实验的速度、提高分子生物学实验结果的可靠性和可重复性，从而提升整体分子生物学研发水平，产生广泛的社会效益。
建立我国独立自主的蛋白酶K工业系统，即可创造出可观的经济效益又能解决我国目前主要依赖国外进口蛋白酶K 的问题，突破国内生物技术酶产业发展受制于人的瓶颈。
要对所检测的产品或相关过程的特性进行符合性判定，就需要制定技术标准。
要对产品或相关过程的特性进行定量检测，就需要依据经过科学评估的、可重复的、公认的检测方法。
目前，基因工程进步如此之快，对相关的定性定量分析方法进行全面的分析方法的验证非常有必要，只有可靠稳定的系列检测方法才能得出可靠的结果，才能保障这一新兴的产业健康发展。
在我国涉及蛋白酶酶活力测定方法的现行国家标准中，提供的方法具有普适性，然而其各种参数设定范围宽，针对性差。
这就导致不同厂商的蛋白酶K酶活力单位定义不统一，从而无法对产品质量做出准确的判定，继而影响到其合理的使用。
因此，亟待系统研究并确定蛋白酶K酶活力测定体系中的各项参数，以建立蛋白酶K酶活力测定的相关标准。
目前，可用于蛋白酶K活力检测的方法很多，但到目前为止，国家尚未发布相关蛋白酶K活力检测方法的标准，这给人们使用蛋白酶K带来很大的不变，而且不同的生产厂家因其检测方法不同，故对蛋白酶K的酶活力定义也不同，使得使用者无法对不同厂家的蛋白酶K活力进行正确的评价与比较，为购买与使用带来困难。
因此，对其活性检测方法的需求也越来越迫切，蛋白酶K活性检测方法的建立，将为更多的行业使用蛋白酶K带来很大的便利。
三、标准制定原则及主要内容（一）标准编制原则标准的制定过程中采用文献调查法、专家座谈法、科学试验法等多种研究方法，方法科学先进、过程周密严谨、数据真实可信、结果明确。
本标准是为相关组织的蛋白酶K检测提供技术支撑，考虑到生产、监管等不同需求，在方法选择上，主要基于产业现状、现有成熟的技术以及试验结果验证基础确定的，因此实用性较强。
（二）标准制订主要依据1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。
2、标准编写内容参考了与蛋白酶K检测相关文献，标准参照了GB/T 6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）》第1部分总则与定义和GB/T 6379.2-2004《测量方法与结果的准确度》第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法。
3、本标准检验方法参考了GB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定-分光光度法》和SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》中的酶活力和酶活力单位的定义和检测流程，还借鉴了Sigma公司和Merk公司有关蛋白酶K酶活力测定的文件。
同时，通过系统地试验，验证了适于蛋白酶K酶活力测定的底物种类、反应体系pH值、反应温度、反应时间和酶浓度。
（三）本标准的主要内容本标准主要包括以下7个部分：（1）范围；（2）术语和定义；（3）原理；（4）仪器设备及器具；（5）主要试剂；（6）分析步骤；（7）结果分析等。
四、主要工作过程（一）组成标准起草小组根据国家标准制修订有关程序和要求，2015年10月下旬，中国标准化研究院主持召开了《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》国家标准制定研讨会。
会上，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组，会议研究讨论了《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点问题进行了深刻讨论，各单位代表就标准内容及方法选择进行了讨论。
（二）开展相关调研情况蛋白酶K酶活力及杂质检测方法标准属于生物产业领域的标准，是支撑生产方、第三方组织开展产品评价的技术依据。
起草工作小组首先针对生产和检测开展了大量的调研工作。
从满足实际检测需要出发，开展了国内外相关资料的收集和确认工作，资料的检索和信息的收集过程中，分析比较了大量的国内外文献方法。
（三）标准起草完善过程在广泛调查研究的基础上，标准起草单位组织相关技术人员对蛋白酶K酶活力及杂质检测方法标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国内外蛋白酶K酶活力及杂质检测方法的标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排，分析了通过前期的实验摸索、反复论证，确定了本标准方法设定的重要参数，开展了实际样品的检测。
然后依据GB/T 1.1—2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T 1.2—2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》等标准编制要求，对《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》标准开展了起草工作。
于2016年3月中旬，起草工作小组完成了《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》国家标准（草案）。
2016年6月，在北京组织有关单位和专家分别召开了标准草案讨论会，重点对蛋白酶K酶活力及杂质检测方法选择提出了完善建议。
同时对方法进行了验证，针对验证所出现的问题，在2016年11月11组织专家对标准逐字逐句进行了讨论完善，形成了《蛋白酶K酶活力及杂质检测方法》国家标准征求意见稿。
五、国内外研究概况通过测试蛋白酶K水解经尿素变性的血红蛋白的酶活性，显示出蛋白酶K 在pH7.5-12.0范围内都具有较高的酶活性。
目前蛋白酶K通常使用的pH范围是7.5-9.0，蛋白酶K的最适pH是8.0。
在37℃时，蛋白酶K显示出最高的活性，在20-60℃之间蛋白酶K的酶活性可保持在80%以上。
Shu-Qun Liu等人探讨了蛋白酶K在催化过程中动力学机制，提出了在蛋白酶K的催化三分子中，Asp39 和His69以及His69 和eSer224 之间静电和氢键的相互作用，使得一些在催化过程中起到不同功能的催化残基，具有不同的热动力学和取向。
之后，陶燕分别对没有底物结合的蛋白酶K和结合了肽底物AAPA的蛋白酶K进行长时间分子动力学模拟，以研究底物结合对蛋白酶K的动力学行为和分子运动特征的影响。
结果显示，在动力学模拟过程中，与底物结合的蛋白酶K比没有底物结合的蛋白酶K具有更加致密稳定的构象。
提出了大尺度的协同运动所导致的底物结合口袋动力学行为与底物的识别、结合、定位以及产物的释放相关联，发现底物结合口袋区域运动模式可以调整酶与底物之间的动态相互作用。
补充了前人的生物化学和结构生物学研究结果，从分子运动和蛋白质动力学角度阐释了蛋白酶K的催化机制。
蛋白酶K含有两个Ca2+结合位点，距离酶的活性中心有一定的距离，它们与催化机理并无直接关系，但当用EDTA去除Ca2+之后，催化活性将在6 h之内降低至原来的20%，这是由于Ca2+的去除引发了底物识别位点构象的改变。
同时Ca2+的去除会影响氯甲烷类较长肽抑制剂的结合，提高了48 h之后的自溶率，降低了蛋白酶K的热稳定性等。
蛋白酶K在抑制剂如尿素和SDS存在时仍能保持较高的稳定性。
在除去Ca2+后其剩余活性通常不足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质，所以蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA。
但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/LCa2+而不含EDTA的缓冲液。
在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA （pH8.0）至终浓度为2mmol/L，以鳌合Ca2+。
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用，苯甲基磺酰氟是一种丝氨酸蛋白酶的抑制剂，在纯化蛋白质时用于防止蛋白质的降解。
此外，Anilkumar R. Kore等人合成了一种五肽化合物，即MeOSuc-AAAPF-CH2Cl，可以抑制蛋白酶K的水解活性，浓度仅需要0.1mM。
Jürgen Bajorath等人用单肽或二肽氯甲基酮对蛋白酶K进行了处理，发现该化合物对蛋白酶K的水解起到了一定的抑制作用。
可用于蛋白酶K活力检测的方法有以下几种，每种实验方法都有各自的优缺点，实验者需根据实验要求和实验条件来选择适合的检测方法。
（1）紫外可见分光度法。
该法是以酪蛋白为底物，在一定pH和温度下反应后，用紫外可见分光光度计测定275nm处的吸光值，从而检测酶活力。
紫外分光光度计为目前国内实验室普遍拥有的仪器设备，采用紫外分光光度法检测蛋白酶K活性简单易行便于实施。
（2）福林—酚试剂法。
该法实质上是在一定温度，一定pH下，一定时间内，蛋白酶K以酪蛋白或变性血红蛋白为底物，将其水解成氨基酸，以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值，即用分光光度计测定680nm处的吸光值，从而测定蛋白酶K的酶活力。
该法操作简单，灵敏度较高，但测定中蛋白质特异性有影响，即不同的蛋白质因所含酪氨酸和色氨酸不同，显色时其强度稍有差别。