胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素_杨秀梅

第41卷第3期上海师范大学学报（自然科学版）Vol．41，No．3 2012年6月Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences）Jun．，2012胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素杨秀梅，邢国杰，徐宽，沈鹤柏，朱龙章*（上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）摘要：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析方法，建立对人绒毛膜促性腺激素的快速定量检测方法．该检测方法可以在15min内完成对HCG的定量检测，灵敏度可达25mIU/mL，线性范围25 10000mIU/mL．与人促黄体生成素（hLH）、人促甲状腺激素（hTSH）、人卵泡刺激素均无交叉反应，所建立的检测人绒毛膜促性腺激素的胶体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的人绒毛膜促性腺激素，在异位妊娠的早期诊断及过程监控中具有较为广阔的应用前景．关键词：HCG；胶体金；免疫层析；定量检测中图分类号：O648文献标识码：A文章编号：1000-5137（2012）03-0274-060前言人绒毛膜促性腺激素（human chorionicgonadotropin，HCG）是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素［1］．HCG的产生与滋养细胞的生长状况和数量有直接关系［2］，正常发育的绒毛所分泌的HCG量很大，每天的滴度不断地快速上升，每48h上升66%以上．如果HCG每2d增加的量＞66%，可以诊断为宫内妊娠；而如果增加的量＜66%，则异位妊娠或宫内孕发育不良的可能性很大［3］．HCG是妊娠时所分泌的特异性激素，可用于协助异位妊娠早期未破裂的诊断．目前较为明确的诊断方法为B超，但是在怀孕5周内B超难以发现胚芽的影像，所以寻找早期诊断异位妊娠的方法显得尤为重要．因此，本文作者试图探讨血清人绒毛膜促性腺激素检测在异位妊娠早期诊断的价值．胶体金免疫层析方法对人绒毛膜促性腺激素的定量检测的研究目前只达到半定量的水平，而本研究则实现了对人绒毛膜促性腺激素的定量检测．这弥补了胶体金免疫层析方法中无法定量的缺陷，这在医学领域将会带来一个新的突破，极具现实意义与医用价值．目前现有的胶体金免疫层析试条只能定性判断是否怀孕，而先兆流产、异位妊娠、药物引流、某些妇产科疾病、术后治疗过程等都需要对HCG指标变化进行跟踪及对HCG进行定量检测［4－5］．孕卵在子宫腔以外的任何部位着床发育，均称异位妊娠［6］．异位妊娠是妇产科常见急腹症之一，当输卵管妊娠流产或破裂时可引起腹腔内严重出血，如不能及时就诊、处理可危及生命［7］．HCG动态定量检测可作为异位妊娠随访监控指标，对早期异位妊娠的诊断具有重要意义［8］．本研究在常规早孕试纸定性检测的基础上，对原有胶体金免疫层析技术进行改进，实现了HCG的定量检测，对异位妊娠的早期诊断及过程监控具有重要的影响．1材料1．1主要材料HCG单克隆抗体、羊抗鼠二抗（上海捷宁生物科技有限公司）；硝酸纤维素膜、吸水纸、玻璃纤维购收稿日期：2011-12-21作者简介：杨秀梅（1985－），女，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；朱龙章（1956－），男，上海师范大学生命与环境科学学院教授．*通信作者第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素于美国Millipore公司；柠檬酸三钠（上海青析化工有限公司）；氯金酸（国药集团化学试剂有限公司）．1．2主要仪器HM3010单维往复划膜仪；AllegraTM64R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；金标分析仪（中国科学院上海光学精密机械研究所）．2试纸条的制备方法2．1胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法［9］制备20nm胶体金．向洗净的锥形瓶中加入98mL的超纯水，再加入1%的氯金酸2mL．将锥形瓶放在恒温搅拌器上加热至沸腾，维持加热状态并加入1%柠檬酸三钠2mL．继续煮沸10min，观察颜色变化，冷却至室温后置于4ħ冰箱待用．2．2结合垫的制备取1mL的胶体金用0．1mol/L的K2CO3溶液调节pH值到8．0 9．0，加入36μgα－HCG抗体，混匀涡旋并静置10min，加入50μL BSA（10%）溶液反应10min后，用离心机在13000r/min下离心15min，弃去上清液，沉淀物用硼酸盐缓冲溶液重悬至原体积后，再次离心弃去上清液，浓缩至原体积的1/10，4ħ保存．选用玻璃纤维作为结合垫材料，将上述制备的胶体金α－HCG抗体复合物重新分散于0．01mol/L PBS（pH=7．4，含5%蔗糖，1%BSA）中，并喷于结合垫上，37ħ烘干2h．2．3样品垫的制备选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入样品垫处理液（0．01mol/L PBS（pH=7．4），含有1% BSA，0．1%Triton X－100）中浸泡后，37ħ烘干2h备用．2．4硝酸纤维素膜（NC膜）的制备用划膜仪在NC膜的不同位置喷点α－HCG单抗及羊抗鼠IgG抗体，自下至上依次为质控线（C 线）、检测线（T线），37ħ烘干2h备用．2．5试纸条的组装将吸水纸、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC底板上，并切成4mm宽的试纸条装壳．3实验结果3．1胶体金的表征3．1．1胶体金的紫外扫描对2．1．1所制备的20nm的胶体金进行紫外扫描，测定结果见图1，从图1上可看出所制备的20nm的胶体金的最大吸收峰位于520nm处，这与文献［10］报道的一致，符合实验的要求．图120nm胶体金的紫外—可见扫描曲线572上海师范大学学报（自然科学版）2012年3．1．2用Zeta 电位分析仪对所制得的胶体金进行Zeta 电位、粒径测定对所制备的20nm 胶体金进行Zeta 电位、粒径的测定．测定结果见图2和图3．可以看出，所制备的胶体金的平均Zeta 电位是－25．0mV （图2），胶体金颗粒的平均粒径大约为20．01nm （图3）．图2胶体金的粒径分布曲线图3胶体金的Zeta 电位扫描曲线3．1．3用透射电子显微镜（TEM ）对胶体金进行扫描对所制备的20nm 的胶体金用透射电子显微镜（TEM ）对胶体金进行扫描，扫描结果见下图4，从图4中可以看出胶体金颗粒粒径在20nm 左右，而且粒径分布比较均一，形貌接近于球形，符合实验的要求．图420nm 胶体金的透射电镜图3．2胶体金免疫层析试纸条的构造图将吸水纸、NC 膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的PVC 底板上，并切成4cm 宽的试纸条，胶体金免疫层析试纸条的构造见图5．图5胶体金免疫层析试纸条构造图3．3检测结果的判读3．3．1定性检测将待测样品滴加到检测卡的加样孔中，静置15min ，观察结果．质控线和检测线均出现红色为阳性，仅质控线出现红色为阴性，质控线不显色为无效．3．3．2定量检测判定将显色后的试纸条放入金标分析仪中进行扫描，读取T /C 比值，大于判定值为阳性［11］．672第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素3．3．3定量检测重复性检测6个浓度的HCG 样品，每个浓度检测10次，并用金标分析仪扫描读取信号T /C 值．每个浓度样品10次检测的T /C 值的标准差与平均值的比值即为变异系数．3．4直观检测灵敏度评价将HCG 样品用样品处理液稀释成10、25、100、500、1000、3000、5000、8000、10000mIU /mL．如图1所示500、1000、3000、5000、8000、10000mIU /mL 为强阳性反应；25、100mIU /mL 为弱阳性反应；10mIU /mL 无阳性反应；即肉眼可观察到的最低浓度是25mIU /mL （图6）．1阴性对照；2 10HCG 样品的浓度：10、25、100、500、1000、3000、5000、8000、10000mIU /mL图6胶体金试免疫层析纸条检测HCG 结果3．5定量检测结果3．5．1HCG 标准曲线测定用金标分析仪检测不同浓度的HCG 样品，每个浓度检测3次，取3次T /C 比值的平均值．在最优实验条件下，依据检测体系中待测物浓度与金标分析仪读值T /C 比值在一定条件下呈线性关系的原理，以HCG 样品的浓度为横坐标，金标分析仪读值T /C 比值为纵坐标作图，建立胶体金检测标准曲线．当HCG 样品浓度为25 10000mIU /mL 时，HCG 的浓度与其金标分析仪读值T /C 比值之间呈良好的线性关系（图7），线性回归方程为y =0．0014x +0．6901，相关系数R 2=0．9977，线性良好．图7胶体金免疫层析试纸条检测HCG 标准品系统拟合工作曲线3．5．2试纸条检测卡重复性结果通过实验发现，同一批次的该试纸的重复性良好，可达到98%；不同批次的试纸条的重复性也可达到97%，假阳性率和假阴性率均为0．3．5．3试纸条检测卡稳定性结果经实验验证表明，该试纸条检测卡在4ħ和20ħ条件下，可保存6个月，在37ħ条件下可保存3个星期，检测结果均没有发生变化．3．6试纸条的特异性配制人促黄体生成素（hLH ）、人促甲状腺激素（hTSH ）、人卵泡刺激素（hFSH ）的抗原溶液，以处理液作为空白对照，用HCG 免疫层析试纸检测．结果显示，金标分析仪对其他常见的干扰物均未检出，说明此试纸无交叉反应现象（图8）．772上海师范大学学报（自然科学版）2012年1．空白；2．hLH；3．hTSH；4．hFSH；5．HCG图8检测结果3．7试纸的精密性取3种浓度的HCG标准品（1000、50000、80000mIU/mL）按检测方法平行测定10次，所得结果计算变异系数（CV值），分别为9．79%、8．75%、9．62%．3．8临床检测结果用试纸条检测HCG临床血清样本20份．每个浓度检测3次，取其平均值作标准曲线．定量检测结果如图9所示，得到的相关性曲线方程为y=0．0009x+1．6188，R2=0．9689，线性良好．图920例HCG血清样本检测结果4结论（1）定量检测HCG的金标免疫层析方法的建立．本研究建立了一种快速的定量检测HCG的金标免疫层析方法，此方法具有法操作简单，快速，灵敏度高等特点，克服了传统方法的很多缺点，本方法最具创新的地方就是弥补了纸层析的方法中无法定量的缺陷，利用免疫层析方法定量检测HCG的动态变化从而达到检测和用于术后复查的目的，这在医学领域将会带来一个新的突破，极具现实意义与医用价值．（2）HCG定量检测试纸条的灵敏度和线性范围．研制出的HCG定量检测试纸条的检测灵敏度为25mIU/mL，线性范围：25 10000mIU/mL；与人促黄体生成素（hLH）、人促甲状腺激（hTSH）、人卵泡刺激素（hFSH）没有交叉反应，特异性较好；精密度符合临床应用要求，具有实际应用价值．（3）HCG定量检测试纸条的优势．本研究建立了HCG的标准工作曲线，在线性范围内可以对HCG 样品进行定量检测，经检测发现HCG的浓度与T/C比值具有良好的线性关系．相比ELISA进行定量检测时存在检测时间较长的缺点，本方法可以在15min内完成一定范围内的定量检测，时间缩短3 4h，同时在准确性、重复性、稳定性等方面均比ELISA方法更具优势．872972第3期杨秀梅，邢国杰，徐宽，等：胶体金免疫层析技术定量检测人绒毛膜促性腺激素参考文献：［1］王蜜霞，刘军涛，刘儒平，等．基于化学发光磁酶免疫的HCG检测系统研究［J］．仪器仪表学报，2010，31（2）：312－316．［2］阮雅文．血清β－HCG和P联检在异位妊娠辅助诊断的价值［J］．放射免疫学杂志，2011，24（4）：466－467．［3］CONDOUS G，KIRK E，VAN C B，et al．Failing pregnancies of un-known location：a prospective evaluation of the human chorionic gonadotrophin ratio［J］．BJOG，2006，113：521－527．［4］刘军涛，郭宗慧，刘春秀，等．免疫层析试条量化检测系统研究［J］．微纳电子技术，2007，7（8）：379－382．［5］康浴霞．异位妊娠的早期实验室诊断现状［J］．内蒙古民族大学学报，2009，15（2）：123－124．［6］张平花．浅谈异位妊娠的病因及护理对策［J］．价值工程，2011，17（3）：306－308．［7］STEPHAN L，MPSTAFA A．Laparoscopic treatment of ectopic pregnancies：a one hundred cases study European Journal of Obstetrics＆Gynecology and Reproductive Biology［J］．Clinica Chimica Acta，1991，41（3）：187－190．［8］FERRIGNO D，BACCHEN G．Surgical treatment of ectopic prehnancy Best Practice＆Research Clinical Obstetrics＆Gy-naecology［J］．Clinica 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of25mIU/mL to10000mIU/mL was measured．There were no cross-reactions with other hormones，such as hLH，hTSH，Hfsh．The colloidal gold immunochromatographic assay is rapid，specif-ic，sensitive，accurate and suitable for HCG，showing good potential in the early diagnosis of ectopic pregnancy and process moni-toring．Key words：HCG；colloid gold；immunochromatographic assay；quantitative detection（责任编辑：郁慧）。