人卵子玻璃化冷冻原因及其技术在辅助生殖中的应用
人类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展
【 关键词 】 玻璃化冷冻 ； 卵细胞 ； 辅助生殖技术
卵母细胞冻存是辅助生育领域 的研究热点 之一 ， 冷冻技 术主要有程序化 冷冻及玻 璃化 冷冻 法。玻璃 化冷 冻是 一种
胞都有毒性 ， 若浓度过 高 ， 对保存 的细胞会 造成严重 的损伤 。 目前 ， 多数学 者认 为 乙二醇 （ Ｇ） Ｅ 加上 大分 子糖 类是 比较 理 想 的玻璃化溶液 的良好候选材料 。
快速冷冻技术 ， 冷冻 对象放 在冷 冻保护 剂 中 ， 细胞 脱水 将 待
及渗透性冷冻保护剂进入细胞且两者 达到平衡 后 ， 投入液 再 氮进行冷冻保存 。玻璃化冷冻可使细胞迅 速通过“ 险温度 危
２ 卵细胞玻璃化冷冻 不 同时期 的卵 细胞 对外 界环境 的敏感性 不尽 一致 。低 温会造成卵细胞透 明带 发生变 性 ， 降低 卵子 的受 精能力 ， 因 此卵子的冷冻保存成功率较低 。研究 表 明， 卵子 的玻璃化 冷 冻较常规 的程序化冷冻有较高 的存 活率和受精 率 ， 近年 来
变化小 ， 胞 可 以耐 受 ， 苏后 存 活率 及 妊 娠 率 均有 所 提 细 复
高＿ ｌ 。Ｃ ｅ ｈ ｎ等¨ 研究发 现采 用平 衡 液 的复苏后 存 活率 可
达 ９％ ， ３ 明显 高于不使用平衡 液预处 理的 ６ ％ 。同时采用单 ５
精子胞浆显微注 射 （Ｃ Ｉ 可弥 补透 明带 硬化 带来 的受 精 困 ＩＳ ） 难＿ ｌ 。可见 ， 玻璃化冷冻技术 的临 床应 用及 不断发 展 ， Ｍ 使 Ⅱ卵细胞冷冻后妊娠率及活产 出生率得到 明显提高 。
胞内冰晶的形成 ， 降低细胞损伤 ， 在人类配子、 胚胎的冷冻保存 中取 得了不少进展 。近十几年 来 ， 玻璃化冷冻技 术已 成功应用于成熟卵母细胞 、 未成熟卵母细胞等方面的冷冻保存并取得成功。该技术操作简单 、 迅速快捷 ， 正逐渐成为
新型冷冻技术
新型冷冻技术
新型冷冻技术通常是指近几十年来发展起来的在食品、医疗、科研等领域中更加高效、快速且能够保持细胞活性和产品质量的新一代冷冻方法。
以下是一些具有代表性的新型冷冻技术：
1、超低温冷冻技术：
通过使用液氮等超低温制冷剂，将温度迅速降低到-196℃或更低，实现极快的冷冻速度以减少冰晶对细胞和组织结构的损伤。
例如，在生物医学领域用于储存生物样本（如精子、卵子、胚胎）以及组织库的建立。
2、玻璃化冷冻技术：
将样品浸入高浓度的冷冻保护剂溶液中，然后在极短的时间内将其冷却至玻璃化转变温度以下，使水分来不及形成冰晶，而是进入一种无定形的玻璃态，有效防止了因冰晶生成导致的细胞损伤。
这项技术广泛应用于生殖医学中的胚胎和卵子冷冻保存。
3、高压冷冻技术：
孙大文教授团队研发的一种超高压新型冷冻技术就是其中的一个例子，这种技术通过物理场辅助，能有效抑制冷冻初期冰晶的无序生长，特别适用于水果蔬菜等农产品的快速冷冻存储，保持其新鲜度和品质。
4、脉冲冷冻技术：
利用瞬间高强度能量脉冲引发样品内部产生热量，使得样品快速降温而实现冷冻，减少冰晶形成带来的破坏作用。
5、磁场诱导冷冻技术：
利用磁场作用改变水分子结晶过程，促进均匀小冰晶形成，从而降低冷冻对细胞和组织的损害。
这些新型冷冻技术的发展极大地提高了冷冻产品的质量，扩大了冷冻技术的应用范围，并为科学研究、医疗健康、食品加工等多个行业带来了革新性的影响。
卵母细胞玻璃化冷冻复苏后成功妊娠一例
１ ． ２ 卵子冷 冻
复苏试 剂为玻 璃 化解冻 液套装 （ 产 品型号 ： Ｖ Ｔ １ ０ ２ ， 生产商 ： Ｋ Ｉ Ｔ Ａ Ｚ Ａ Ｔ Ｏ ） ， 套装中分别为 液 、 Ｄ Ｓ 液、 ＷＳ １ 液 和 ＷＳ ２液各一支 ， 卵子复苏时 ， 先将 复 苏用 Ｔ Ｓ液 预热 至 ３ ７ ℃ ，在 液氮 中去掉 载杆 的套
Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ 。
１ ． ４ 胚 胎移植
作者简介 ： 庞敏 ， 男， 副主任技师 ， 研究方向 ： Ｉ Ｖ Ｆ 实验室。 通信作者 ： 黄卫东 ， 男， 硕士 ， 研究生导师 ， 主任医师 ， 研究方 向： 生殖男科 ， Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： Ｈ ｗ ｄ ｙ ｎ ｋ ． ｃ ｏ ｉ ｎ 。
８ ３ ０ ０ ０ １ ） （ 新疆 佳 音 医院 ， 乌鲁木齐
摘 要 目的
报道卵母细胞冷冻复苏后成功妊垠—例。方法 采用疵 匕 冷冻技术冷冻卵母细胞 ２ 枚， 解冻台行单 精子卵胞浆 内 显
微注射（ Ｉ ｃ ｓ Ｉ ） ， 获得 Ｉ 级和 Ⅱ级细胞胚 各—牧 ， Ｂ超监测 下移植 。 结果 患者胚胎移植后 １ ４ ｄ ， 血 ＨＣ Ｇ７ ８ ３ ５ ｍＵ／ ｍＬ ， 显示已威劝妊 娠。结 论 卵母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 保 存 复 苏后 可 获 得 妊 娠 ， 可作 为 辅 助 生 殖 患 者 新 的 技 术 选 择 。 关 键 词 卵母 细胞 ； 玻璃化冷冻 ； 妊娠 中 图分 类 号 ： Ｒ ７ １ ４ ． ８ 文献识别码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ １ －５ １ ８ ３ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ４ —４ ４ ９ ＿ ＿ ０ ２
玻璃化冷冻人成熟卵母细胞的临床应用
（ Ｒ Ｈ， ，－ｒｐ ｎｄｏ， ｉ ａ Ｕ Ａ）＋ ．５ ｍｏ Ｌ Ｐ Ｏ １２Ｐｏ ａ ｅｉｌＳ ｍ ， Ｓ ｇ ０７ ｌ ／
文 献 标 识 码 Ａ 文 章 编 号 １０ ００—１９ （Ｏ Ｏ ０ ０ ２ ０ ４ ２ ２ Ｌ ）２— ２４～ ３
应 用 逐 渐增 多 。尽 管 如 此 ， １８ ２ ０ 自 ９ ６～ ０ ８年 仅 有
１２ ２ 玻 璃化 解 冻液 ．．
① 解 冻液 （ Ｍ）Ｈ Ｆ０ ４ Ｔ ： Ｔ １２
＋ ０ Ｓ Ｓ＋１ ０ｍｏ ＬＳ ｃｏｅ ② 稀 释 液 ． （ Ｍ一 ３％ Ｐ ． ｌ ｕ ｒｓ ； ／ １Ｄ １ ： Ｔ １２ ） Ｈ Ｆ ０ ４＋３ ％ Ｓ Ｓ＋ ． ｌＬ Ｓ ｃｏｅ ③ 稀 ０ Ｐ ０ ５ｍｏ ｕ ｒｓ ； ／
报道 如下 。
１ 材 料与方 法
复温 １ｈ 。每 次 取 ３～５枚 成 熟 卵母 细 胞 移 入 Ｅ Ｍ 中 ， ５～１ ｉ 在 ０ ｍ ｎ内迅 速将 其 转移 至 Ｖ 室 温 ） ， Ｍ（ 中
然 后在 ｌｒｎ内 将 其 装 到 载 体 上 并 投 入 液 氮 中保 ｉ ａ
存。
释液一 （ Ｍ一 ） Ｈ Ｆ ０ ４＋３ ％ Ｓ Ｓ＋０ ２ ｌＬ ２ Ｄ ２ ： Ｔ １２ ０ Ｐ ． ５ ｍｏ ／
Ｓ ｃｏｅ ④ 洗 涤 液－（ ｕ ｒｓ ； １ ＷＭ．） Ｈ Ｆ ０ ４＋ ０ Ｓ Ｓ １ ： Ｔ １２ ３ ％ Ｐ ；
⑤ 洗 涤液一（ ２ ＷＭ．）Ｈ Ｆ０ ３＋ ０ Ｓ Ｓ ２ ： Ｔ １２ ３ ％ Ｐ 。
子 而行 卵母 细胞冻 存者 或取 卵数 目超 过 ２ ０枚 ， 签 在 署 冷冻 卵子知 情 同意书下 对 多余 卵母 细胞进 行玻璃 化 冻存及 接受 冻存 卵母细胞 供 卵助孕 者 。这 些患者 均 已签署 进行 卵母 知情 同意 书 。
卵子冷冻在女性生育力保存中的作用研究进展
细胞造成致命的伤害。然而玻璃化冷冻就可 以很好 地解决这一问题。玻璃化冷冻技术的基本原理是高
浓度（ ｍ ｌ ） ４ ｏ Ｌ 的冷冻保护剂溶液［ ／ 如乙二醇（ Ｇ 、 Ｅ ） 二甲基亚砜（ Ｍ Ｏ 、 Ｄ Ｓ ）聚乙二醇 （Ｅ ） 经急速降 Ｐ Ｇ 等］ 温后 ，由液 态转化 为外形 类似 玻璃 状 的非 晶体 化 固 体状态。由于玻璃化液在低温时黏稠度变得很高而 不结晶． 形成形态不规则的玻璃样固体 ， 留了细 并保 胞内外液体正常的分子和离子分布 。避免产生冷冻 损伤。 目 前使用的玻璃化冷冻保护剂有渗透性保护 剂和非渗透性保护剂两种。渗透性保护剂通常是小
卵子 冷冻的 方法
一
Ｂ ｌ 等［ ｏｔ ｄ ］ 改变传统的含钠保护剂而使用低钠保护 剂行 卵子慢 速冷 冻 ，获 得 了 ７ ．％复苏率 及 ５％的 ４ ４ ９ 受精 率 ， 接 受胚 胎 移植 （Ｔ 的 ｌ 个 周期 中 ， ４ 在 Ｅ） １ 有 周期获得临床妊娠并分娩 ５ 个婴儿 ，而使用含钠保 护剂组 复苏 率仅 为 １．％， 未妊 娠 。 ２ ３ 且 慢速 冷冻 法需 要严格控制冷冻和解冻过程中形成的冰晶数量 ． 期 望在各因素间保持精细的平衡 。 减少冰晶造成的损 伤、 渗透压改变造成的损伤。ｅｉ ｅｉ １９— ＬｖＳｔ 等【 ｔ ］ ９９ 对 ２０ ０ ３年 ＩＦＥ Ｖ —Ｔ周 期 中多余 的 ２９０枚 卵 子 用慢 速 ０ 冷 冻一 快速 解 冻法 复 苏后 行显 微 注射 后受 精 ，结 果 获得 了 ６ ． ９ ％的存活率 ，有 ５ ． ９ ３ ％的成活卵子受精 ３
蔗糖溶液 ．卵母细胞纺锤体与染色体正常排列受到
收稿 １期 ： ０ －１１ 修 回１期 ： ０ ．７ ９ ３ ２ ８０ — ０ ０ ３ ２ ８ ． ０ ０２
玻璃化冷冻技术在辅助生殖技术中的应用
１ ， ２ 一 丙二 醇 （ Ｐ Ｒ Ｏ Ｈ ） 、甘油等 。其 具有 良好 的水溶性 ， 相 对分 子质量 小 ，能 自由穿越细 胞膜 ，细胞毒 性相对 较弱 ，能取代 细胞 内水 分 ， 通过 降低冰点 ， 减少或避免细胞 内冰 晶形成 。 非 渗透 性冷冻 保护 剂 ， 如： 蔗糖 、 聚蔗 糖 、 聚乙二 醇 ｆ Ｐ Ｅ Ｇ ） 等 。其 相 对 分 子 质量 大 ，不 能 穿 透 细胞 膜 ，通 过 渗透 效 应 促进细胞脱水 ， 降低达到玻璃化本身所需要的冷冻保护剂的
０ 引言
人类 的配子和 胚胎 的冷冻 保存 已经是 人类 辅助生 殖领 域 中一 个必 不可 少 的组成 部分 。在 过去 的几 十年 中 ， 冷冻 保存 技术 的发 展亦是 辅助 生殖技 术发展 程度 的表现 ，现在 的冷 冻 技 术 已经 可以应用 在冷冻保存精 子 、卵子和 不同时期 的胚 胎 ， 尤 其是 今年新 开展 的玻璃 化冷 冻技术 ｆ Ｖ ｉ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ３ １ ，不仅
世 界最新 医学信 息文摘 ２ ０ １ ３年第 ｌ ３卷第 ３期
・
２ பைடு நூலகம் ５
医学检验 ・
玻璃化冷 冻技 术在 辅助 生殖技术 中的应 用
张琳 琳
（ 哈尔滨市红十字 中心 医院生殖 医学 中心 ，黑龙江 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ７ ６ ）
摘要 ：玻璃化 冷冻技术是辅 助生殖领域 近几年来 开展 的一种新型胚 胎、配子及组 织冷冻的方法 ，该技 术操 作 简单、迅 速 快捷 ， 正逐 渐成 为人 类辅 助生殖技 术 中重要 的应用技术之 一。本文 简述 了玻璃化 冷冻技术在人 类辅助生殖 中应 用及 研 究进展 。 关键 词 ：胚胎冷冻 ；￣ ｔ Ｔ － ｔ － ；玻璃化冷冻技术 （ Ｖ ｉ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ；冷 冻载体 中图分类号 ：Ｒ ３ ２ １ 文献标 识码 ：Ｂ ＤＯ Ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ０ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ １ － ３ １ ４ １ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ３ ． ２ ０ ６
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景_孙志宏
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景延安大学生命科学学院(延安716000) 孙志宏 马 莉 周茂林 综述 李延清 审校 1983年Tr ounso n等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。
目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。
本文就胚胎冷冻技术基本原理、研究进展与应用前景做一综述。
1 胚胎冷冻保存原理及其损伤机制1.1 胚胎冷冻保存原理 冷冻保存(cr yo peserv ation),是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速度降至零下某一温度,对其长期保存的过程[2]。
此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,从而达到长期保存的目的。
胚胎冷冻技术是在精子冷冻保存的基础上发展起来的。
冷冻胚胎存活率是渗透压和低温损害积累结果的反映。
冷冻保护液的浓度和植冰温度之间确定最适宜的关系是保证冷冻胚胎存活的关键因素[1]。
1.2 胚胎冻存的损伤机制 胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程,冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。
正常胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中,胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶,一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤(ice damag e),另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高,造成蛋白质变性即溶液损伤(solutio n damag e),二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡。
但是,如果在胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的冷冻保护剂如甘油、DM SO、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤[3-4]。
冷冻保护剂的成分通过细胞膜进入细胞内,细胞内外冷冻保护剂和其它溶质达到平衡,同时细胞脱水形成玻璃化的凝固状态,该过程是胚胎冷冻最重要的保护机制。
解冻时,冷冻保护剂渗出细胞外,同时细胞膜必须防止水过多过快渗人细胞内,以免发生渗透性膨胀。
2 冷冻保护剂的种类极其作用机制 在胚胎冷冻和解冻过程中的适当阶段添加适当浓度的冷冻保护剂能有效地降低对细胞的损伤,科学选用冷冻保护剂在胚胎冷冻保存过程中非常重要[5]。
封闭式玻璃化冷冻载体在人类胚胎中的应用
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ３ Ｓ ｅ ｐ ； ４ ８ （ ９ ）
・１ １ ３ ３・
封 闭式玻璃 化冷冻载体在人 类胚胎中的应用
章师 平 ， 周 平， 苏 天红 ， 章志国， 邢 琼， 纪冬 梅 ， 陈蓓 丽 ， 郝 燕， 曹 云霞
４ ５ ３枚 胚胎 。 １ ． ２ 主 要仪器 体视 显微镜 （ Ｓ ＭＺ ８ ０ ０， Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ ， 日
文献标 志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ９—１ １ ３ ３— ０ ３
胚 胎冷 冻 保存 已经 成 为辅 助生殖 技 术 中的重 要
组 成 部 分 。冻 融 胚 胎 移 植 （ ｒ ｆ ｏ ｚ ｅ ｎ — ｔ ｈ ａ ｗ ｅ ｄ ｅ ｍ ｂ ｒ ｙ ｏ
ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ， Ｆ ． Ｅ Ｔ） 可 以提 高 累积成 功率 ， 并 在预 防卵 巢
过 度刺 激 、 减少 新鲜 胚 胎移 植 数 目等 方 面 起 着 重 要 作 用 。冻融 胚 胎 的复 苏 及 移 植 效 果 与 许 多 因素 有 关， 如 冷冻 技术 、 冷 冻保 护剂 、 冷 冻载 体 、 冷冻前 胚 胎 质量 、 子宫 内膜 厚 度 和 胚 龄 等 。 目前 有 许 多 关 于 冷
Ｒ ３ ２ １ ． １ 中 图分 类 号
１ ． １ 研 究对 象
选取 ２ ０ １ １年 ５月 ～７月在 我 中心
行Ｉ Ｖ Ｆ ／ Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ 新 鲜周 期助 孕并 有冷 冻 胚胎 ， 且 同年 行
Ｆ ． Ｅ Ｔ的 ２ ５ ８个 周 期 共 ６ ９ ８枚 冷 冻胚 胎 。按 照 冷 冻 载 体 的不 同分 为 ｃ ｒ ｙ ｏ ｌ ｅ ａ ｆ 组和 ｃ ｒ ｙ ｏ ｔ ｏ ｐ组 ， ｃ ｒ ｙ ｏ ｌ ｅ ａ ｆ 组 ９ ５个周 期 共 ２ ４ ５枚 胚 胎 ， ｃ ｒ ｙ ｏ ｔ ｏ ｐ组 １ ６ ３个 周 期 共
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人卵母细胞（简称卵子）冷冻保存主要用于辅助生殖技术及女性生育力保存。
尽管早在1986年澳大利亚Chen ［1］首次报道成功应用卵子慢速冷冻技术获得双胎妊娠和分娩，由于卵母细胞结构的特殊和冷冻方法技术的限制，其临床应用发展缓慢受限。
直至Kuleshova 等［2］于1999年通过玻璃化冷冻技术进行人类卵子的冻存，后续国外通过研究探索明显提高了卵子冻存解冻后临床妊娠结局［3］，近10余年其文献报道超过数千篇，其技术较为成熟，故美国生殖医学会［4］2013年提出卵母细胞冷冻保存不再属于实验研究技术，将其列为成熟的临床应用项目，其临床应用范围广泛。
国内由于多种原因，玻璃化冷冻的临床应用受到限制，开展卵子冻存的医院屈指可数，其卵子冻存的适应症主要限于取卵周期因丈夫未能够取精，另有极少数医院开展不孕妇女取卵较多人卵子玻璃化冷冻原因及其技术在辅助生殖中的应用折晶，张俊，陈士岭，张为青，罗琛，周星宇，陈薪，邱卓琳，李惠溪，吴晓敏南方医科大学南方医院生殖医学中心，广东广州510515Causes of oocyte vitrification and its value in assisted reproductive technologyZHE Jing,ZHANG Jun,CHEN Shiling,ZHANG Weiqing,LUO Chen,ZHOU Xingyu,CHEN Xin,QIU Zhuolin,LI Huixi,WU XiaominCenter for Reproductive Medicine,Department of Obstetrics and Gynecology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China摘要：目的探讨人卵子玻璃化冷冻的原因及其技术在辅助生殖中的可行性和临床应用价值。
方法回顾性研究2008年1月~2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻的26例患者共27个取卵周期，分析卵子玻璃化冷冻原因、卵子解冻后受精情况及临床妊娠结局。
结果26例患者27个取卵周期共冷冻卵子274枚，卵子冷冻原因主要包括取卵日男方精子数量及质量差无可用精子、男方处于各种疾病急性期不适宜取精及男方因各种原因未能到场取精等。
共19个周期行卵子解冻，该19个周期共冻存卵子217枚，解冻后存活176枚，卵子解冻存活率81.11%，其中131枚卵子解冻后行卵胞浆内单精子注射，正常受精98枚，正常受精率74.81%；卵裂88枚，卵裂率89.80%（88/98）；共形成可移植胚胎53枚，其中优质胚胎36枚，优质胚胎率36.73%（36/98）。
15个移植周期共移植胚胎27枚，临床妊娠率为53.33%（8/15），活产率为33.33%（5/15）。
随患者年龄增加，与<35岁组相比，≥35岁组患者卵子复苏率（82.76%vs 74.42%，P =0.211）、临床妊娠率（77.78%vs 16.67%，P =0.041）及活产率（55.56%vs 0，P =0.044）均呈下降的趋势。
结论卵子玻璃化冷冻可作为不孕夫妻取卵当日因男方因素不能提供精子患者的临床补救措施；卵子玻璃化冻融后的受精率、临床妊娠率结局良好，卵子复苏率与年龄存在相关性，女性≤35岁者冻卵能够获得满意的临床妊娠结局。
关键词：卵子；玻璃化冷冻；辅助生殖Abstract:Objective To explore the causes of oocyte vitrification and its application in assisted reproduction.Methods We retrospectively analyzed the data of 26patients with 27cycles of oocyte vitrification cryopreservation undergoing intracytoplasmic sperm injection (ICSI)and embryo transfer between January,2008and October,2018.The causes of oocyte vitrification and the outcomes of ICSI and clinical pregnancy were analyzed.Results The causes of oocytes vitrification included mainly azoospermia or severe spermatogenesis disorder of the husband,failure to obtain sperms from the husband,failure of the husband to be present on the day of oocyte retrieval and acute diseases of the husband to not allow sperm collection.A total of 274oocytes were frozen in 27oocyte retrieval cycles,and 217eggs were thawed in 19cycles with a survival rate of 81.11%(176/217).The normal fertilization rate,cleavage rate and high-quality embryo rate was 74.81%(98/131),89.80%(88/98)and 36.73%(36/98),respectively.Fifteen patients underwent embryo transfer,and the clinical pregnancy rate and live birth rate was 53.33%(8/15)and 33.33%(5/15),pared with patients below 35years of age,the patients aged above 35years had significantly lower oocyte survival rate after thawing (82.76%vs 74.42%,P =0.211),clinical pregnancy rate (77.78%vs 16.67%,P =0.041)and live birth rate (55.56%vs 0,P =0.044).Conclusions Oocytes vitrification can be used as a remedy for infertile couples who fail to provide sperms due to male factors on the day of oocyte retrieval.Vitrification of the oocytes does not significantly affect the fertilization rate or the clinical pregnancy rate.The survival rate of the thawed oocytes is related to the age of the wife,and an age younger than 35years can be optimal for achieving favorable clinical pregnancy outcomes after oocyte vitrification.Keywords:oocytes;vitrification;assisted reproductive technology收稿日期：2019-03-15基金项目：国家自然科学基金（81671524）；国家重点研发计划（2017YFC1001103）；广东省省级科技计划（2016A020218009）Supported by National Natural Science Foundation of China (81671524).作者简介：折晶，在读博士研究生，E-mail:zxrzjj8@ ；张俊，在读硕士研究生，E-mail:3121636zj@ 。
折晶、张俊共同为第一作者通信作者：陈士岭，主任医师，教授，博士导师，E-mail:chensl_92@doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.07.03J South Med Univ,2019,39(7):766-771··766将部分卵子冻存备用和冻存卵子进行生育力保存，国内有关卵子冻存的应用文献报道仅数篇［5-6］。
早期研究采用的冷冻方法为慢速冷冻法，并非目前普遍采用的玻璃化冷冻方法，故研究结果可能存在差异，近期研究虽采用玻璃化冷冻法，但未考虑患者年龄对冷冻结局的影响。
本研究采用玻璃化冷冻方法，且对不同年龄段患者进行对比分析，探讨了卵子玻璃化冷冻的最佳年龄，对卵子冷冻临床应用具有重要参考价值。
1资料和方法1.1研究对象选取2008年1月~2018年10月在南方医科大学南方医院生殖医学中心行卵子玻璃化冷冻治疗的26例患者共27个取卵周期。
卵子冷冻的原因主要包括：男方无精子症或重度生精低下，且拒绝使用供精；男方取卵当日睾丸穿刺未取到精子或所获精子为不动精子；男方取卵当日因个人特殊因素不能到达医院取精；男方因取卵前出现急症性疾病正在用药不适宜取精等。
患者夫妻双方均在告知冷冻卵子相关风险及签署知情同意书的情况下实施卵子玻璃化冷冻。
根据患者年龄分为<35岁组和≥35岁组，分析比较两组基础资料、卵子冷冻后解冻及临床妊娠结局。
1.2卵子冷冻及解冻过程1.2.1控制性超促排卵方案患者在取卵周期采用促性腺激素释放激素激动剂长方案、拮抗剂方案或自然周期（卵巢储备功能低下、卵巢低反应）行促排卵，在超声引导下行经阴道取卵术。
1.2.2卵子评价标准电子显微镜下观察卵子，若外观均匀透亮，无细胞质变色、卵细胞破裂或固缩，细胞质和透明带相连，无透明带断裂，则判断为存活卵子；若细胞质变性、变黑或固缩，或存在透明带断裂现象，则判断为受损卵子。
1.2.3卵子玻璃化冷冻患者取卵后，将卵子放于受精培养液（批号：505319，Vitro life）中，置于37℃、6%CO2培养箱中培养2h后，去除卵子外周颗粒细胞，将成熟卵子（电子显微镜下观察可见第一极体）进行玻璃化冷冻保存。