高效液相色谱

长L与tM的比值计算，即
ū = L/tM
2. 保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所 经过的时间，称为保留时间，如下图。
信 号
进样
tR
3.调整保留时间tR´ 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调 整保留时间， 即 tR´ = t R tM
由于组分在色谱柱中的保留时间 tR 包含了组分随流动相 通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间， 所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。
保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组 分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此 色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。
4.死体积V0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒 间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的 空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小 可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出 口的载气流速Fco（cm3· min-1）计算。
D J
0.607 h
t
F H
1/2 h
1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱 峰宽的一半。 2. 半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰 宽。它与标准偏差的关系为 Y1/2 = 2.354 3.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的 切线在基线上截距间的距离。它与标 准偏差的关系是 Y = 4
高效液相色谱
§6.1 概述 §6.2 色谱流出曲线及有关术语 §6.3 色谱保留值 §6.4 分离度 §6.5 液相色谱
色谱法分离原理
第一节 概述
色谱法是一种重要的分离分析 方法，它是根据组分在两相中作用 能力不同而达到分离目的的。
色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维 特(Michael Tswett)分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将 植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直 立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由 流下，结果色素中各组分互相分离形成 各种不同颜色的谱带。这种方法因此得 名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色 物质的分离，“色谱”二字虽已失去原 来的含义，但仍被人们沿用至今。
洗脱法能使样品的各组分获得良好的分离， 色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得 纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法 中最常用的一种方法。
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性 流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力 比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直 接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将 各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依 次顶替出固定相。 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先 流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲 线如下图
从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组分的最少个数； (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分 析； (iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定 量分析； (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价 色谱柱分离效能的依据； (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或 流动相）选择是否合适的依据。
迎头法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其 余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合 物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于 对混合物进行分离。
第二节
色谱流出曲线及有关术语
（一）色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图， 所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起 部分就是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在吸 附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线 （气液分配色谱）的线性范围内，则色谱 峰是对称的。
色谱峰 信 号
进样
空气峰
h a
色谱流出曲线



色谱流出曲线和色谱峰 基线（a） 峰高（h）
（四）保留值 1.死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色 谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的 时间称为死时间，它正比于色谱柱的空 隙体积，如下图。
信 进样 号
tM
因为这种物质不被固定相吸附或溶 解，故其流动速度将与流动相流动速度 相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱
色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的
依据。 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s）， 然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可 用符号表示，即 = tR (i) / tR (s)
相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又 称选择因子。
Gauss正态分布函数
4. 按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱 法、顶替法、和迎头法。 洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加 到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样 组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组 分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗 剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分 B 离。流出曲线见下图 A
亲和色谱法:亲和色谱是利用偶联于载体上亲 和配基对特定大分子的亲和作用达到大分子的 分离和纯化的。常用于蛋白质的分离。通常， 在亲和识别和结合过程中有四种非共价键合的 相互作用力存在，即范德华力、静电力、氢键 和疏水作用。
3. 按固定相的外型分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。 固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它 又可分为薄层色谱和纸色谱。
分类
气相色谱（GC） 按流动相分
液相色谱（LC）
超临界流体色谱（SFC） 吸附色谱
按机理分
分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱
柱色谱
按固定相在支持 体中的形状分
平板色谱
纸色谱 薄层色谱
按分离效率分
经典液相色谱
高效液相色谱
从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附 着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体）， 又 可 分 为 气 固 色 谱 （ GSC ） 和 气 液 色 谱 （GLC）。
第三节 色谱保留值
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，
两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的， 即与色谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽， 以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是
由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色
分配系数（ K ）是指在一定温度和压力下，组 分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓 度之比值，即
Y1 / 2 2.354
色谱流出曲线
信号
A E G 进样 O 0 O' t0 A' tr tr' 空气峰 C I Y1/2 B' Y B
D J
0.607 h
t
F H
1/2 h
区域宽度
3 峰底宽度Y 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上 的截距，即IJ的距离。Y = 4
色谱流出曲线
信号
A E G 进样 O 0 O' t0 A' tr tr' 空气峰 C I Y1/2 B' Y B
A
B
顶替法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分； 其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶 替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附 的物质后，才能再使用。
迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附 或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流 出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱 的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下 图
2.按分离机理分类
离子交换色谱法:离子交换色谱是利用被分离 物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而 使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离 子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶 剂的缓冲液。 凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法:是利用被分离 物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度 的不同，以使组分分离。常用的填料有分子 筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或 玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用 水或有机溶剂为流动相。
4 死体积V0
指色谱柱在填充后， 柱管内固定相颗粒间 所剩留的空间、色谱 仪中管路和连接头间 的空隙及检测器空间 的总和。 气相色谱：
Tc P0 Pw Fco F0 Tr P0
V0 t0 Fco
FCO-扣除饱和蒸汽压并经温度校正的流速； F0-用皂膜流量计在检测器出口实测的流速； Tr-室温(K); Tc- 色谱柱的温度(K); Pw-室温下水的蒸汽压； P0-大气压
谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动 力学两方面来研究色谱行为。
（一）分配系数K和分配比k
1.分配系数(K) 分配色谱的分离是基于样品组分在固定 相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸 附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过 程。 这种分离过程经常用样品分子在两相间 的分配来描述，而描述这种分配的参数称为 分配系数K。
信号
c0 色谱流出曲线 1 t t r 2 c exp[ ( ) ] 2 2
A E G 进样 空气峰 C I O' t0 A' tr tr' Y1/2 B' Y B
O 0
D J
0.607 h
t
F H
1/2 h
(五) 区域宽度
色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线
的重要参数之一，用于衡量柱效率及反
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ s
t
1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论；
1952 James和Martin发展了气相色谱；
1956 Van Deemter提出速率理论； 1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；
80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电 动色谱等一系列新的色谱分析方法。
在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止 不动的一相（固体或液体）称为固定相 ；自 上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为 流动相 ；装有固定相的管子（玻璃管或不锈 钢管）称为色谱柱 。 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与 固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上 的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有 差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分 在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同 的次序从固定相中流出。