Southern blotting实验
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
SOUTHERNBLOTTING实验操作流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
基因组突变的检测方法
基因组突变的检测方法随着生物技术和医学研究的迅速发展，基因组突变相关的研究越来越受到关注，因为基因组突变在某些疾病的发生中起着关键作用。
然而，检测基因组突变的方法存在困难，因为基因组大小较大，所含基因比较复杂。
在本文中，我们将探讨几种基因组突变的检测方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是目前最常用的基因组突变检测方法之一。
PCR扩增利用DNA聚合酶复制目标DNA序列，从而扩增出足够数量的生成物进行检测。
PCR扩增法有高灵敏度，可检测极小浓度的突变。
但是，由于PCR扩增法基于模板DNA，这种方法不适合检测新突变或大规模基因组突变。
二、Southern blotting法Southern blotting法利用电泳将DNA分离到一个凝胶中，然后将DNA传输到一个固体支持的膜中。
随后，在膜上通过亲体结合，将DNA变成可以检测的形式。
Southern blotting法通常用来检测从基因组DNA中特别选出的单一基因的缺陷。
三、序列特异性引物扩增法序列特异性引物扩增法是一种基于PCR扩增法的方法。
不同的是，序列特异性引物扩增法使用特异性引物对目标突变进行扩增。
这种方法使用引物的特异性将其绑定到目标DNA的位置，再进行扩增检测。
这种方法可检测最常见的核苷酸突变和小片段的缺失和插入。
四、二代测序法二代测序法是一种先进的技术，可用于检测某个个体的全基因组、外显子组等。
有了二代测序技术，我们能够对个体的突变、多态性和复杂的基因组变异进行更彻底的检测，从而检测出更多的突变位点。
五、杂合性突变分析法杂合性突变分析法是一种特殊的PCR扩增技术，可用于检测无需基于模板DNA的新突变。
这种方法利用不同标签的突变位点DNA扩增，从而识别新突变。
杂合性突变分析法对杂合性突变和新位点突变的检测十分有效，但需要临床验证。
总结选择何种检测方法应取决于所需要检测的突变类型以及检测平台的可用性和成本。
我们对五种基因组突变的检测方法进行了介绍，这些方法都有一定的优缺点。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern blot原理
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
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southern bloting
Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA 转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA 发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M 马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
（三）步骤：1、酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系30μl）ddH2O 5μl 基因组DNA（0.5μg/μl）2μl短暂离心，消除离心管内气泡，于37℃消化过夜注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
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• 将膜置于另一个托盘中，加150mlblocking solution，封闭，40min. （１０×blocking solution１：１０用 Maleic acid buffer马来酸稀释)
• 将膜置于另一个托盘中，加５０ｍｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ solution（ ５０ｍ ｌblocking solution＋５μｌ Ａｂ ） 室温下３０ｍｉｎ.（如有数张膜，则每 １０ｍｉｎ将杂交膜上下交换一下） • 再用Washing buffer洗２次，每次１５ ｍｉｎ.
7.杂交
• 预杂交，膜置于杂交袋中，只加杂交液，要赶 走气泡，杂交液数量依据膜的大小定（3.5 ml/100 cm2 membrane)，预杂交温度根据探针 和DNA结合区域的退火温度而定，一般２－ ３ｈ。 • 正式杂交，加探针(100℃，5min)，补一些杂 交液，同样要赶气泡，置于杂交炉一定的杂交 温度(42℃）过夜。
• （7）、压片、显影、洗片。
3.将DNA转移到固定相支持物上的方法
•
• （1）、毛细管转移，本法由Southern发明，故又称为 Southern转移，该法的优点是简单，不需要其他仪器， 确定是转移时长，转移后杂交信号弱； • （2）、电泳转移，将DNA变性后，可电泳转移到硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜上，该法不需要脱嘌呤，可直接转移 较大片段的DNA，不过需要电流量 较大，温度难以控制； • （3）、真空转移，有多种真空转移的商品化仪器，他们 一般是将硝酸纤维素滤膜或尼龙膜放在真空室上的多空 屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的贮液槽中 留下，洗脱凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。该法快 速，缺点是如不小心，凝胶易碎，并且洗膜不严格时， 显影背景会比较深。
5.DNA的转移与固定
酶切好的基因组电泳 • 0.25M HCl至溴酚兰变黄
• • 蒸馏水 1洗一下 蒸馏水洗
• 变形液（0.5MNaOH，1MNaCl）至溴酚兰变蓝
• 中和液（0.5MTris-HCl，3MNaCl，PH 7.4） 15min*2次 • DNA转移
6.DNA交联
• DNA转移好的膜经过高温交联１２０℃，３ ０ｉｎ或者紫外交联18ｍｉｎ，每次 6min，3次，使DNA充分结合到膜上。
8.洗膜及显影
• 取出杂交膜，置于塑料饭盒内，先用２×ＳＳ Ｃ ０.１％SDS洗一下，30min. • ２×ＳＳＣ 30min. ０.１％SDS 摇床 ３７ ℃ ２次，
• ０.１×ＳＳＣ 每次15min。
０.１％SDS
６５ ℃
• 将膜置于白色托盘内，室温下Washing buffer洗２次，每次15min.
Southern blotting
1.Southern blotting简介 • Southern 1975年提出了DNA转移技术进行基因组 DNA特定序列定位，就是用一种或者多种限制酶 消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分 离所得片段，随后使DNA在原位变性，并从凝胶 转移到一固相支持体（通常是硝酸纤维素滤膜或 尼龙膜）上，DNA转移的过程中，各个DNA片段 的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA或者 RNA与膜上的DNA杂交，经放射自显影确定与探 针互补的电泳条带的位置，这个试验方法就称为 Southern blotting。
• ４０－５０ｍｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎ buffer 室温静止浸泡５分钟. • • 取出膜，将膜上有DNA黏附面加CDP-Star， 膜上不要有气泡，然后避光５ｍｉｎ后，将膜 上的液体挤干净，封口，压片置于Ｘ光片夹.
• Ｘ光片夹室温一般不超过２４ｈ，洗片，显影 ２ｍｉｎ，定影２ｍｉｎ，水洗. • 根据杂交信号进行结果分析
4.探针的制备
• 反应体系：1μg模板DNA（制作探针的模板）+高压灭菌 ddh2o至终体积为16μL
• 沸水域10min，使DNA变性后迅速放冰水中制冷
• GIG-hig-brime混合物加4μL至变性DNA中，震荡摇匀， 37℃，1h-20h期间产生的探针量不同 • 2μL0.2M的EDTA（ph 8.0）终止反应，或者加热65 ℃10min终止反应
2.Southern
blotting的大体步骤：
• （１）、酶切DNA，凝胶分离个酶切片段，然后使 DNA原位变性； • （2）、将DNA片段转移到固相支持物（通常是硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜）上； • （3）、交联反应，使得DNA结合到膜上； • （4）、预杂交，一般2-3h，掩盖滤膜上的非特性位点； • （5）、正式杂交，一般要过夜，让探针与同源DNA充 分杂交； • （6）、洗膜，洗去膜上非特异性结合的探针；