Northern blotting
Northern blotting
⑧转膜结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜 在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。
（三）核酸分子固定
烘烤：将膜夹在两张滤纸之间，80℃真空烘 烤2小时。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保 存备用。 紫外光固定：将膜携带RNA的一面暴露置于UV 交联仪中，UV照射自动交联
（四）核酸分子杂交
2.杂交： 将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加 入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
3.洗膜： ① 倾去杂交液。 ② 2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。 ③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
（五）杂交信号的检测
放射自显影
将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用 薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。
Northern blotting：
优点：传统、经典的方法，更为直接可信；能够反映mRNA丰度 ，还可以检测不同的剪切体；在杂交实验中，DNA-RNA，RNARNA这两种杂交双链的稳定性高于DNA-DNA双链，因此检测 RNA靶要比检测DNA靶在严谨性上要高很多 缺点：操作较为复杂，可能需要用到同位素；实验需要的RNA量 较大，对一些少量和痕量样品较难实现。
利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活 性在切口处将旧链从5末端逐步切除 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的 DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末 端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷 酸掺入到新的DNA链中
定义：来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补 形成异源双螺旋分子。可分为DNA/DNA、RNA/RNA、 DNA/RNA之间的杂交。 探针类型：
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
展开
编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
miRNA的常用检测方法研究
miRNA的常用检测方法研究1.原位杂交（in situ hybridization）原位杂交技术是一种广泛应用于miRNA检测的方法。
该技术基于miRNA和其互补的探针（probe）间的互补配对，通过观察上调或下调的信号强度来判断miRNA的存在及相对表达量。
此方法可能不如其他技术在定量方面准确。
2.RT-qPCR实时荧光定量PCR（RT-qPCR）被广泛应用于miRNA检测。
该方法通过引物探针的设计，特异性的扩增目标miRNA，利用荧光信号实现高灵敏度、高特异性和低误差的miRNA检测。
此方法可以获得很高的检测精度和速度，但是相对于其他技术成本较高。
3.Northern blottingNorthern blot是一种利用RNA凝胶电泳、转移和探针杂交检测RNA分子量、丰度及空间分布的方法。
该方法适用于测定miRNA的大小，但是灵敏度较低，需要较大的miRNA数量才能获得可靠的结果。
因此其在miRNA检测中的使用较少。
4.MicroarraymiRNA microarray是一种同时检测大量miRNA在样品中存在与否和表达量的方法。
它通过载入大量的探针来检测miRNA，具有高通量和快速的检测速度。
但是由于探针的种类、长度和相互竞争存在的问题，其实验结果的可重复性和准确性容易受到影响。
5.Next-generation sequencing随着测序技术的发展，高通量测序技术也被应用于miRNA的检测分析。
该方法通过高速测序技术，直接测定miRNA的序列和表达量，具有高度准确性和可重复性。
与其他方法相比，其天然的多样性和广泛性也是其独特优势之一。
但是其数据量大、需较长时间的数据处理和计算，并且实验成本相对较高。
总之，miRNA检测技术各有优劣，不同方法的选择应视具体的实验需求而定。
现阶段综合应用多种技术进行miRNA检测，在不同的研究环节中互补和交叉验证，是对miRNA检测更好的选择。
Northern印迹杂交技术PPT教案学习
3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。
1000r/min 15min、 去上清 、乙醇洗
-20 涤、真 ℃、 空干燥 2 h 、TE溶解
洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
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5.酶联免疫染色
室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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、-20°C 备用。
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4.杂交
将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
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倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。
Northern印迹杂交技术
5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
印迹法的基本原理及应用
印迹法的基本原理及应用印迹法的基本原理及应用印迹法(blotting)即转移电泳，是20世纪70年代发展起来的一种新方法。
Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNA-RNA 杂交法，称作Southern 印迹法。
1977年Alwine等把此方法应用到RNA的研究方面，称作Nouthern印迹法。
1979年Towbin等则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称作Western印迹法。
1982年Reinhart报道的双向蛋白质印迹法，称作Eastern印迹法。
目前，有人把Southern，Nouthern，Western印迹法分别称作DNA印迹法，RNA印迹法和蛋白质印迹法。
而每一种印迹法又可以分为斑点印迹法和电泳转移印迹法。
前者是将样品直接吸附于固相载体上，而后者则是将样品先经过电泳后在转移到固相载体表面上，其余操作基本相同。
由于核酸和蛋白质等大分子物质印迹到固相载体，容易和各种探针发生化学或免疫反应，因而对检测样品(尤其是粗样品)中某些组分的理化性质是有益的。
其操作过程所需的试剂量少，灵敏度高，所以应用较为普遍。
印迹法的基本原理(一)概念1．探针用化学方法将有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P)，或荧光物质(如异硫氰荧光素、地高辛等)结合成的复合物称作探针。
2．固相载体即用于吸附生命大分子物质的固体材料。
这类材料有硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，尼龙膜(nylon-membranes，NDM)，重氮苄氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether，DPT)纸等。
最常用的是孔径为0．45／lm 的NC膜，因为它成本低廉，结合力强，背景较清晰。
而对于检测核酸和酸性蛋白质来说，理想载体是带正电的尼龙膜，它与负电荷物质结合力很强，操作亦简单。
但因为其与负离子型染料也易结合，背景值高，故使用受到一些限制。
8.7印迹法
3、DNA探针：
由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成 cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的c 酶切及纯化该cDNA片段即可。也可利用反向技术制备，即以mRNA 为模板逆转录合成第一链cDNA，然后加入一对相应于目的序列两 端的PCR引物进行PCR扩增，再电泳分离、纯化，即可得到特定的 cDNA片段。 优点 双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比 寡核苷酸探针高，杂交信号强。 缺点 由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现 象。
4、RNA探针：
以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合 酶于体外转录而成。 优点 ①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。 ②单链，不存在变性和自我复性。 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而 使本底降低。 缺点 RNA容易降解。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与 对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记 的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显 影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的 表达。
抗原 一抗
标记
二抗
2、固相膜种类 1）硝酸纤维素膜（NC膜）
ห้องสมุดไป่ตู้
与蛋白质可能是通过疏水作用非共价结合。使 用时不需要活化，在p H8.0时，蛋白质比较容 易吸附于膜上。 问题是小分子量的蛋白质与NC膜的结合力较 差。
2）电转移法
这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电 极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方 向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结 合到NC膜上。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
Northern Blotting 操作指南
Northern Blotting 实验操作指南一．实验材料准备：(一).试剂盒提供注：2.如果试剂中有沉淀出现，属于正常情况，请于37℃水浴溶解，并摇匀。
3.一般情况下，试剂盒中的试剂保质期为6个月，如果温度控制合适，RNaseZap能够保质一年。
（二）.自己准备1．General laboratory supplies。
a．Nuclease-free water (用于溶解琼脂糖，稀释running buffer到合适的工作浓度)1).在双蒸去离子水中加入DEPC，使终浓度达到0.1%，(例如，1L双蒸去离子水中加入1mlDEPC)2).反复摇晃均匀，于37℃－42℃温度条件下孵育数小时或过夜也可。
3).高温高压灭菌至少45min，这样DEPC的气味应该可以完全除去或大部分除去。
b.聚丙烯小离心管，1.5ml或0.65ml规格。
c.移液枪，各种规格的枪头。
d.一次性手套e.杂交膜（例如：Whatman 3MM）f.刮胡刀，解剖刀片或剪刀g.EB（Ethidium bromide）h.塑料包装袋i.纸巾j.搪瓷托盘k.吸水纸l.切纸刀m.尺子n.铅笔2.RNA 电泳装置a．水平电泳槽，相应的梳子，制胶盘b．电泳仪3．转印与杂交的试验材料a．尼龙膜（推荐使用Ambion公司的BrightStar-Plus membranes, 可以最大限度的降低背景的影响，还可以增强杂交信号。
）b．杂交管和杂交炉c．密封袋d．紫外灯（用于RNA的交联）4．探针的准备（参见探针制备试验protocol）一．制胶和点样：1．称取1.5克琼脂粉加入135mL0.1%的DEPC水。
2．在微波炉中加热溶解，开始时胶温度很高，取1mL封住胶槽的两边，用手按住挡板，直至其凝固，待剩余的胶温度下降后，加入15mL 10×Denauring Gel Buffer(试剂盒中有)，混匀，然后将胶全部加到胶槽中，胶厚度为0.8-1cm。
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Transfer system for Northern blot analysis
核酸分子杂交
定义: 两条来源不同， 定义: 两条来源不同，但具有互补序列的核 酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体 这个过程即为杂交。 ，这个过程即为杂交。 是指带有标记的、已知碱基序列， 核酸探针 是指带有标记的、已知碱基序列， 能与特定的靶分子发生相互作用的DNA DNA或 能与特定的靶分子发生相互作用的DNA或 RNA片段 片段。 RNA片段。
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号
（一）RNA的提取及质量检测 RNA的提取及质量检测
RNA的提取 RNA的提取 紫外吸收检测RNA RNA的纯度和浓度 紫外吸收检测RNA的纯度和浓度 1.取RNA样品5ul，用水稀释50 100倍 样品5ul 501.取RNA样品5ul，用水稀释50-100倍，转入分 光光度计的石英比色杯中。 光光度计的石英比色杯中。 2.在260nm和280nm分别读出样品OD值 分别读出样品OD 2.在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据 260nm时RNA浓度=OD260×40ug/ml× 浓度=OD260 260nm时RNA浓度=OD260×40ug/ml×稀释 倍数。 倍数。 3.若 OD280小于 说明可能有DNA 小于2 3.若OD260/ OD280小于2，说明可能有DNA 片段污染，可用无Rnase Dnase处理样品 Rnase的 处理样品。 片段污染，可用无Rnase的Dnase处理样品。
T4噬菌体多 苷酸激酶催 化
端标记法（ DNA聚合酶 （2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片 端标记法 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片 段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有 →3 DNA聚合酶 片段有5 →3’DNA 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3 DNA 聚合酶和微弱的3 →5 外切酶活性，但无5 →3 →5’外切酶活性 →3’外 聚合酶和微弱的3’→5 外切酶活性，但无5’→3 外 切酶活性。对残缺3 末端可进行标记 末端可进行标记。 切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。
RNA印迹技术 印迹技术 (Northern blotting)
2010.03.28
Northern blot 印迹杂交原理示意图
核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 核酸分子杂交（固相杂交）
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化RNA片段 分离、变性、转移、固化RNA片段 RNA 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
3、末端标记法
末端标记法是将标记物导入线型DNA或 末端标记法是将标记物导入线型DNA或 DNA RNA的 端或 端的一类标记法 端或3 端的一类标记法。 RNA的5’端或3’端的一类标记法。 5’端标记法 端标记法 3’端标记法 端标记法
端标记法（ 噬菌体多苷酸激酶） （1）5’端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶） 端标记法 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5 末 DNA双链分子或RNA单链 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末 端的磷酸基团，使其成为5 -OH，然后在（ 端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P ATP存在下 存在下， 噬菌体多苷酸激酶催化， ）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ 转移到DNA RNA分子的 -OH末端 DNA或 分子的5 末端， 位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使 DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。 DNA片段或RNA或寡核苷酸5 端均带 标记。 片段或RNA或寡核苷酸
核酸探针的类型
基因组DNA DNA探针 （1）基因组DNA探针 :为某一基因的全部或部 分序列，或某一非编码序列。 分序列，或某一非编码序列。 DNA探针 探针: mRNA为模板经逆转录酶催 （2）c DNA探针:以mRNA为模板经逆转录酶催 化产生的互补于mRNA DNA链 mRNA的 化产生的互补于mRNA的DNA链。 RNA探针 探针: DNA两条链中的任意一条为模 （3）RNA探针:以DNA两条链中的任意一条为模 板转录生成RNA 具高杂交效率， RNA。 板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降 解和标记方法复杂。 解和标记方法复杂。 （4）寡核苷酸探针
非放射性标记物:常用的有地高辛（ 2. 非放射性标记物:常用的有地高辛（
digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、 ）、荧光 digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光 ）、生物素 素。 特点： 特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染
（四）杂交
1、预杂交 目的： （1）目的：减少非特异性杂交 预杂交液： SSC、 Denhard氏溶液 （2）预杂交液：6×SSC、5×Denhard氏溶液 聚蔗糖5g 聚乙烯吡咯烷酮5g 5g， 5g， 5g加水 加水500ml (聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g， BSA 5g加水500ml) 0.5%SDS、100ug/L变性的鲑精DNA 0.5%SDS、100ug/L变性的鲑精DNA 变性的鲑精 将预杂交液在杂交炉中68℃预热， 68℃预热 将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使 未溶解的物质溶解。 未溶解的物质溶解。 将膜置于装有预杂交液的杂交袋中（10ml预 将膜置于装有预杂交液的杂交袋中（10ml预 杂交液/100cm 封好杂交袋， 42℃预 杂交液/100cm2膜） ，封好杂交袋， 42℃预 杂交4h 4h。 杂交4h
探针的标记
）、放射性标记物 （一）、放射性标记物
1.放射性标记物: 1.放射性标记物:常用的有32P、3H、35S 等放射性同 放射性标记物 位素。 位素。 特点： 特点： 放射自显影技术检测， 放射自显影技术检测，信号的强弱通过计数银 粒的多少易于进行定量分析。 粒的多少易于进行定量分析。 主要缺点： 主要缺点： 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用
RNA琼脂糖凝胶电泳 RNA琼脂糖凝胶电泳
（三）RNA的转膜 RNA的转膜
电泳后， 电泳后，用1×MOPS缓冲液淋洗凝胶并将凝胶浸 MOPS缓冲液淋洗凝胶并将凝胶浸 泡于10 SSC中 10× 泡于10×SSC中。 切去凝胶的无用部分并测量尺寸。 切去凝胶的无用部分并测量尺寸。将一张硝酸纤 维素膜浸入水中，然后放入10 SSC中 10× 维素膜浸入水中，然后放入10×SSC中。 将硝酸纤维素膜放入20 SSC中 20× 20× 将硝酸纤维素膜放入20×SSC中，用20ml 20×SSC 浸泡印迹垫的底部。 浸泡印迹垫的底部。 进行印迹，不能留有气泡。 进行印迹，不能留有气泡。 印迹的原理为高盐溶液运输单链多核苷酸至滤膜 微毛细管转移过程中， 上，微毛细管转移过程中，核酸与滤膜发生牢固 的非共价结合。 的非共价结合。
2、杂交 100℃煮沸 10～15分钟 分钟， 将标记好的探针于 100℃煮沸 10～15分钟， 10分钟 分钟。 立即放冰浴冷却 10分钟。用杂交液稀释成所 需浓度。 需浓度。 将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 新鲜 将杂交袋中预杂交液倒出， Hyb杂交液 65℃预热 杂交液（ 预热， 的 Hyb杂交液（65℃预热，已加入变性的探 针)，小心排尽气泡，封口，放 65℃水浴振荡 小心排尽气泡，封口， 65℃水浴振荡 杂交过夜。 杂交过夜。
பைடு நூலகம்
（一）RNA的变性电泳 RNA的变性电泳
原理：RNA的二级结构使得RNA不能严格按 原理：RNA的二级结构使得RNA不能严格按 的二级结构使得RNA 照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离， 照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离， 所以进行RNA电泳时，RNA必须经过变性剂 RNA电泳时 所以进行RNA电泳时，RNA必须经过变性剂 处理使二级结构解体， 处理使二级结构解体，泳动时才能按分子质 量大小分离。 量大小分离。
）、探针的标记方法 （二）、探针的标记方法
随机引物法（ priming） 1、随机引物法（random priming） 利用DNA DNA聚合酶来合成与模板互补的新 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新 DNA链 的DNA链。 寡核苷酸片段与已变性的DNA DNA单链 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链 RNA模板退火 模板退火， 或RNA模板退火，使该片段随机互补结合 在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I DNA聚合酶 在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下 以同位素标记的dNTP 片段作用下， Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP 为原料，寡核苷酸为引物的3’ OH端开始 3’为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始 5’至3’方向 方向， 沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新 DNA链 DNA链。
2、切口平移法 DNA酶 DNA双链上随机切开若干切口 胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口 切口处形成3’ OH末端 3’末端。 ，切口处形成3’-OH末端。 大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， 以另一条DNA链为模板。 DNA链为模板 以另一条DNA链为模板。 种三磷酸脱氧核苷酸为原料， 4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解 5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同 端核苷酸和3’ 5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同 时进行，切口平行推移。 时进行，切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。 生成的两条链都被同位素均匀标记。
试剂：10× 3- 吗啉-丙磺酸； 试剂：10×MOPS(0.2mol/L 3-N-吗啉-丙磺酸； 醋酸钠； EDTA）、RNA上样 ）、RNA 0.05mol/L 醋酸钠； 0.01mol/L EDTA）、RNA上样 缓冲液（去离子甲酰胺0.72ml 10× 0.72ml； 0.16ml； 缓冲液（去离子甲酰胺0.72ml；10×MOPS 0.16ml； 37%甲醛0.26ml；0.1%DEPC水0.18ml；80%甘油0.1ml 37%甲醛0.26ml；0.1%DEPC水0.18ml；80%甘油0.1ml 甲醛0.26ml 甘油 饱和溴酚蓝0.08ml 琼脂糖、37%甲醛琼脂糖 0.08ml、 甲醛琼脂糖。 ；饱和溴酚蓝0.08ml、琼脂糖、37%甲醛琼脂糖。