第五章 体内药物分析
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药物分析05体内药物分析
第五章 体内药物分析
主讲: 秦大伟
药物分析
第五章 体内药物分析
体内药物分析 定义
体内药物分析是指体内样品（生物体液、器 官或组织）中药物及其代谢或内源性生物活 性物质的定量分析。
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第五章 体内药物分析
分析意义
与体内药代动力学研究和临床 治疗药物监测密切相关，直接 关系到药物的体内作用机制探 讨与质量评价和药物临床使用 的安全、有效与合理。
全血/血浆，组织
(1)蛋白沉淀 (2)调节pH 选择性溶剂提取 RIA
化学衍生化(提取烃基化)
碱回提
残渣
酸回提
HPLC UV、FLD、ECD
TLC
分光光度法 UV、FLD
GC
FID ECD N/P-FID GC-MS
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预处理的目的 使待测药物游离 满足测定方法要求
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组织样品
药物在组织中的分布提供重要 的体内动力学过程
组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制 成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。 组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、 三氯乙酸沉淀。 酸、碱水解：将组织水解掉 酶水解：应用酶将组织水解掉 其它：头发等
用水冲洗——活化 上样 用水或缓冲液冲洗，洗去 内源性物质 有机溶剂洗脱药物 收集洗脱液··· ···
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方法好 价格贵
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固相萃取 具体步骤
①固相选择 样品1ml 1ml规格固相 1~25ml 3ml规格固相 ②固相处理 反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态 ③上样
主讲: 秦大伟
药物分析
第五章 体内药物分析
体内药物分析 定义
体内药物分析是指体内样品（生物体液、器 官或组织）中药物及其代谢或内源性生物活 性物质的定量分析。
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第五章 体内药物分析
分析意义
与体内药代动力学研究和临床 治疗药物监测密切相关，直接 关系到药物的体内作用机制探 讨与质量评价和药物临床使用 的安全、有效与合理。
全血/血浆，组织
(1)蛋白沉淀 (2)调节pH 选择性溶剂提取 RIA
化学衍生化(提取烃基化)
碱回提
残渣
酸回提
HPLC UV、FLD、ECD
TLC
分光光度法 UV、FLD
GC
FID ECD N/P-FID GC-MS
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预处理的目的 使待测药物游离 满足测定方法要求
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组织样品
药物在组织中的分布提供重要 的体内动力学过程
组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制 成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。 组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、 三氯乙酸沉淀。 酸、碱水解：将组织水解掉 酶水解：应用酶将组织水解掉 其它：头发等
用水冲洗——活化 上样 用水或缓冲液冲洗，洗去 内源性物质 有机溶剂洗脱药物 收集洗脱液··· ···
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方法好 价格贵
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固相萃取 具体步骤
①固相选择 样品1ml 1ml规格固相 1~25ml 3ml规格固相 ②固相处理 反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态 ③上样
体内药物分析
性和分析目的， 选择合适的分析方法进行分 析。
数据分析和解释
通过统计学和模型建立等方 法，对分析结果进行解释和 评估。
体内药物分析的未来发展趋势
随着技术的不断进步，体内药物分析将更加精准和高效。人工智能和大数据分析将在药物研发和个体化 用药中起到重要作用。
结论和总结
体内药物分析是现代药物研发和临床实践中不可或缺的一部分。通过准确评 估药物的代谢和药代动力学，可以实现个体化治疗和提高治疗效果。
常用的体内药物分析方法
液相色谱法
通过分离和测定药物成分，快速和准确地分析 药物浓度。
质谱法
通过分析药物的质谱图谱，检测药物的代谢产物。
免疫分析法
利用抗体和抗原的特异性反应，检测药物的含 量和浓度。
药动学分析
通过建立数学模型，研究药物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄。
体内药物分析的应用领域
1
药物研发
体内药物分析
体内药物分析是研究药物在人体内的分布、代谢和排泄的过程。它在制药行 业和临床实践中起着至关重要的作用。
药物分析的定义
分析药物成分
通过分离和定量测量药物的化学成分，确定 药物的纯度和质量。
检测药物浓度
测定血浆或尿液中的药物浓度，评估药物的 吸收、分布和排泄。
研究药物代谢
追踪和测量药物在体内的转化和代谢途径， 了解药物的药代动力学。
监测治疗效果
评估药物治疗效果和安全性，为个体化用药 提供依据。
体内药物分析的重要性
1 个体差异
不同个体对药物的代谢和反应有所不同，体内药物分析可以实现个性化治疗。
2 疗效优化
通过监测药物浓度，调整剂量和给药方案，最大限度地发挥药物疗效。
3 安全性评估
数据分析和解释
通过统计学和模型建立等方 法，对分析结果进行解释和 评估。
体内药物分析的未来发展趋势
随着技术的不断进步，体内药物分析将更加精准和高效。人工智能和大数据分析将在药物研发和个体化 用药中起到重要作用。
结论和总结
体内药物分析是现代药物研发和临床实践中不可或缺的一部分。通过准确评 估药物的代谢和药代动力学，可以实现个体化治疗和提高治疗效果。
常用的体内药物分析方法
液相色谱法
通过分离和测定药物成分，快速和准确地分析 药物浓度。
质谱法
通过分析药物的质谱图谱，检测药物的代谢产物。
免疫分析法
利用抗体和抗原的特异性反应，检测药物的含 量和浓度。
药动学分析
通过建立数学模型，研究药物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄。
体内药物分析的应用领域
1
药物研发
体内药物分析
体内药物分析是研究药物在人体内的分布、代谢和排泄的过程。它在制药行 业和临床实践中起着至关重要的作用。
药物分析的定义
分析药物成分
通过分离和定量测量药物的化学成分，确定 药物的纯度和质量。
检测药物浓度
测定血浆或尿液中的药物浓度，评估药物的 吸收、分布和排泄。
研究药物代谢
追踪和测量药物在体内的转化和代谢途径， 了解药物的药代动力学。
监测治疗效果
评估药物治疗效果和安全性，为个体化用药 提供依据。
体内药物分析的重要性
1 个体差异
不同个体对药物的代谢和反应有所不同，体内药物分析可以实现个性化治疗。
2 疗效优化
通过监测药物浓度，调整剂量和给药方案，最大限度地发挥药物疗效。
3 安全性评估
体内药物分析
一 体内样品的种类 二 体内样品的采集与制备 三 体内样品的贮存与处理
一 体内样品的种类
血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、 脑脊液、泪液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等 尿液——主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生
物利用度等研究，以及测定代谢物类型等
脑脊液——怀疑药物损血脑屏障
二 体内样品的采集与制备
（一）冷藏与冷冻
取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷
藏(4℃)，长期冰冻(-20℃或-80～70℃) 。
全血未经分离，不宜直接冷冻保持。 尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的 样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、 过饱和氯仿等）保存。 注意：避免将样品反复解冻-冷冻-解冻 ——冷冻前分装成若干小份贮存
采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中
排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。
（三）唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。
缺点：药物浓度变化大
采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出
的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。
制备：采取后，立即测量除去泡沫部分的体积。
分层→离心→取上清液
（四）组织：
药物动物实验、服用药物过量中毒死亡时使用组织
常用的脏器组织有：胃、肝、肾、心、、肺、脑等 制备：组织样品在测定之前，需先加入一定量水或缓冲液匀浆 均匀化。 处理：沉淀蛋白、酸水解或碱水解 、酶水解（枯草菌溶素）
三、体内样品的贮存
（三）分离与浓集
目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分 方法：
5-体内药物分析
三、体内样品的贮存与处理
1、血样的贮藏
采集后及时分离血浆和血清（≤ 2h ），分 离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再 贮存。
三、体内样品的贮存与处理
2、唾液样品的贮藏
——测定唾液pH时应在取样的当时测定。
——为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以
下保存
——冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。
三、体内样品的贮存与处理 3、尿样的贮藏
3 强酸沉淀法
常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、
5%偏磷酸等
试剂用量 ——血清与强酸的比例为1∶0.6时
——除去90%以上的蛋白质 离心分离 ——高速(>10000r/min)离心1~2min 上清液pH ——pH 0~4
4 热凝固法
当待测物热稳定性好时可采用。 通常可加热至90℃，只能除去热变性蛋白。
（一）血样——血浆、血清和全血
——体现药物浓度和治疗作用之间的关系。 ——最常用的生物样本。 1.血样的采集： 注射器 、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、 滞 留针股静脉取血
动物实验时，采血量不宜超过动物总血量 的十分之一。
二、体内样品的采集和制备
2.血样的制备： 测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。
（二）分离与浓集 目的： 1、消除内源性物质、代谢物及其他共存物质 的干扰； 2、提取浓缩待测物质，使其易于检测
（二）分离与浓集 方法： ——液-液萃取法(传统的方法)
——固相萃取法(液—固萃取法) ——自动化固相萃取
——固相微萃取
——超滤
——微透析技术
（二）分离与浓集 1 液—液萃取法 (liquid-liquid extraction, LLE) （1）溶剂的选择——试验成功的主要条件 考虑：提取效率和选择性； 操作是否方便
5体内药物分析z
1．从分析物分
代谢物
内源性物质
2．从生物样品种类分
均匀样品 非均匀样品
3．从样品的来源分
体内药物分析
人体 实验动物
11 2021/8/4
体内药物分析的对象
研究对象
评价药物的安全性（临床前研究）—动物
评价药物的有效性（临床研究）—人体 （健康志愿者或患者）
用药的安全、有效与合理—人体（患者 TDM ）
体内药物分析
2 2021/8/4
药物进入体内后
—— 经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程 —— 化学结构和存在状态都可能发生变化 —— 在不同个体中存在差异（个体差异） —— 进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效 应和毒副作用
需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析
体内药物分析
3 2021/8/4
体内药物分析
33 2021/8/4
四 何时需要进行治疗药物监测
临床治疗中的常规血药浓度监测是指测 定规律服用某药物 5 个半衰期后已达稳定的 血药浓度
用一般剂量或超过一般剂量仍不能控制 病情时，通过监测可以了解病人是否规律用 药、代谢率是否加快、有无耐药现象等
体内药物分析
34 2021/8/4
① 治疗药物监测的核心目的是实现合理的 给药方案个体化
② 协助诊断和处理药物过量中毒，及进行 其临床药理学研究
③ 了解患者是否遵医嘱用药，提高用药依 从性
体内药物分析
30 2021/8/4
治疗药物监测与临床药代动力学研究的区别
① 血药浓度结果用于调整剂量，设计个体化 给药方案
② 一般只监测一次血药浓度，不测药物经时 变化浓度
药物服用的剂量越来越小、体液中药物浓度越 来越低，对体内药物分析方法提出了新的要求：
体内药物分析
一、名解：1、体内药物分析（Biopharmaceutical analysis）:【狭义】利用现代分析仪器和分离手段对人和动物的血液、尿、组织等样品进行定性定量的分析。
【广义】通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产，临床应用作出评价。
2、散射光：光通过物质时，有小部分在侧向散射开来，这种现象叫做光的散射，若散射光的频率与入射光的频率相同，则称为溶剂的瑞利散射光。
3、拉曼光：若散射光的频率与入射光的频率不同，则称为溶剂的拉曼光。
4、紫外双波长分光光度法：吸收光谱重叠的a、b两组混合物中，从b的吸收光谱上选择两个吸收度相等的波长λ1和λ2，测定混合物在两个波长处吸收度的差值，即可消除b的干扰以测定a，这种方法叫做双波长分光光度法。
5、高效液相色谱（HPLC）：以经典液相色谱为基础，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器并引入气相色谱理论而发展起来的分离技术。
6、微径液相色谱法：是采用高效毛细管柱的液相色谱法，即采用细管细粒度、短柱子实现高效快速的分离。
7、抗原：凡能刺激机体产生免疫反应的物质称为抗原。
8、半抗原：只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。
9、人工抗原：药物本身不具有免疫原性，只有当他们与某些大分子载体物质结合后所形成的全抗原。
人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
10、标准抗原：指在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品。
11、特异抗体（Specific Antibody）：指抗原（免疫原）作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白（lgG约占70%）。
二、体内药物分析与其他学科的关系（一）药物动力学及生物药剂学定量测量药物浓度可：1、求出动力学参数和药物制剂的生物利用度参数；2、评价药物与制剂的内在质量；3、确保临床用药的安全性和有效性。
（二）与临床药理学的关系临床药理学的研究内容：1、研究药物进入人体内对人体生理与生化机能影响和临床效应，以及药物的作用原理。
【临床药学 上海交大】临床药学5 体内药物分析
质浓度一般极低。 可供分析的样品有限。 待分析样品易变化，常需低温或一些特殊处理。 有时要求很快报告分析结果。 要求实验室具备多种分析检测的手段。
方法简介
① 光谱分析法: UV、Fluorescence、可见光 ② 色谱分析法: HPLC、GC、GC-MS、HPLC-MS、HPCE ③ 免疫分析法: RIA、EIA、FIA ④ 同位素标记药物法：RIA、GC-MS ⑤ 微生物法
方法建立和质量控制 方法建立
方法选择的依据:灵敏度高、排除药物或内源性物 质干扰、专一性强、重现性好、测定快速准确、 操作简便、费用低廉。
建立前需要了解的内容: 检测对象的理化性质、药 动学参数、分析目的。
建立方法: 照搬或改进现有文献报道方法；完全 由分析者建立新方法。
✓ 几类特殊药物的分析 ✓ 游离药物: 平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、
超速离心法
✓ 活性代谢药物: 代谢物活性较强或肾功能障碍情 况下需考虑
✓ 手性药物: 手性即化合物的立体异构性，一些药 物的左旋、右旋或消旋体之间药理活性具有明显 差异。
✓ 生物技术药物:基因重组生产药物、基因诊断、基 因治疗、药物基因多态性在合理用药中的应用。
✓ 质量控制 ✓ Quality Assurance （QA）：质量保证 ✓ Quality Control （QC）：室内质控,指实验室
第五章 体内药物分析
一、任务和特点 二、方法简介 三、方法建立和质量控制 四、应用实例
一、任务和特点
概念: 又称生物药物分析，指利用现代分析 仪器及方法对人或动物血样、尿样及组织等 样品进行药物的定性定量分析。
任务 进行体内药物和代谢物的测定，为药物的体内评价， 如生物利用度、药动学研究等，治疗药物用药个体化 提供精确数据。 进行新测定方法研究，开发完善药物检测手段。 进行方法学研究，提供合理最佳的分析条件和手段。 进行分析质量管理，确保测定结果的准确可靠。 参与临床药理分析结果的阐明工作，特别是个体化给 药方案的拟订工作。
方法简介
① 光谱分析法: UV、Fluorescence、可见光 ② 色谱分析法: HPLC、GC、GC-MS、HPLC-MS、HPCE ③ 免疫分析法: RIA、EIA、FIA ④ 同位素标记药物法：RIA、GC-MS ⑤ 微生物法
方法建立和质量控制 方法建立
方法选择的依据:灵敏度高、排除药物或内源性物 质干扰、专一性强、重现性好、测定快速准确、 操作简便、费用低廉。
建立前需要了解的内容: 检测对象的理化性质、药 动学参数、分析目的。
建立方法: 照搬或改进现有文献报道方法；完全 由分析者建立新方法。
✓ 几类特殊药物的分析 ✓ 游离药物: 平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、
超速离心法
✓ 活性代谢药物: 代谢物活性较强或肾功能障碍情 况下需考虑
✓ 手性药物: 手性即化合物的立体异构性，一些药 物的左旋、右旋或消旋体之间药理活性具有明显 差异。
✓ 生物技术药物:基因重组生产药物、基因诊断、基 因治疗、药物基因多态性在合理用药中的应用。
✓ 质量控制 ✓ Quality Assurance （QA）：质量保证 ✓ Quality Control （QC）：室内质控,指实验室
第五章 体内药物分析
一、任务和特点 二、方法简介 三、方法建立和质量控制 四、应用实例
一、任务和特点
概念: 又称生物药物分析，指利用现代分析 仪器及方法对人或动物血样、尿样及组织等 样品进行药物的定性定量分析。
任务 进行体内药物和代谢物的测定，为药物的体内评价， 如生物利用度、药动学研究等，治疗药物用药个体化 提供精确数据。 进行新测定方法研究，开发完善药物检测手段。 进行方法学研究，提供合理最佳的分析条件和手段。 进行分析质量管理，确保测定结果的准确可靠。 参与临床药理分析结果的阐明工作，特别是个体化给 药方案的拟订工作。
第五章 体内药物分析
冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定
生物样品的贮存
血样
采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再贮存 —若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有 时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离 —臵硬质玻璃试管中完全密塞后保存
生物样ห้องสมุดไป่ตู้的贮存
尿样
采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐 剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓 盐酸等
一、生物样品预处理的目的
使药物从缀合物及结合物中释放
——测定药物的总浓度 使样品纯化——消除生物基质中内源性物 质的干扰 提高检测灵敏度——适应和符合测定方法 要求的灵敏度 防止分析仪器的污染和劣化——提高分 析仪器的耐受程度、改善分析结果
二、生物样品的预处理与制备技术
生物样品的预处理大致分为以下五类
去除蛋白质的方法
1. 加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质 脱水沉淀 2. 加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质 3. 加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀 4.热凝固法
1. 加入与水相混溶的有机溶剂
常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 血样与溶剂体积比 —1∶(1-3)可除去90%以上蛋白质
尿液的采集
样本来源—自然排尿，成人一日排尿量为 1~5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时 间尿）
样本采集—一般采集时间尿（规定时间内） 采集尿液体积和排入尿中的药物总量 动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以 时间段采集，有时会有收集不到的情况。
尿样 优点： 容易获得，属非损伤性取样，且样品 量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物， 是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低， 不需去蛋白处理。
（四）器官组织（tissue）
生物样品的贮存
血样
采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再贮存 —若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有 时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离 —臵硬质玻璃试管中完全密塞后保存
生物样ห้องสมุดไป่ตู้的贮存
尿样
采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐 剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓 盐酸等
一、生物样品预处理的目的
使药物从缀合物及结合物中释放
——测定药物的总浓度 使样品纯化——消除生物基质中内源性物 质的干扰 提高检测灵敏度——适应和符合测定方法 要求的灵敏度 防止分析仪器的污染和劣化——提高分 析仪器的耐受程度、改善分析结果
二、生物样品的预处理与制备技术
生物样品的预处理大致分为以下五类
去除蛋白质的方法
1. 加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质 脱水沉淀 2. 加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质 3. 加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀 4.热凝固法
1. 加入与水相混溶的有机溶剂
常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 血样与溶剂体积比 —1∶(1-3)可除去90%以上蛋白质
尿液的采集
样本来源—自然排尿，成人一日排尿量为 1~5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时 间尿）
样本采集—一般采集时间尿（规定时间内） 采集尿液体积和排入尿中的药物总量 动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以 时间段采集，有时会有收集不到的情况。
尿样 优点： 容易获得，属非损伤性取样，且样品 量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物， 是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低， 不需去蛋白处理。
（四）器官组织（tissue）
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特点
体内药物分析的特点 主要来自于体内样品的特点
1. 体内样品的特点 （1）采样量少： ml~µl级； 且不易重新获得 （2）待测物浓度低：µg/ml ~ng/ml级， 甚至pg/ml （3）干扰物质多： 尤其是血样和组织中的蛋白质
2. 体内药物分析的特点 （1）样品需经分离与浓集， 或化学衍生化处理 （2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高 （3）分析工作量大， 数据处理和结果阐明繁杂
（4）固相萃取法的特点
当采用亲脂性键合硅胶SPE时 • 方便、省时 • 通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200~300μl）
完全洗脱药物，净化并浓集样品 • 不需蒸干即可直接进样
（5）自动化固相萃取法
• 对于单个样品处理， SPE操作省时 • 对于大量样品的处理
➢ 半自动SPE： 萃取过程机械化 ➢ 全自动化仪器： 通过柱切换技术实现固相萃取与
2. 满足测 定方法的 要求
样品介质组成复杂： 分离 待测组分浓度低： 浓集
二、常用体内样品处理方法
（一） 蛋白沉淀法 （二） 分离与浓集法 （三） 缀合物水解法 （四） 化学衍生化法
（一）去除蛋白质法
• 加入与水混溶的有机溶 剂， 蛋白析出，药物 释放
• 乙腈、甲醇、丙酮、四 氢呋喃等
• 血浆/血清与有机溶剂 的体积比1∶（2～3）
HPLC联用
柱（切5）换自：动固化相固萃相取萃-L取C法/MS/MS
3. 超滤法
• ultrafiltration是一种膜分离技术 • 按照截留分子量，选择半透膜，可分离30 ~1000kD
的可溶性生物大分子 • 无化学试剂，无相变化
• 简便， 游离药物分析的首选方法； 尤其适合TDM
（三）缀合物水解法
• 静脉， 0.2～5ml，≤15%~20%动物总血量
2. 血浆的制备 • 抗凝剂，1000g离心5～10分钟，淡黄色上清液 50%～60％
3. 血清的制备
• 30分钟～1小时，1000g离心，5～10分钟，上层淡
黄色液体
20%～40％
4. 全血的制备
• 抗凝剂， 不离心
尿样
1. 尿样的特点 • 原形或代谢物 • 药物浓度较高 • 收集量大（1~5L） 2. 尿样的采集 • 自然排尿 • 规定时间段（6～8小时）（时间尿） 3. 尿样的储存 • 加入适当防腐剂
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 常用体内样品的制备与储存
1 体内样品的种类 2 体内样品的采集与制备 3 体内样品的储存与处理
一、体内样品的种类
体液
血液、唾液
脑脊液、胃液、 胆汁、乳汁、 精液、泪液
组织
胃、肠、肝、 肾、肺、脑、 肌肉、头发
排泄物
尿液
粪便、 汗液
二、体内样品的采集与制备
常见体内样品
血样
1. 血样的采集
唾液
• TDM（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替P （血浆游离浓度）进行临床监测
1. 唾液的组成 • 腮腺、舌下腺和颌下腺 2. 唾液的采集 • 漱口15分钟， 安静状态， 自然流出的唾液 • 物理或化学方法刺激 3. 样品的制备 • 3000r/min离心10分钟，上清液
组织
1. 样品的制备 • 制成水性基质匀浆溶液 2. 样品的处理 （1）沉淀蛋白法 （2）酸/碱水解法 （3）酶水解法 • 蛋白水解酶中的枯草菌溶素
二乙异丙嗪
丁酰胆 碱酯酶
酯酶抑制剂，可 以有效防止药物在 酯酶的作用下发生
降解
乙酰胆 碱酯酶
敌敌畏
5,5′-二硫代双
（2-硝基苯甲酸）
芳香基 酯酶
磷酸二 酯酶
氟化钠 氟化钾
去活性：调节pH
调节pH有效 避免化合物发 生降解或者分
子内转化
酯类 酰胺类 内酰胺类 内酯类
葡糖苷酸类
• 甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液
（2）固相萃取法操作步骤
• 第1步： 甲醇润湿小柱， 活
化填料； 净化填料
• 第2步： 水/缓冲液冲洗小柱，
去除甲醇； 甲醇含量过低
（低于5%）致C18链弯曲折
叠， 回收率降低
, 平衡
• 第3步： 加样， 使样品通过
小柱， 并弃去滤过液
• 第4步： 水/缓冲液冲洗 小柱， 去除内源性及其 他干扰物质
体内药物分析 分析方法 样品制备 存在形式
体内样品
概述
生物分析
方法建立 • 色谱、免疫分析、生物 与验证 • 完整、部分和交叉验证
• 蛋白沉淀、萃取、膜分离
净化与浓集
•
水解、化学衍生化
原形、代 • 原形药物或其代谢物
谢物
• 缀合物、蛋白结合物
体液或组织
• •
血液是最常用样品 尿• 液4 、唾液、头发和脏器
（四）化学衍生化法
化学 衍生化
• 药物分子中含有活泼氢者均可被化学 衍生化，如含有R-COOH、R-OH等 官能团的药物 ➢ GC： ①提高药物的挥发性； ② 增加药物的稳定性； ③生成非对 映异构体 ➢ HPLC： ①提高检测灵敏度； ② 改善色谱分离
1. 在GC中的应用 （1）硅烷化：三甲基硅烷（TMCS） （2）酰化：三氟乙酸酐（TFAA） （3）烷基化：碘庚烷（C7H15I） （4）不对称衍生化：（S）-N-三氟
• 第5步： 洗脱溶剂洗脱 待测物， 收集洗脱液
, 平衡
（3）注意事项
1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在1～ 2ml/min；
2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损 失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；
3）萃取碱性药物时， 洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、 醋酸铵或离子对试剂
药物分析
第五章 体内药物分析
1 常用体内样品的制备与贮藏 2 体内样品分析的处理 3 体内样品分析方法与方法验证 4 典型体内药物分析应用
掌握： 体内药物分析的特点和应用 体内样品处理 体内样品分析方法验证的内容
熟悉： 体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求
了解： 体内药物分析的性质与意义
61
↓
甲基异丁基酮
230
116
乙酸乙酯
260
77
正丁醇
215
118
*：含过氧化物；：肝脏毒性， 有致癌作用
（2）溶剂的用量 • 有机相与水相（样品）体积比为1︰1~5︰1
（3）水相的pH
• 碱性药物pH高于pKa 1~2pH单位 • 酸性药物pH低于pKa 1~2pH单位 • 碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH基质中
• 代谢产物对待测物、内标物的干扰 • 配伍用药的干扰
二、分析方法的验证
（一） 选择性 （二） 标准曲线与定量范围 （三） 定量下限 （四） 精密度与准确度 （五） 样品稳定性 （六） 提取回收率 （七） 基质效应
（八） 试验样品分析 （九） 试验样品浓度超出定量范围的处理 （十） 作为外源性药物使用的内源性物质的测定 （十一）微生物/免疫学方法的验证 （十二）名词解释
去活性：抗氧化剂
• 含有酚羟基结 构的药物在生 物基质或样品 处理过程易发 生自身氧化
• 使用抗氧化剂 为常用的方法
测定利福平时加入 0.5% w/v的维生素C
测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦 亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）
第二节 体内样品处理
分析方法与样品处理步骤的选择
• 样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好 条件
4. 热凝固法
（二）分离与浓集法
1. 液相萃取法 2. 固相萃取法 3. 超滤法
1. 液相萃取法 （1） 溶剂的选择原则 （2） 溶剂的用量 （3） 水相的pH （4） 提取操作
（1）溶剂的选取原则
1）对药物分子未电离形式可溶， 对电离形式不溶； 2）沸点低，易挥发； 3）与水不相混溶； 4）无毒， 不易燃烧； 5）具有化学稳定和惰性； 6）不影响紫外检测
（二）去活性
• 采样后立即终止酶的活性 • 常用方法：液氮速冻， 微波照射， 匀浆及沉淀， 加
酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调 节pH及样品煮沸
去活性：酶活性阻断剂
哌唑嗪、敌敌畏 噻吩甲酰三氟丙酮
羧酸 酯酶
• 酯酶是普遍存在于全血、 血浆和血清中的一类水 解酶，能够水解结构中 含有酯键的药物
提取； • 多在碱性下提取， 可减少内源性物质（酸性）的
干扰 • 碱性下不稳定， 在中性用三氯甲烷和异丙醇提取
（4）提取操作
• 一般只提取1次 • 若提取回收率较低（低于50%）， 提取2~3次 • 脂溶性干扰物， 可进行小体积水溶液反提取
2. 固相萃取法 （1） 固相萃取法的原理 （2） 固相萃取法操作步骤 （3） 注意事项 （4） 固相萃取法的特点 （5） 自动化固相萃取
三、体内样品的储存与处理
（一）冷藏与冷冻
• 短期保存： 冰箱（4℃）冷藏 • 长期保存： 冷柜（-20℃/-70~-80℃）冷冻， 小体积分装 1. 血浆/血清 • 分离（2小时）， 硬质玻璃/聚乙烯管（EP）， 冷冻 2. 尿样 • 冷藏（24~36小时）加防腐剂 3. 唾液 • 冷冻保存时， 解冻后充分搅匀后再用
• 样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作
1 体内样品处理的目的
2 常用体内样品处理方法
一、体内样品处理的目的
1. 使待测 组分游离
3. 改善分 析环境
仪器污染，劣化（去蛋白） 提高测定灵敏度/选择性 化学改性（衍生化）
样品 处理
血浆蛋白结合物、缀合物 使待测药物/代谢物释放测定药 物/代谢物总浓度
（1）固相萃取法的原理
• 含药物体内样品通过小柱时， 受到 “吸附”、“分 配”、“离子交换”或其他亲和力作用， 药物及内源性 物质同时被保留在固定相（填料）上