测定核酸含量的几种方法
核酸的定量测定(定磷法)
⑨吸量管。
⑩分光光度计。
2．试剂：
以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。
①标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH2PO4）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至50毫升（含磷量为1毫克/毫升），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10微克/毫升。
五、结果与讨论：
1．绘制出标准曲线。
2．计算
RNA的含磷量为9.5%，因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1微克RNA磷相当于10.5微克RNA。将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA磷量尚需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9.9%。
3．测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查出无机磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。
取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1毫升上述消化后定容的样品和空白溶液，如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减
去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。
②定磷试剂3mol·L-1硫酸∶水∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1（体积比）]：配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。
③沉淀剂：称取1克钼酸铵溶于14毫升70%过氯酸中，加386毫升水。
核酸的含量测定I——紫外吸收法
实验35 核酸的含量测定Ｉ——紫外吸收法一、 目的和要求1、 学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。
2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法。
二、 实验原理DNA 和RNA 都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm 波长处。
紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。
核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ɛ（P ）表示。
ɛ（P ）为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的吸光度（即光密度，或光吸度）。
RNA 的ɛ（P ）260nm （pH7）为7700~7800，RNA 中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA 的吸光度为0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ɛ（P ）260nm （pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA 钠盐的吸光度为0.020。
不同形式DNA 紫外吸光度不同，因为DNA 具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA 变性，则出现ɛ（P ）260nm 值升高的增色效应现象。
在核苷酸量相同的情况下，ɛ（P ）260nm 有以下关系：单核苷酸＞单链DNA ＞双链DNA 。
DNA 变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，还可根据DNA 溶液在260nm 出吸光度的变化监测DNA 变性情况。
变性ＤＮＡ复性后，ɛ（P ）260nm 值降低，称为减色效应。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。
蛋白质的吸收峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
ＲＮＡ在260nm 与280nm 处的吸光度的比值在2.0以上，DNA 在260nm 与280nm 处的吸光度的比值为1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。
紫外吸收发测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L 的检测水平。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
实验七 核酸的定量
成分测定
取200mg提取的核酸，加入3mol/L硫酸10ml，在沸 水浴中加热10min制成分解液并进行组分的鉴定。
1、嘌呤碱 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加 入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的 银化合物沉淀。
2、核糖 取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓 盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中 10min。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
二、器材与试剂
1、试剂的配制 钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸按-2.5%过
氯酸溶液]：取3.6ml 70%过氯酸和0.25g钼酸 铵溶于96.4ml蒸馏水中。 样品DNA 2、器材 容量瓶（50ml）、离心管、离心机、紫外分 光光度计。
三、操作步骤
取两支1.0ml小离心管，甲管加入0.5ml样品 和 0.5ml 蒸 馏 水 ； 乙 管 加 入 0.5ml 样 品 和 0.5ml钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴 中放置15min，以3000r/min离心10min，分 别取上清液0.75ml在量筒中定容到25ml，备 用。
干扰因素
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能 吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长处，在260nm处的消光值仅为核 酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质 含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA的260nm与280nm消光值的比值在2.0以 上；DNA的260nm与280nm消光值的比值则 在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比 值即下降。
2、二苯胺试剂为什么要溶于浓醋酸? 3、请分析自己的DNA样品。
三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加
10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴 中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装 在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取 液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯 内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷 至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性 乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的逐步下降，溶液 中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电 点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于 冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
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荧光光度法
即琼脂糖凝胶电泳法。 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光 结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量 ，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓 度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的 DNA。 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子的长度。
优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响
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注意事项
1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂
2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
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定糖法
核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类 化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法 测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。 1、核糖的测定 生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值。 2、脱氧核糖的测定 DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸 ，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收 值。 优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。
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小节
根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。 根据需要设定一定的平行以及对照。
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再见
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Company Logo中所用酶和其他试剂含量的确定 为了排除核酸在实验中的干扰
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核酸含量测定的几种方法
定磷法 定糖法 紫外吸收法 荧光光度法
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定磷法
在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应 生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物—— 钼蓝 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原 剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量， 需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化 样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量 。
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
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核酸
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一 。 核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋 白质结合形成核蛋白。 不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不 同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA） 。
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注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽 量可能除去。
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紫外吸收法
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在 波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物 理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为 50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的 浓度。 优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液