组织或细胞的Real-time PCR protocol

总RNA的提取
1)匀浆处理：
a. 组织将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b. 单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm 直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c. 细胞悬液离心收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2)每使用1mlTRIzol加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡20 sec，室温静置10 min；
3)4℃12000 rpm 15 min，分三相，RNA在上层水相中；
4)小心吸取上清于新的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10-20 min；
5)4℃12,000×g 15 min离心；
6)小心弃上清，加1 ml 75%冷乙醇（DEPC水配置）洗涤沉淀，上下颠倒使沉淀重悬；
7)4℃7500×g 5 min 离心；
8)小心弃上清并尽量将液体吸干，沉淀在室温晾干；
9)加入30-50 μl RNase-free的水溶解，轻弹或短暂离心，50℃5 min促溶；取1 μl RNA稀释后测浓度并进行琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。

消化RNA中的DNA
参照RNase-free DNase (Promega)说明书步骤。

1)10 μl体系加入1 μg RNA、1 μl RQ1 RNase-free DNase、1 μl RQ1 DNase buffer，因RNA的量会有所损失，选择处理15 μg RNA，DNase及buffer均加15 μl，H2O补齐至150 μl，混匀；
2)37℃处理30 min；
3)补水至200 μl，加入100 μl氯仿，振荡混匀，室温静置10 min；
4)4℃顶速离心10-15 min，小心吸取上层水相溶液于新的EP管中；
5)加入0.1倍体积的NaAc（3 M，pH5.2）及等体积的异丙醇，室温沉淀半小时；
6)4℃顶速离心15 min，去上清，沉淀用75% DEPC乙醇洗涤；
7)4℃离心5 min，尽量去干净上清，室温干燥3-5 min；
8)加入20 μl RNase-free H2O溶解，轻弹或短暂离心，50℃5 min促溶；
9)取1 μl RNA稀释后测浓度并进行琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。

RNA样品要求OD260/280为1.8~2.2，完整性良好；28S、18S条带清晰，且28S比18S亮或至少与18S相同，5S很弱；
附Total RNA 电泳图，电泳时RNA总量在200ng-800ng左右效果比较好。

反转录
参照SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen)说明书步骤。

1)取3 μg RNA，加入Oligo（dT）primer 0.5 μl 、dNTP 1 μl，补H2O至12 μl，混匀；
2)65℃5 min，冰上5 min；
3)加入5×Reaction Buffer 4 μl、0.1 M DTT 2 μl、RNase OUT 1 μl，混匀；
4)42℃2 min，加入SuperScript II reverse transcriptase 1 μl，混匀；
5)42℃50 min，72℃15 min，4℃待用。

定量PCR
参照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂及7500 real-time PCR instrument (Applied Biosystems) 说明书进行。

1)引物设计：SYBR Green I荧光嵌合法进行Real-time PCR反应对引物的特异性及效率要求很高，设计原则可参考Takara公司Real-time PCR实验及解析方法介绍，其关键点如下：
●Tm值和GC含量在适当范围内以保证引物与目的DNA片段的稳定
退火；
●引物内部及上下游引物之间无互补序列以保证引物利用效率；
●使用BLAST以保证引物的特异性，3’端特异尤为重要。

设计好的引物需提前进行预实验，扩定量PCR熔解曲线为单一且锐利的锋，产物进行琼脂糖凝胶电泳只有特异扩增条带而无引物二聚体和非特异带的引物则可用；
2)进行PCR反应：相对定量PCR目前用的较多，最好检测至少四个内参，内参一般选择表达水平高的管家基因（如ACTIN，TUBULIN，GAPDH，eEF-1等）。

PCR反应体系如下（20 μl）：
SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μl
Rox Reference Dye II（50×）0.4 μl
ddH2O 8.5 μl
cDNA template 0.3 μl
Primer mix（2.5 μM，终浓度100 nM）0.8 μl
可将前三种溶液混到一起，之后按模板分装，引物可直接加到PCR反应板上。

检测同一个基因的不同样品最好放在同一竖排，Real-time PCR检测非常灵敏，同样的模板及引物需重复扩3个孔，结果必须来自至少三次独立实验所得的数据；
3)选用ABI 7500 Real-time PCR仪进行扩增，程序如下：
Stage 1：95℃10 sec，
Stage 2：95℃3 sec，60℃30 sec，72℃34 sec（读板），循环40次；
熔解曲线程序为：95℃15 sec，60℃ 1 min，95℃15 sec；
4)结果分析：在PCR反应的对数增长期中间左右的位置设定荧光阈值（不同批次实验的同一个检测基因需设定一样的荧光阈值），读取并输出Ct值。

计算公式：
2 -△Ct WT=2 –(Ct WT目的基因-Ct WT内参基因)
2 -△Ct mutant=2 –(Ct mutant目的基因-Ct mutant内参基因)
2 - △△Ct =2 -△Ct mutant/2 -△Ct WT
先计算不同内参之间的相对水平，并选择一个在野生型和突变体之间稳定表达的内参。

通过计算2 - △△Ct检测目的基因在野生型和突变体中的差异：野生型为1.0，突变体所得数值即为目的基因在突变体中的表达水平是野生型表达水平的倍数；不同批次实验可用2 -△Ct WT计算野生型的标准差。