大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol
大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究
一44一重庆医科大学学报2∞8年第33卷增刊l(J oum aI of C h ong qi ng M ed i caI U n．vers i ty2∞8．V o|．33No．s1)基础研究文章编号：0253—3626(2008)sl—0044—04大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究何梅-，王学峰，马珊珊：，席志芹(1．重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016；2．山西医科大学第一附属医院神经内科，太原030001)【摘要】目的：探索体外培养大鼠神经干细胞(N eur al st e m ceus，N s cs)的方法和实验条件，建立一种较为可靠的神经干细胞培养方法。
方法：分别选取孕14～16ds D胎鼠和新生1d的sD大鼠进行神经干细胞培养，采用单纯机械吹打和机械吹打加酶消化丽种方法进行消化，对培养出的细胞进行神经干细胞、神经元、神经胶质细胞的免疫细胞化学和免疫荧光鉴定。
结果：用2种来源的大鼠培养出的原代细胞，均表达N es t i n，诱导分化后的细胞表达G FA P和M A P-2。
结论：大鼠神经十细胞的原代分离与培养的关键是单细胞悬液的获得，消化液浓度太高或消化时间太长，容易因消化过度致细胞损伤甚至死亡。
胎鼠来源者神经球形成早，数量多。
增殖活力更强，但原代取材过程易被污染。
新生鼠来源者鼠源易获得，组织取材过程操作简单，但神经干细胞成球率低。
【关键词】神经干细胞；细胞培养；免疫荧光；免疫生化【中国图书分类法分类号】R74l【文献标识码】A【收稿日期】2007一08—29St udV on i soI at j on and cul t ur e O f neur aI s t em C e¨s f r O m r at br ai nH E M ei．e￡击0D epdr t m em《N e酣ol ogy，t k F订st A航l谴ed H ospi斌，C hongqi唱M ed记击U n洳er s畸)【A bst ract】O巧ec渤e：To es讪l i s h岫m em od of cul t ur i ng neur al哟m ceus(N s cs)妇n ra t brai n．胁跏ds：E14～16sD吣一br yoni cm￡brai n粕d pos t nat aJ one—da y(P1)r a t br aj n w e r e r es pecti vel y ch ose t o cul t l l r e ne u m l st e m ceU s，an d t’帕diges t ive m et h—ods t}l at s i m pk m e ch肌i ca l di ges t i on a nd m e chan i ca l com bi ned诵t}l che m i c al diges t主on w e r e u8ed t o det e兀ni ne t l l e bes t condi—t ions i n pr i m ar y cuhur e．I m m un∞yt oc hem i st I y and i m m u noⅡu or e sce nc e w er e us ed t0i dent i母N SC s，ne urons a nd neum di al cel l s．R8s饿捃：B o t h t l l e pri m a巧ceu s f r o m t w o dⅢbr ent ki nds0f ra t bm i ns ex pr es sed nes ti n aJ l t i g en粕d t}l e di任br en t i ated cel l s ex—pr e ssedG F A P锄d M AP一2明t i gen．∞似砌6s暮D竹：ne key poi nt of pr i m ar y N SC s cul t ur e w鹊obt ai ni ng t he m on叩l鹊t s u叩ens i on．0ver di gest i on l ed t o c eu i nj u r y ev en de am．N SC s舶m em br yoni c ra t br ai n had bet t er pm l i f er at i on abi l i t y粕d co ul d f0肌ceⅡcl ones ea r l i er粕d m or e t}I an N SC s f南m new b om E a t br ai n，but t11e y w e r e e鹊i er t o be contam i nat ed．0h t ai n i ng new b om m t bm i n锄d i sol ati on N SC s舶m new bom ra t br ai n w er e e鹊i er，b ut N SC s舶m new bom ra t br ai n had w o璐e pm l如m t i on abi l吼【K ey w or ds】N eur al st e m ce ns；ceu cu l t u r e；I m m un onu or esc enc e；I m m uno cyt o che m i st r yN S cs是一种原始的未分化细胞，它有和成熟神经细胞相同的基因，且具有自我增殖和多向分化的潜能，神经干细胞研究是21世纪生命科学研究的重要领域。
成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化
到 阳性 细 胞 。 ３ 讨 论
１２ 毛 囊 Ｎ Ｓ ． Ｃ Ｃ的 鉴定一ｐ ５ Ｎｅｔ ７ 、 ｓｉ 疫 荧光 细胞 化 学 ｎ免
Ｆ ２１： ， Ｎ２ ２ Ｂ ７ ２ ｇ ｍｌ ＧＦ，０ｎ ／ Ｆ １ １ １ ， ２ ，０ｎ ／ Ｅ ２ ｇ ｍｌ — ｂ
免疫荧光 细胞化 学 染 色结 果 显示 毛囊 ＮＣ Ｃ呈 ｐ ５ Ｓ ７ （ 神经嵴干细胞标 志物） 免疫荧光染 色 阳性 （ 图 Ｅ） 毛囊 附 ， 隆突部及 游出细胞 均呈 Ｎｅｔ （ 经 干细胞 标志 物 ） ｓｉ 神 ｎ 阳性
（ 图Ｆ 。 附 ）
２３ 诱 导 分 化 结 果 及 鉴 定 ．
ＧＦ ，７ 、５ Ｃ ２ ５ Ｏ２ ） ３ ℃ ９ Ｏ ／ 静置培 养 。６ｄ后剔 除 毛囊 ，
０ ２ 胰酶消化传代培养 ， ．５ 培养 液 同前 ， 每隔 ２ｄ换 一半
培养液 。
传代 细 胞 经 １ Ｆ Ｓ诱 导 １ 后 可 检 测 到 少 量 Ｏ Ｂ ４ｄ
２ １ 原代和传代培养的细胞观察 ．
毛囊 隆突贴块 培养 ２ｄ 后可见 Ｏ １ 个 细胞从 隆突部 ～ ５ 爬 出 ， ３ｄ后约 １ ０个 细胞 ， ２ ４ｄ后 细 胞 明显 增多 ， ６ｄ后 细 胞进一步增 多 ， 可增 至 成百 上 千个 。随着 游 出 细胞 的 增 多， 毛囊 隆突部逐渐缩小 （ 附图 Ａ，Ｂ ， ） 细胞 以隆突部 为 中 心向外周伸 展 ， 刚从 隆突 部 游 出或 刚分 裂 出 的细 胞为 圆 形， 很快便伸 出突起 呈梭形 或三 角形 ， 镜下 观察 常可见 细 胞的分裂象 ， 哑铃形 或形 状变 长 即将成 为哑 铃形 （ 图 呈 附 Ｃ 。传代培养的 细胞周 边光晕 较强 ， 胞形 态更 为多 样 ， ） 细 以椭 圆形和三角形 居 多 ， 也有梭 形 和多 角形 的 ， 常可 见细 胞 的分裂象 （ 附图 Ｄ 。 ）
大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定
Ｉｏａｉ ｓ ｌ ｔｏｎ， ｕｌｕｒ ｎｄ ｉ ｃ ｔ ｅ ａ ｍｍ ｕｎｏ ｕｏ ｅ ｃ ｎｃ ｄｅ ｔｆｃ ｔｏ ｆｎｅ ｒ ｌｓｅ ｃ ｌｓｉ ａｔ ｌ ｆ ｒ ｓ ｅ ｅ ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｕ ａ ｔ ｍ ｅｌ ｎ ｒ ｓ ｉ
Ｃ ｅ ａ。， ａ ｇＸ ａｊ ｎ Ｚ ａ ｇＰｎ３ｅ ａ． ｈ ｎＫ ｉ Ｋ ｎ ｉｎｉ ｇ， ｈ ｎ ｉｇ，ｔ １ 一 ａ
ｐ ｏ ｅｔ ｓ ｒ ｐ ｒ ｅ ．Ｍ ｅｈ ｄ Ｔ ｉ ｓｕ ｙ ａ ｏ ｔｄ ｔ ｅ ｓ ｒ ｍ － ｒ ｅ ｃ ｌ ｒ ｏ ｉ ｅ ｉ ｈ ａ ｉ ｂ ｏ ｌ ｓ ｇ ｏ ｔ ｉ ｔ ｏ ｓ ｈ ｓ ｔｄ ｄ ｐ ｅ ｈ ｅｕ ｆｅ ｕ ｔ ｅ ｃ ｍｂ ｎ ｄ ｗ ｔ ｔ ｅ ｂ ｓｃ ｆ ｒ ｂ ａ ｔ ｒ ｗ ｈ ｕ ｈ ｉ
果
从 新生大 鼠海马齿状 回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球 ， 并且呈 ｎｓ ｎ阳性 表达 ， ｅｔ ｉ 具有多 向分化能力 。 结论
分 离培 养 的细 胞 是 中 于细胞 ； 分离培养 ； 免疫荧光鉴定
中图 分 类 号 ： ３ ３ Ｑ ４ 文 献 标 志 码 ： Ａ 文章 编 号 ：６ ４ ４ ０ ２ １ 一２ ０ ０ — ４ １７ — ９Ｘ（０ ０）０ — ０ １ ０
（ ．Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｌ －ｃｅ ｃｓ ｅ ｅ Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｂ ｏ ｉ ｂ ｉ０ １ ０ ；．Ｃ ｌ ｇ 厂Ａ ｒ ｕｔｒ ，Ｈ ｂ ｉ １ ｏｌ ｅ ｏ ｓｉｎｅ ，Ｈ ｂ ｉ ｎ ｅｓ ｙ ａ ｄｎ Ｈｅｅ ７ ０ ２ ２ ｏｌ ｅ Ｑ ｇｉ ｌ ｅ ｅ ｅ ｅ ｖ ｔ ｇ ｅ ｃ ｕ Ｕ ｉ ｒｉ ｛Ｅ ｇｎ ｅｉ Ｈａ ｄ ｎ Ｈｅｅ ５ ０ １ ３ Ｄ ｐ ｒｍ ｎ ｅｒｌ ｙ ｆ ｌ ｅ ｏｐｔ ｊＨ ｂｉ ｎｖ ｓ ｙ ｏ ｎ ｉ ｒ ｇ． ｎ ａ ｂ ｉ０ ６ ０ ． ｅ ａｔ ｅ ｔｏ Ｎ ｕｏ ｇ，Ａｆ ｉ ｄ Ｈ ｓ ｉｌ０ ｅ ｅ ｅ ｔ ｅ ｎ ｆ ｏ ｉ ￣ ａ
大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究
胚胎神经干细胞 的体外培养体 系， ５ 的胎牛血清诱 导神经 干细胞分 化 ， 免疫荧 光染色技 术进行 对神经 用 ％ 用 千 细胞及诱 导分化 细胞 的鉴定 。结果 原代培 养 的神 经干细 胞折光性 强 ， 养第 ２ 培 ｄ开始 形成 细胞集 落 ， 第 ３ 形 成大的神经球。３～ ｄ ５代传代 的细胞 生长稳定 。经胎 牛血清诱导后第 ３ ｄ开始 ， 神经球开始 向周边发 出突 起， 悬浮 的细胞开始贴壁生长 。原代及传代培养的神经球表达 Ｎ ｓｎ阳性 ， 化细胞分别 表达 Ｎ Ｅ Ｇ Ａ ｅｔ ｉ 分 Ｓ 、 Ｆ Ｐ和 Ｇ Ｌ Ａ Ｃ阳性。结论 应用无血清培养技术可在体外培养 、 扩增 出神经 干细胞 。５ ％的胎牛血清可以诱 导神经干
Ｅｘｐ ｒｍ ｅ ａ ｔ ｄｙ ｏ ｕｌｉ ａ ｉｎ ， ｄ ｆｅ ｅ ｉ ｔｏ ｎｄ ｉ ｎｔｆｃ ｔｏ ｎ ｆ ｔ ｌｒ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｉ ｎｔ ｌｓ ｕ ｆ ｃ ｔｖ ｔｏ ｉｆ ｒ ｎｔａ ｉ ｎ ａ ｄｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ｅ ａ ａ ｓ ｎ ｕ ａ ｉ
ｓ ｍ ｅ ｓ Ｉ ｉｎｘ Ｗ ＮＧＸ ａ ｎ ， Ｈ Ｎ ｏｇｊｎ ｅ ａ． ｅａｔ ｅｔｆＮ ｕｏｕｇ ｒ ， ｅ ｔ ｃｌ ＵＪａ —ｉ Ａ ｉｏ ｇ Ｚ Ａ ＧＲ ｎ － ， ｔ １Ｄ ｐ ｒ ｎ ｅｒ ｒｅ ｔ ｅ ｌＬ ｎ， ｕ ｍ ｏ ｓ ｙｈ
豫 Ｈ ｓｉ ｌ Ｐ ． ａｊ ７ １０ ． ｈｎ ｏ ｔ Ｂ ｏ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ ｐａ ｏ ｆ ｉ
ｆｅ ｄ ｕ ， ５ ｒ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ％
ｏ ｈｅ ｗｏ ｂ ｖｎ ｓ ｒ ｍ ｗａ ｕｓ ｄ ｏ ｄｆｅ ｅ ｔａｉｎ．Ｉ ｆ ｔ ｍｂ ｏ ｉｅ ｅ ｕ ｓ ｅ ｆ ｒ ｉ ｒ ｎ ｉｔｏ ｆ ｍｍｕ ｅ ｌｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ
大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定
２ 结 果
血 浆 ｔ Ａ、 ＡＩｌ 原 含 量 检 测 见 表 ｌ — Ｐ —抗 Ｐ 。观 察 组 血 浆 ｔ Ａ — Ｐ 含量 低 于 对 照 组 （ ｏ ０ ） Ｐ — 量 显 著 高 于 对 照 组 （ Ｐ＜ ． ５ ． ＡＩ ｌ含 Ｐ＜
０． ０５） 。
本文结果表明 ． 急性 脑 梗 死 患 者 血 浆 ｔ Ａ 含 量 降 低 ， ＡＩ — Ｐ Ｉ — ｌ 含 量 升 高 ， 内纤 溶 活 性 低 。 提 示 临 床 上 可 用 ｔ Ａ、 Ａｌ 体 — Ｐ 一 Ｐ １的含 量作为判断急性脑梗死患 者纤溶 活性 ， 指导 治疗的参考 指标之
一
０
表 ｌ 两 组 血 浆 ｔ Ａ、 ＡＩ 含 量 比较 （ ± ｓ — Ｐ Ｐ — ｌ ）
参 考 文 献
［ ３ Ｌ ｓ ａｚ Ｂｒｕ １ ｏ ｃｌｏＪ， ａ ｎｗａｄ Ｅ． ｓ ｕ ｌｓ ｉｏ ｅ ｃｉａ ｏ （ ］． Ｅｎ ｉ ｌ Ｔｉｓ ｅｐａ ｍ ｎ ｇ ｎ ａ ｔｖ ｔ ｒＪ Ｎ ｇ
维普资讯
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３ ・ ４
中国塞旦 神经疾病杂志 ２０ 年 １ 月第 ９ ０６ １ 卷第 ６ 期 Ｃ ｉ ｓＪｕｎｌ ｆ ｒｃｃｌ ｅ ｏｓ ｉ ａ ｓ ｏ．０６Ｖ Ｉ ｏ６ ｈ ｅｅ ｏｒａｏ Ｐａｔａ Ｎ ｒ ｕ ｓ ｓ ｖ２０ ， ｏ ９Ｎ ． ｎ ｉ ｖ Ｄ ｅｅＮ ．
显示 ． 性脑梗 死 患 者血 ｔ Ａ 明显 低于 对照 组 （ 急 — Ｐ Ｐ＜ ０ ０ ） ． ５ 而
１２ 标 本 制 备 所 有 实 验 对 象 人 院 第 ２ ． ｄ空 腹 、 卧 静 息 平 １ ｒ ｎ后 采 集 ， 血 中尽 量 减 少 静 脉 压 迫 时 间 。 血 液 标 本 按 ０ｉ ａ 采 ｌ： 抗 凝 （ ０ １Ｍ 枸 橼 酸 钠 ０ ２ ＋ 血 液 １ ８ ） 按 ３０ ｒ ９ 即 ．３ ． ｍｌ ． ｍ１。 ０ ０／ ａ ｎ离 ｒｉ 心 １ ｒｉ， 分 离 血 浆 放 人一Ｏ ５ ｎ取 ａ ８ ℃超 低 温 冰 箱 保存 。 １ ３ 检 测 方 法 及 试 剂 采 用 Ｅ ｌＡ 定 量 测 定 ｔ Ａ、 Ａｌ ． ＬＳ — Ｐ 一 Ｐ １水 平 ， 剂 盒 购 自美 国 诊 断 试 剂 公 司 （ Ｄ。 操 作 过 程 严 格 按 照 试 ＡＤ 药盒 说 明 书进 行 。 １４ 统 计 学 处 理 采 用 Ｓ Ｓ １． ． Ｐ Ｓ ０ ０统 计 软 件 进 行 两 样 本 均 数 比较 的 ｔ 检验 ， ＝０ ０ “ ．５作 为检 验 水 准 ， 据 以 均 数 ±标 准 差 （－ 数 Ｘ ± ｓ表 示 。 ）
新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定
新生大鼠背根神经节神经元的分离、培养及鉴定发表时间：2015-10-09T15:22:53.543Z 来源：《医药前沿》2015年第21期供稿作者：张雨尧1 梁宸1 胡学昱2（通讯作者）[导读] 1第四军医大学学员旅陕西西安2第四军医大学西京医院骨科陕西西安我们采用新生大鼠DRGn来作为研究对象分析电刺激对神经元突起再生的影响，进行轴突生长发育的研究，是经典而常用的方法之一[4]。
张雨尧1 梁宸1 胡学昱2（通讯作者）（1第四军医大学学员旅陕西西安 710032）（2第四军医大学西京医院骨科陕西西安 710032）【摘要】目的：建立一种简单、稳定、高效的新生大鼠背根神经节神经元原代培养方法。
方法：摘取新生24h SD大鼠背根神经节，采用0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶消化，制成单细胞悬液，接种于Neurobasal/B27无血清培养液中。
将培养3d的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，扫描电镜行细胞形态学检测，应用β-tubulinⅢ进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞纯度。
结果：体外培养的背根神经节神经元生长状态良好，纯度可达到(92±6)%。
结论：本实验方法简单、稳定、高效，可以获得高纯度的背根神经节神经元。
【关键词】背根神经节；动物实验；细胞培养；纯化【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0034-03The dissection, purification and culture of dorsal root ganglion neurons from new born ratsZhang Yuyao1, Liang Chen1, HU Xueyu(corresponding author)21 Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China2 Department of orthopaedics, Xijing hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China【Abstract】Objective To establish an simple, efficient, reliable method for the purification culture system of dorsal root ganglion neurons derived from new born rats. Methods Dorsal root ganglions harvested from new born SD rats were digested with the mixture of trypsin and collegonease Ⅳ, then turned into single cell suspension and plated in neuralbasal media. The purified rate was evaluated according to cell count and β-tubulinⅢ immunocytochemistry stain. Results Cultured dorsal root ganglion cells could survive healthily. The purification rate of neurons was（92±6）%. Conclusion The method, which is used for culture and purification of DRGn, is a simple, efficient and reliable way. Using it could obtain highly purify neurons.【Key words】Dorsal root ganglion; Animal experimentation;Cell Culture;Purification背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到人们的重视。
大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究
文章编号:100025404(2001)1221425203论著大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究李 巍,蔡文琴,姚忠祥 (第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室,重庆400038) 提 要:目的 建立基因工程化神经干细胞以便为生物医学应用提供材料。
方法 ①分离、培养胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素(Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝2200(NF2200)、胶质纤维酸性蛋白(G FAP)免疫组化染色鉴定分化细胞。
②用含有脑源性神经营养因子(BDNF)的复制缺陷型腺病毒感染神经干细胞,并用原位杂交检测。
结果 ①获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞。
②约80%～90%神经干细胞能被腺病毒感染,且经传代培养12代后仍具干细胞特性。
结论 从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞。
经基因工程化及传代后,仍具干细胞特性,可作为基础研究及神经移植供体,具有广阔应用前景。
关键词:神经干细胞;基因工程;细胞培养 中图法分类号:R322.8;R2332 文献标识码:AIsolation,culture and transfection of neural stem cells from fetal rat telencephalonLI Wei,C AI Wen2qin,Y AO Zhong2xiang(Department of H istology and Embry ology,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o establish the genetically engineered neural stem cells(NSCs)for further biomedical applications.Methods ①A f2 ter is olated from fetal rat telencephalon and identified with nestin immunocytochemical staining,NSCs were induced to differentiate.The differentiated cells were detected respectively with neurofinament(NF2200)and glial fibrillary acidic protein(G FAP)immunocytochemical staining.②Recombi2 nant brain-derived neurotrophic factor(BDNF)2adenovirus was used to in fect the obtained cells and the results were identified with in situ hybridiza2 tion.Re sults ①Nest2like clusters of neural stem cells were obtained in the suspension and the cells could be differentiated into neurons and astro2 cytes.②About80%-90%of NSCs were in fected by recombinant BDNF2adenovirus,which retaining the main characteristics of NSCs after12 passages of culture.Conclusion The cells from fetal rat telencephalon possess multipotency and self2renew ability and is believed to be BSCs of the central nerv ous system.S ince they retain their characteristics and differentiation ability after passages and genetic engineering,they can be applied widely in basic research and as grafts in neural transplantation. K ey w ords:neural stem cells;genetic engineering;cell culture 自从90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞以来,人们相继从各种动物及人的中枢神经系统内分离、培养了神经干细胞[1,2],因其具有很强的分裂、增殖及自我更新能力,打破了传统观点认为中枢神经系统细胞不能再生的观念,为中枢神经系统损伤修复及某些疾病的治疗带了新的希望。
SD大鼠海马神经干细胞体外培养与鉴定
SD大鼠海马神经干细胞体外培养与鉴定目的采用改良方法分离新生24h内SD大鼠海马神经干细胞（neural stem cells，NSCs），观察海马NSCs体外培养的生长状况及多向分化潜能，为后续实验研究奠定基础。
方法采用改良方法分离海马NSCs，用含终浓度为20ng/ml 的bFGF和EGF、2% B27添加剂、1%双抗、1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12（1∶1）培养基进行传代培养，每天定时在显微镜下观察NSCs生长状况。
应用免疫荧光细胞化学技术检测原代NSCs的巢蛋白（Nestin）及第3代的NSCs加胎牛血清诱导分化7d后的神经元（NSE）、星形胶质细胞（GFAP）及少突胶质细胞（MBP）的表达。
结果倒置显微镜下观察，培养的细胞具有不断增殖、成球的能力，接种24h后，细胞即呈现倍数增长，原代培养4d即可传代培养。
免疫荧光细胞化学技术鉴定结果，Nestin、NSE、GFAP及MBP表达阳性。
结论采用改良方法分离新生24h内SD大鼠海马NSCs，经典无血清NSCs条件培养基体外培养可获得的NSCs具有较强的存活、增殖和成球能力及多向分化潜能。
标签：海马；神经干细胞；培养；鉴定神经干细胞（neural stem cells，NSCs）存在哺乳动物胚胎期的大部分脑区，而成体NSCs主要存于脑室周、海马齿状回的颗粒下层、脊髓等部位，其中以海马齿状回的颗粒下层分布较多[1]，因此成体NSCs的研究多以海马脑区多见。
传统分离细胞方法采用胰蛋白酶消化方法结合机械吹打方法。
但胰蛋白酶消化方法分离细胞存在许多弊端，比如消化过度及终止消化所用的血清对NSCs生长干扰的问题。
本实验通过单纯机械吹打方法分离提取乳鼠的海马NSCs，可以完全将海马组织吹打成单个的细胞，所获得的细胞在体外培养的过程中，表现出较强存活、增殖、成球能力和多向分化的潜能。
1.材料1. 1动物1.1 清洁级、新生24h内、雌雄不限SD大鼠10只，由广州中医药大学实验动物中心{许可证号：SCXK（粤）2008-0020}提供。
神经干细胞培养与鉴定
．1神经干细胞的原代培养1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。
2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔组织后，放入D．Hanks液中冲洗。
．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。
收集细胞悬液后先后在100目和200目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。
4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。
5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。
(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)．2神经干细胞的传代大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d后成为悬浮生长的神经球。
将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。
同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。
Nestin免疫组化检测步骤：1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；3)PBS浸洗3min 2次，去上清；4)Triton液破膜10 min；5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。
大鼠神经干细胞 大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定
《大鼠神经干细胞大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定》
摘要：建立神经干细胞分离、培养、鉴定技术，采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定神经干细胞，用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力，通过鉴定确为神经干细胞
摘要：目的建立神经干细胞分离、培养、鉴定技术。
观察神经干细胞生长、增殖特点。
方法
利用无血清培养，从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞，进行体外扩增培养、传代观察。
采用荧光免疫细胞化学检测技术，观察鉴定神经干细胞。
结果从胚胎大鼠海马、纹状体
等区分离的细胞具有增殖能力，可进行传代培养，获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞，显微镜下观察到典型的干细胞特征。
结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和
增殖能力，通过鉴定确为神经干细胞。
关键词：神经干细胞；细胞培养；胚胎大鼠；荧
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大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol一、大鼠神经干细胞分离和传代步骤手术前准备1. 水浴锅温度调至37°C。
2.组织解离液置95%O2 5%CO2 培养箱中10min。
3. 用95%乙醇消毒解剖区。
4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用无菌dH2O 冲洗，浸泡在95%乙醇中）。
5.在3 个60 ×15 mm 皿中各加3ml 的组织解离液。
提示：除无菌显微解剖器材外，还要三套消毒器械，分别用于剥离皮肤、颅骨和脑，减少用手污染的机会。
消毒过的解剖器械可以浸泡在无菌组织剥离液中，以避免乙醇接触组织。
分离脑组织6.新生SD大鼠(出生48h内)直接断头。
7.剃去头顶的毛发。
8.用浸泡过聚维酮碘消毒的纱布擦洗头部并且去除松散的毛发。
9.用泡过95％乙醇消毒纱布擦洗头部。
10.用手术刀片延中线全长切开头皮。
11.掀开皮肤显现出头盖骨。
12.从双耳后切开头皮暴露头盖骨侧面。
13.用小剪刀在两边切开头盖骨（打开头盖骨上部，避免损伤脑组织）。
14.用镊子掀开头盖骨。
注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接触脑组织。
乙醇能使组织固定。
15.用弯镊在脑底部滑动以切断连接脑底部的脊髓、血管和颅神经。
提示：用弯镊时轻微向下用力抵住脑下面的颅底。
来回滑动松动脑组织。
16.取脑组织，D-Hanks液充分漂洗后.17.用同一个弯镊将脑移到盛有解离液的60mm 皿中。
18.剥离大脑表面的脑膜，冲洗干净，把脑放入第二个盛有解离液的60mm 皿中。
提示：在解剖显微镜下很容易剥离脑膜。
19.解剖镜下，沿中线切开大脑，精细镊分离海马。
20.将分离组织放置于第三个盛有解离液的60mm 皿中。
21.用10 号弯头手术刀将组织切成小块（约1 mm3）分散脑组织22.将盛有小块组织的培养皿移到超净台，然后用移液管将组织块移到5ml 的圆底聚丙烯管中。
23.250g 离心1min。
24.弃上清，加入酶混合液（1ml）。
25.将试管水浴至少40min，每隔20 分钟用移液管适当吹打。
26. 250g 离心5min，弃上清。
27.加入4ml 蛋白酶抑制剂。
28.用移液管吹打10 次以分散沉淀，注意尽量别产生气泡。
29. 水浴10min。
30. 500g 离心5min，弃上清。
31.用0.5ml SFM 重悬细胞，充分吹打以产生单细胞悬液。
提示：建议用火焰钝化的小抢头制备单细胞悬液。
接种细胞32. 用血细胞计数器计数并调整活细胞浓度。
台盼兰染色排除死细胞。
提示：接种10-15 cells/ul有利于建立单个神经球的培养。
如果不做克隆分析且想获得更多神经球，可提高接种密度（如50-100 cells/ul）。
高密度接种可加快神经球的形成，并缩短首次传代时间间隔。
用血细胞计数器和台盼兰测定细胞活性在24 孔板每孔中加入0.5ml 含细胞SFM。
33. 在24 孔板每孔中加入0.5ml 含细胞SFM。
34. 37°95% air 5% CO2 培养。
神经球的传代提示：在合并培养物前应检查每个孔是否污染，特别是在第一次传代时。
严重污染使PH 值降低，培养液颜色明显改变（变黄）。
轻微污染也较常见，无法通过观察培养液颜色判断，需在相差显微镜下观察。
如果你忽略了一个污染孔，下一代的所有孔都会被污染！1.将所有神经球和培养液移到15ml 锥形管。
2. 200g 离心5min。
3.弃上清，加入2ml TrypLETM。
4.用移液管混合神经球和TrypLETM。
5. 37°水浴20min。
6. 500g 离心5min。
7.弃上清，加0.5ml SFM 重悬细胞。
8.用移液管吹打（60－70 次）提示：吹打过程中避免产生气泡。
过多气泡会降低活细胞数并增加污染机会。
9. 用台盼兰计数细胞密度，排除死细胞，按所需密度接种到新24 孔板。
95% air 5% CO2 37°培养。
提示：神经球传代的最佳时间常根据试验需要和时间安排确定。
如果平均每孔至少25 个神经球，那么可以传2 个板。
如果有50 个神经球，那么很容易从原24 孔板传3 个板。
镜台测微尺可标准化相差显微镜的目镜焦距。
便于快速确定神经球的大小。
神经球的冻存和复苏1. 将含有神经球的培养液从24 孔板移入15ml 圆锥管。
2. 200g 离心5min。
3. 弃上清，用10ml 含15％DMSO 的SFM（不含EGF 和FGF）重悬细胞。
4.用移液管轻轻混匀，分装1.5ml 每管（聚丙烯冷冻管）。
5. －80°冰箱过夜。
6. 次日晨转移至液氮罐保存。
提示：如果不能使用液氮，神经球可以在－80°保存几周。
活神经球数量会随－80°存放时间延长而减少。
7.准备复苏神经球，将冷冻管从液氮中取出，在超净台内回复至室温。
8.将冷冻管内容物转入含有10ml SFM 的15ml 圆锥管中。
9. 200g 离心5min，弃上清。
10.用4ml SFM 轻轻混匀。
11. 按每孔0.5ml 种8 个孔（24 孔板），37°95% air 5% CO2 条件下培养。
提示：小神经球比大神经球（直径大于100um）更易复苏成活。
在组织培养基中，神经球复苏成活率很低（小于20％）。
建议每孔至少种50－100 个神经球。
通过提高冷冻神经球密度或在冷冻液中加入20％胎牛血清可提高复苏成活率。
但要牢记胎牛血清可以诱导分化。
二、大鼠神经干细胞增殖能力检测将BrdU溶于SFM 培养基，过滤除菌后加入神经球形成后分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
三、大鼠神经干细胞分化能力检测选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的SFM 培养基)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin 免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。
另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、免疫细胞化学染色。
注：1) TuJ1是一种被认为参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白。
2) GFAP是神经系统星形胶质细胞活化的标志物。
3)Nestin是巢蛋白，是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物；可能对神经元的分化有作用。
Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止。
为神经干细胞的特征性标志物。
4)神经球转入含血清培养液的24孔板, 24 h 后大部分贴壁; 可见有单个细胞从神经球内游出,贴壁生长,分散存在,可向四周发出放射状条索,与周围细胞互相联接。
2 d后突起不断增粗和伸长,形态不规则; 5 d左右克隆基本分化成形态不一, 分散成突起多少不等的三种类型细胞: ①细胞体呈圆形或椭圆型、突起少但很长、折光性强的神经元样细胞, TuJ1免疫染色呈阳性反应,表明神经干细胞已部分分化为神经元; ②胞体较大、突起较多较粗、细胞数量较多的星形胶质样细胞,其折光性弱, GFAP免疫染色呈阳性反应;③细胞胞体最小,数量也最少,具有多个细胞突起,突起较短、较细、且不断分枝,考虑为少突胶质细胞样细胞。
NSCs由BrdU掺入后,分化培养的细胞中大多数显微镜下可见BrdU免疫染色阳性。
表一、所需仪器列表仪器名称数量CO2 1解剖显微镜 1水浴锅 1显微分离器材4套手术刀片1套生物安全柜 1台式离心机 1相差显微镜 1表二、所需耗材列表耗材名称数量公司货号报价（元）60×15 mm 组织培养皿40个Falcon cat. no. 353002122.824孔细胞培养板10个Falcon cat. no. 3530471625 ml 聚丙烯圆底管20个Falcon cat. no. 352063137.415 ml 聚丙烯圆椎管20个Falcon cat. no. 352095174.650 ml 聚丙烯圆椎管10个Falcon cat. no. 352070114.8表三、组织解离液配方组织解离液2.0M NaCl 15.5ml1.0M KCl 1.25ml1.0M MgCl2 0.8ml155mM NaHCO3 41.9ml1.0M Glucose2.5ml108mM CaCl2 0.23ml蒸馏水188.0ml此分离液在4度过滤和储存在使用之前在95% O2和5% co2中充气10分钟。
表四、消化酶混合液配方消化酶混合液报价（元）Trypsin(sigma. cat.no.T5266) 0.04g 534.69Type-1-S Hyaluronidase(sigma. cat.no.H3506) 0.02g 1,075.23 Kynurenic acid(sigma. cat.no.K3375) 0.004g 1,387.62此消化酶溶液溶解于30ML组织分离液中，并用0.22um的膜过滤，分装成1ML，储存于-20度冰箱。
表五、无血清培养液配方无血清培养液（SFM 100ml）报价（元）DMEM/F12(Invitrogen cat. no. 11330-032)94.3ml 404 30% Glucose 2.0 ml1.0M Hepes Buffer 0.5ml孕酮（1000X） (Sigma cat. no. P-8783)0.1mlPutrescine（100X）(Sigma cat. no. P5780) 1.0ml 286.65 B27 Growth supplement (Invitrogen cat. no. 17504-044) 2.0 ml 1190 EGF(Sigma cat. no. E4127)20ul 1728.09 FGF(Sigma cat. no. F0291)20ul 1,291.68 TSITSS(Cyagen cat. no. ITSS-10201-10) 100ul 490 肝素(Sigma cat. no. H3149)7.32ul 4,829.76新开封的DMEM/F12（500ml）培养基中需要增加8ML 15%的NaHCO3溶液并储存于4度表六、抗体和试剂列表抗体名称数量公司货号报价（元）Nestin 1Abcam-ab931574,189TuJ1 1Abcam-ab145454,595GFAP 1Abcam-ab72604,443Brdu 1Abcam-ab63264,443 TrypLETM express 1 Invitrogen-12604-021 605BrdU Labeling Reagent 1Invitrogen- 00-0103713实验风险：1.神经球的形成：此实验即使严格按照protocol来操作，也会伴随着很多不确定的风险。