β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究
银杏悬浮培养细胞中黄酮糖苷提取动力学研究
中 图分 类号 ： ￥ ５ ６ ７ ． １
引 言
银 杏 黄 酮具 有 抗 菌 、 抗 氧化 和 抗 肿瘤 等 诸 多 作
用， 是一 种 应用 广 泛 的 制药 原 料 。 目前 从 药 用 植 物 中提取 黄 酮 类 化 合 物 及 其 他 活 性 成 分 的研 究 非 常 多， 常 用方 法如 水 提法 、 酶法 、 超 声 波 辅 助 提 取 法 等 ， 从实 验室 小试 到 大 规 模 提取 用 作 工 业 原 料 都 已有 成功 的报 道 。鉴于 药用植 物 原料来 源 的数 量 和季节 局 限性 ， 不少 学 者 在 人 工 条件 下 培 养 药 用 植
高浓 度 硝 普 钠 可 以 促 进 黄 酮 类 物 质 的 合 成 ； 在
悬 浮培 养 细 胞 中添 加 内 生 真 菌 能 促 进 细 胞 中 黄 酮
０ ． ０ ５ ｍ ｇ ／ ｍＬ备 用 ； 去离 子水 。
Ｌ Ｓ － Ｂ ５ ０ Ｌ型 高压 灭 菌 锅 ， 上 海华 线 医 用 核 子 仪
Ｖｏ １ ． ４０．Ｎｏ． ２
２ ０１ ３
银 杏 悬 浮 培 养 细 胞 中黄 酮 糖 苷 提 取 动 力 学研 究
邵 菊芳 朱红 威 张 兴 刘炯 天
（ 中 国 矿 业 大 学 化 工 学 院 ，江 苏 徐 州 ２ ２ １ １ １ ６ ）
摘
要 ：利 用 醇 提 法 从 人 工 悬 浮 培 养 银 杏 细 胞 中提 取 黄 酮 糖 苷 。 以扩 散 传 质 定律 为基 础 ， 根据质量平衡方程 ， 建 立
合 成 。Ｄ ａ ｎ ｏ ｖ ａ等发 现 金 丝桃 细胞 悬 浮 培 养 基 中 不添加苄胺 基腺 嘌呤 （ Ｂ Ａ） 会 导 致 总 酚 和 黄 酮 含 量 的增加 。
β-葡萄糖苷酶水解射干苷的研究
第39卷第3期2 0 2 1年3月中华中医药学刊C H I N E S E A R C H I V E S O F T R AD I T I O N A L C H I NE S E M E D I C I N EVol.39 No. 3Mar. 2 0 2 1D01：10. 13193/j. issn. 1673-7717.2021.03.011 P-葡萄糖苷酶水解射干苷的研究邹桂欣，辛旭阳，刘晶，尤献民，王光函，李国信(辽宁省中医药研究院，辽宁沈阳110034)摘要：目的采用P-葡萄糖苷酶水解射干苷，并对其酶水解动力学进行初步研究。
方法以射干苷的水解转化率为指标，考察各反应因素对射干香转化率的影响，并计算酶解反应动力学参数结果射干苷的最佳水解条件为反应时间20 m in;溶液f)H值为5.0,反应温度65 X；,酶浓度100 U. m L'底物初始浓度0. 118 mmo] •L-、在此条件下，射干苷水解转化率达到8〇%以上。
该水解反应过程符合单底物Michaelis M enten方程，其中Vmax(最大反应速率）值为2〇.83 mmol • (L M• m in」），Km(米氏常数）值为0.21 mmol • L — 1:结论采用P-葡萄糖苷酶水解射干普制备鸢尾黄素可行。
关键词：射干苷；鸢尾黄素；P-葡萄糖苷酶；水解;酶动力学中图分类号：R284.丨文献标志码：A 文章编号：丨673-7717(202丨）03^00404)4Study on Hydrolyzing of Tectoridin with (3 -glucosidaseZOU Guixin,XIN Xuyang,LIU Jing,Y0U Xianmin,WANG Guanghan,LI Guoxin(Liaoning Institute of Chinese Medicine, Shenyang 110034 ,Liaoning, China)AbsitSiCX： Objective The p - glucosidase was used to hydrolyze tectoridin and its enzymatic hydrolysis kinetics was studied. Method The effect of various reaction factors on the hydrolysis conversion rate of tectoridin was investigated and the kinetic parameters were calculated. Result The optimal technological parameters of hydrolysis were as the following. The reaction time was 20 min. The pH value was 5. 0 and the hydrolysis temperature was 65 X!. The enzyme concentration was 100 U •mL _l and the initial substrate was 0. 118 mmol • L-1. Under these conditions, the hydrolysis conversion rate of ectoridin reached more than 80%. The hydrolysis process conformed to the single substrate Michaelis Menten equation, where the maximum reaction rate (Vm) was 20. 83 mmol • (L"1•min 1 ) , and the Km value was 0. 21 mmol • L 1. Conclusion It is feasible to prepare tectori- genin by hydrolyzing tectoridin with p - glucosidase. Commercial p - glucosidase may be a specific hydrolytic enzyme of tectoridin.Keywords： tectoridin ； tectorigenin ；p- glucosidase ； hydrolysis ；enzyme kinetics射干苷是中药射干的主要代表成分之-，具有抗炎、镇痛 等多种药理作用n,属于异黄酮苷类成分，水溶性良好，但脂 溶性不良，口服后吸收较差，在体内需要肠道菌群的代谢转化，已有研究资料报道，射干苷口服后，在体内的人肠菌（主要为 双歧杆菌、乳酸杆菌、链球菌和真细菌A-44)作用下被转化成 鸢尾苷元（鸢尾黄素）并被吸收后才会产生药理作用4_61。
利用PB设计筛选芽孢杆菌GUTU06产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的主要影响因子
利用PB设计筛选芽孢杆菌GUTU06产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的主要影响因子作者：杨运何腊平黄露肖虹来源：《山地农业生物学报》2021年第02期摘要：利用Plackett-Burman（PB）设计对芽孢杆菌GUTU06的固态发酵培养基的主要培养基组分及培养条件进行筛选，旨在提高GUTU06所产β-葡萄糖苷酶的酶活力，并将其应用于水解银杏黄酮苷为苷元。
结果表明蛋白胨和发酵时间为主要影响因子。
在PB设计的基础上，获得了初步优化的培养条件，优化后β-葡萄糖苷酶的酶活力为0.9914 U/g，较初始培养基提高了3.8倍。
本文为β-葡萄糖苷酶实现工业化生产奠定基础，同时也为酶法水解银杏黄酮苷的研究提供一定参考依据。
关键词：Plackett-Burman（PB）设计; 主要因子; 芽孢杆菌; β-葡萄糖苷酶 ;银杏黄酮苷中图分类号：TQ925文献标识码：A文章编号：1008-0457（2021）02-0080-04国际DOI编码：10.15958/ki.sdnyswxb.2021.02.014Abstract：The main medium components and culture conditions of the solid fermentation medium of Bacillus sp.GUTU06 were screened by Plackett-Burman （PB） design to improve the enzyme activity of β-glucosidase，which is produced by GUTU06 and applied to hydrolyze ginkgo flavonoid glycosides into aglycones.The results of the experiment determined that peptone and fermentation time were the main influencing factors.On the basis of PB design，the initial optimized culture conditions were obtained.After optimization，the enzyme activity of β-glucosidase was0.9914 U/g，which was 3.8 times higher than that of the initial medium.This paper lays a foundation for the industrial production of β-glucosidase，and also provides a reference for the study of enzymatic hydrolysis of ginkgo flavonoid glycosides.Keywords：Plackett-Burman （PB） design; ma in factor;Bacillus;β-glucosidase; ginkgo flavonoid銀杏叶（Ginkgo biloba L.）提取物是目前国际上使用较为广泛的中草药之一，主要药效成分是黄酮类化合物[1]。
(完整版)银杏叶黄酮类化合物的提取研究进展
银杏叶黄酮类化合物的提取研究进展银杏树Ginkgo biloba L.又称白果树、公孙树，是我国古老的树种之一，具有“活化石”的美称。
由于其生长规律特殊，抗病能力强而受到国内外的重视。
有关银杏叶的有效成分及疗效的研究日益受到重视，已开发出保健品、化妆品、药品等多达100多种，形成国际市场上销售额20多亿美元的新兴产业。
银杏叶的化学成分有黄酮类、萜类、内酯类、酚酸类以及生物碱、聚异戊二烯等化合物。
黄酮类为银杏叶的主要有效成分之一，含量随品种、产地、树龄、不同的采摘时间而不同。
黄酮类化合物优异的抗氧化、抗病毒、防治心血管疾病、增强免疫力等作用而受世人瞩目。
药学研究表明，有38种银杏黄酮类化合物从银杏叶中分离出来，其中黄酮类化合物主要有3类：黄酮(醇)及其昔28种：如槲皮黄酮等；黄烷醇类：如儿茶素等4种；双黄酮：如白果双黄酮等6种(儿茶素)。
1 银杏叶黄酮的提取分离1.1 溶剂提取法目前国内外掀起了研究开发银杏叶热。
国内银杏叶常用溶剂例如乙醇、丙酮、醋酸乙酯、水以及某些极性较大的混合溶剂浸泡银杏叶进行提取，溶剂提取方法一般有：煎煮、冷浸、回流、渗施等经典方法。
1.1.1 水提取树脂分离法有关水浸提银杏黄酮苷的文献报道不多。
肖顺昌等报道了用l6倍量沸水分3次浸提银杏叶，得到的水溶液，经冷藏、分离杂质得溶液，然后用D101型吸附树脂吸附得到浓度达38％的黄酮苷。
胡敏等研究水浸提银杏叶黄酮苷并用树脂精制的工艺，探讨了影响黄酮苷浸出的主要因素以及最适的精制方法，结果表明：水为提取剂，在90℃水溶回流浸提银杏叶2次，4h／次，经沉淀，过滤，浓缩后，用树脂精制、冷冻干燥后，制得总黄酮苷含量高的提取物、产品得率为银杏叶干重的 1.2％-1.5％。
水提取成本低，没有任何环境污染，产品安全性高，但是水对有效成分的选择性差，提取率低。
1.1.2 有机溶剂浸提法一般的有机溶剂浸提法。
田呈瑞等研究了乙醇浸提银杏叶黄酮的方法。
银杏黄酮醇苷水解条件的正交实验研究
摘要： 目的 ： 察 复 方 银 杏注 射 液 中银 杏 黄 酮 苷 含 量 测 定 的 水 解 条 件 。 方 法 ： 用 正 交 设 计 法 ， 察 水 解 时 间 （ 、 解 温 考 采 考 Ａ） 水 度 （ ） 盐 酸 浓 度 （ ３个 因 素 对 高 效 液 相 色谱 法 含 量 测 定 的 影 响 。 结 果 ： 化 后 的 水 解 条 件 为 ： 解 １ ５ ， Ｏ 恒 温 水 浴 ， Ｂ 、 Ｃ） 优 水 ．ｈ ８ ℃
Ａ ｉ ｎ １０高效 液 相 色 谱 系 统 （ ｇｌ ｔ１ ０ ｅ 四元 泵 、 自动 进 样 器 、 柱温 箱、 变波 长扫描紫外检 测器） 可 。ＫＤ一 ９ 一 Ｉ 电热 恒 ８ 型
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图 ｌ 对 照 品 及 供 试 品 色 谱 图
２ １ 色 谱 条 件 与 系统 适 用 性 ．
色 谱 柱 Ｚ ｒａ Ｂ—Ｃｌ （ ４ ６ ｏ ｂ ｘＳ ８ ５ ｍ，．ｍｍ ×１ ０ 柱 ５ｍｍ） 流动 ， 相 为 甲 醇 一 ０ ４ 磷 酸 溶液 （ ５ ５ ） 检 测 波 长 为 ３ ０ ｍ ， 速 ． ４ ：５ ， ６ｎ 流 １Ｏ ・ ｉ＿ ， 温 ３ 进 样 量 １ 。理论 板 数 按 槲 皮 素 峰 ． ｍｌ ｒ ｎ 。柱 ａ ０ Ｃ， Ｏ１ 计 算 不 低 于 ２ ０ ， 鼠李 素 分 离 度 大 于 １ ５ 各 峰 的 确 认 和 分 ５０异 ．， 离见图 １ 。
司 ） 。
现 ， 照 药 典 水 解 方 法处 理 １ 同 批 次 的 供 试 品 含 量差 异大 ， 参 的 所 以有 必 要 对 供 试 品 的 水 解 条 件 进 行 优 化 和 严 格 控 制 ， 其 为 质量标准的制定提供依据 。
固定化β-葡萄糖苷酶转化糖苷型异黄酮的研究
Ａｐ ． ２０ ７ ｒ ０
文章编号：１ ０ ・０５２ ０ ）２０ ０ －６ ０ ３ １ （ ７０ －３４０ ９ ０
固定化ｐ葡萄糖苷酶转 化糖苷型异黄酮的研 究 ．
陈庆庆， 夏黎 明
（ 大学 化学工程 与生物工程 学 系， 浙江 杭州 ３０２） 浙江 １０７
摘 要 ：利用 固定化 Ｂ葡萄糖 苷酶把糖苷型异黄酮水解成苷元型异黄酮 ，可 以提高大豆异黄 酮的生理活性 。用海 藻酸 ．
（ ｅ ａ ｍｅｔ ｆ ｈ ｍ ｃｌｎ ｉ ｈ ｍ ｃ ｎ ｉ ｅｉ ， ｈｊ ｇＵ ｉｅ ｉ ， ｎｇｈ ｕ３ ２ ， ｈｎ） Ｄ ｐｒ ｎ ｏ ｅ ｉ ｄＢｏ ｅ ｉ Ｅ ｇ ｅｒ ｇＺ ｅｉ ｎｖｒ ｔ Ｈａ ｚｏ １０ ７ Ｃ ｉａ ｔ Ｃ ａａ ｃ ｌ ａ ｎ ｎ ｎ ａ ｓｙ ０
ｇｕｏｉｅ ｏ ａｏ ｅｃｎｅｔ ｔ ｎｉ １ ｇｍ ～．ｈ ｏ ｍ ｆｍｍ ｂｌ ｅ －ｌｃｓ ａｅ ｅｄ ｓｄｉ５ ｌｃｓ ｓ ｓｆ ｖ ｎ ｏ ｃｎ ａ ｏ ． ｍ 、Ｌ ｔｅ ｌ ｅ ｉ ｏ ｉｚｄ１ｇ ｏｉｓ ａｓ ｅ ％ ｄ ｉｌ ｒｉ ｓ ２ ｖｕ ｏ ｉ ３ ｕ ｄ ｂ ｕ ｓ
Ａｓ ｒ ｉｌｓ ｎｉｅ ｐ ｒ ｓ ｎｏ ｈ ｃ ｃｕ ｐｅ ｇ ｌｕ ｇ ｒ ｓ ｏ ｅ ｉ ｔ ｔｅ ａ ｉｍ ａｇ ｎ ｔ ．Ｔｈ ｅ ｅ ｔ ｏ ｕ ｓ ａｅ ｏ ｃ ｎ ａｉ ｎ ｌ ｌ ｉ ａｅ ｅ ｆ ｃｓ ｆ ｓ ｂ ｔ ｔ ｃ ｎ ｅ ｔ ｔｏ ，ｐＨ ｖ ｕ ａ ｄ ｒ ｒ ｌ ａ ｅｎ
钙包埋富含１葡萄糖苷酶 的黑 曲霉孢子 ， 以方便有 效地 固定１ 葡萄糖苷 酶。研究考察 了不 同底物浓度 ， Ｈ和温度对 ３ ． 可 ３ － ｐ 固定化１葡 萄糖苷 酶酶解 作用 的影响，以及重复分批酶解条件下固定化酶的稳定性。 当固定化酶珠体积 占反应 总体积 ３ ． 的５ ％，糖苷型异黄酮浓度为 １ ｍ ． Ｌ ，作用 ２ ｈ ｇ ～ ２ ｍ ４ ，酶解 效果 良 。其中，大豆 苷比染料木 苷易于被酶解。固定化 好 酶适宜的 ｐ Ｈ范围为 ３ ５ ～ ，最适 ｐ Ｈ值 为 ４８ ． 。耐热性 比固定化前有所增加 ，在 ７ ℃以下酶较 稳定。重复分批 酶解糖苷 Ｏ 型异黄酮 ，连续 ７ 批的转化率均可保持在 ９ ％以上 。该研究结果在大豆异黄酮的生物转化方面具有潜在 的应用前景 。 ０ 关键词：固定化１葡萄糖苷酶；糖苷型异黄酮：苷元 型异黄酮 ：酶水解 ３ ． 中图分类号：Ｏ５６ ；Ｑ １ ． ５． ８４ ２ ２ 文献标识码 ：Ａ
_葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究
β2葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究伍毅1,王洪新1,23 (1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003)摘要 采用β2葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。
通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。
由HP LC图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。
酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。
关键词 银杏叶提取物;黄酮苷元;β2葡萄糖苷酶;水解中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)01-00030-03Study on H ydrolyzing G inkgo F lavone G lycoside w ithβ2glycosid aseWU Yi et al (S tate K ey Lab oratory of F ood Science and T echn ology,Sch ool of F ood Science&T echn ology,S outhern Y angtze University,W uxi,Jiangsu 214012)Abstract β2glycosidase was used to hydrolyze the extract from ginkg o leaves to trans form flav one glycoside into flav one aglycone.T he optimum techn o2 logical param eters of hydrolysis were obtained through orth og onal ex perim ent,which were enzym e concentration of5×10-3m g/m l and pH value of5.0, hydrolysis tem perature of40℃and tim e of6h.It was kn own from HP LC spectrogram that the aglycone yield of hydrolysis under this condition was9.08%w ith purity of68.24%.In the enzym olysis products,the active ingredients such as ginkg o lactone were als o reserved partly,which was in fav orof reserving the synthesized bioactivity of ginkg o leaves extract.K ey w ords G inkg o leaves extract;Flav one aglycone;β2glycosidase;H ydrolysis 银杏(G inkgo biloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。
固定化_葡萄糖苷酶转化糖苷型异黄酮的研究_陈庆庆
的 5％，糖苷型异黄酮浓度为 1.2 mg⋅mL−1，作用 24 h，酶解效果良好。其中，大豆苷比染料木苷易于被酶解。固定化
酶适宜的 pH 范围为 3~5，最适 pH 值为 4.8。耐热性比固定化前有所增加，在 70℃以下酶较稳定。重复分批酶解糖苷
型异黄酮，连续 7 批的转化率均可保持在 90％以上。该研究结果在大豆异黄酮的生物转化方面具有潜在的应用前景。
陈庆庆, 夏黎明 (浙江大学 化学工程与生物工程学系, 浙江 杭州 310027)
摘 要：利用固定化β-葡萄糖苷酶把糖苷型异黄酮水解成苷元型异黄酮，可以提高大豆异黄酮的生理活性。用海藻酸
钙包埋富含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉孢子，可以方便有效地固定β-葡萄糖苷酶。研究考察了不同底物浓度，pH 和温度对
固定化β-葡萄糖苷酶酶解作用的影响，以及重复分批酶解条件下固定化酶的稳定性。当固定化酶珠体积占反应总体积
在反应器中分别加入糖苷型大豆异黄酮母液适量，并用蒸馏水稀释至 100 mL，使浓度分别为 0.3 mg⋅mL−1，0.6 mg⋅mL−1，1.2 mg⋅mL−1，1.8 mg⋅mL−1 和 2.4 mg⋅mL−1，调 pH 为 4.8，各加入占总反应体积 5％固定化凝胶珠，在 50℃条件下反应。于 6 h，12 h，24 h，36 h 和 48 h 分别取样，用无水乙醇稀释至 适当浓度，离心 15 min(12000 r⋅min−1)，取上清液，进行 HPLC(高性能液相色谱法)测定。 2.4.2 重复分批酶解工艺
在反应器中加入 100 mL 糖苷型异黄酮和占总反应体积 5％固定化凝胶珠，在 pH 4.8、50℃条件下反
306
高校化学工程学报
2007 年 4 月
应一定时间后，倒出反应液，加入新鲜底物继续进行下一批酶解反应，重复多批。每批反应液取出后，
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β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究伍毅1,王洪新1,2*(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003)摘要采用β-葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。
通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。
由H P L C图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。
酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。
关键词银杏叶提取物;黄酮苷元;β-葡萄糖苷酶;水解中图分类号Q946文献标识码 A 文章编号0517-6611(2008)01-00030-03S tud y on H y dro ly z in g G in k go F la v on e G ly c o s id e w ithβ-g ly c o s ida seW U Y i e t a l(S ta te K ey L abo ra to ry o f F o od S cien ce an d T e chn o lo gy,S ch oo l o f F o od S cien ce&T ech n o log y,S ou th e rn Y an g tze U n ive rsity,W u x i,J ian gsu 214012)A b s tra c tβ-g lyco sidase w a s u sed to h yd ro ly ze th e ex tract fro mg in k go lea ves to tran s fo rmflavon e g lyco side in to flavon e a g lycon e.T h e op ti m umtech n o-log ica l pa ram e te rs o f h yd ro lys is w e re obta i n ed th rou gh o rth o gon a l expe r i m en t,w h ich w e re en zym e con cen tra tion o f5×10-3m g/m l an d pH v a lu e o f5.0,h ydro ly sis tem pe ra tu re o f40℃an d ti m e o f6h.It w as k n ow n from H P L C spectrog ramth a t th e ag ly con e y ie ld o f h ydro ly sis u nde r th is con d ition w a s9.08%w ith pu r ity o f68.24%.In th e en zym o lys is p rodu cts,th e a ctive in g redien ts su ch a s g i n k go la cton e w e re a lso rese rved pa r tly,w h ich w as i nfa vo ro f re se rv in g th e syn th e sized b io activ ity o f g in k go lea ves ex tract.K e y w o rd s G in k go lea ve s ex tract;F la von e ag ly con e;β-g ly cos idase;H yd ro ly sis银杏(G inkgo b iloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。
银杏叶中含有丰富的黄酮类物质,,主要是由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键联接而成,具有广泛的药理作用,是极好的天然抗氧剂。
现代研究表明,银杏黄酮被水解成苷元后清除人体氧自由基的生物活性要明显高于黄酮糖苷,黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍[1-2]。
因此,改善黄酮的构型是提高银杏黄酮在人体内吸收率的重要途径。
笔者采用生物酶法水解银杏黄酮,生成了具有更高生物活性的苷元型黄酮,而且具有环保、反应条件温和等优点。
1材料与方法1.1材料银杏叶提取物(G BE),黄酮含量≥24%,由上海宝丰生物有限公司提供。
β-葡萄糖苷酶由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。
槲皮素标准品,纯度≥99.0%,由上海康九化工有限公司提供。
1.2 GBE的酶解工艺[3]称取5m gβ-葡萄糖苷酶,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值5.0)定容至100m l。
然后,称取一定量的银杏叶提取物,适量甲醇溶解,加入缓冲溶液和酶,置于水浴锅中恒温水解,将水解液高速离心、过滤后,沉淀用无水甲醇溶解,再上旋转蒸发器以除去多余的溶剂,恒重后用10m l无水甲醇充分溶解得样液,0.45μm滤膜过滤后待测定。
1.3 总黄酮苷元的测定方法1.3.1分析条件[4]。
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(15 m m×6.0m m,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇∶水(0.5%磷酸)梯度洗脱;流速:1m l/m in;检测波长:368nm;进样量:10μl。
1.3.2 计算方法。
由文献可知,对照品溶液、换算因子的选用不同对测定结果的影响较小。
同时,受对照品来源的限制,3种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作作者简介伍毅(1983-),女,四川通江人,硕士研究生,研究方向:食品功能性成分。
*通讯作者。
收稿日期2007-08-21曲线进行定量分析[5]。
计算公式如下:C(%)=[(A1+A2+A3)×K+B]×VW×100%(1)式中,A1为槲皮素峰面积(m A u);A2为异鼠李素峰面积(m A u);A3为山奈酚峰面积(m A u);K为槲皮素标准曲线斜率(m g/m l);B为槲皮素标准曲线截距;V为样品溶液体积(m l);W为样品重量(m g)。
1.3.3 槲皮素标准曲线的制作[6]。
准确称取对照品槲皮素0.02g,置于100m l容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得槲皮素标准储备液(0.20m g/m l)。
用移液管分别取槲皮素标准储备液2.5、5、10、20、40m l,用无水甲醇定容至50m l容量瓶,得0.01、0.02、0.04、0.08、0.16m g/m l的标准溶液。
分别取标准溶液和储备液进样10μl,测定峰面积。
根据标准品的浓度和峰面积可得回归方程:y=7×10-5x-0.0058(2)r=0.99(n=5),线性范围为0.01～0.10m g/m l。
1.4 单因素试验影响酶解工艺效果的因素主要有时间、温度、酶浓度及pH值等[7]。
该试验分别研究了不同因素对GB E酶解效率的影响。
1.5 最佳工艺参数的确定在单因素试验的基础上,为了进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次,采用正交试验设计方法进行优化[8]。
表1为酶解试验正交试验因素水平表。
表1 酶解正交试验因素与水平T a b le1 F a c to rs a n dle v e ls o f o rth o g on a l te s t fo r e n zym o ly s is 水平L ev e lA(温度)T em pe ra tu re℃B(时间)T i m e∥hC(pH值)pHv a lu eD(酶浓度)E n zym e co n ce n tra t ionm g/m l 130540.025240650.005350760.0102结果与分析2.1 酶解单因素试验结果2.1.1 酶解时间的选择。
图1是固定酶解温度40℃,pH值安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2008,36(1):30-32责任编辑刘月娟责任校对马君叶5.0,酶液用量为1m l 即酶浓度为0.005m g/m l 时,水解3、4、5、6、7、8h 对酶解效率的影响。
从图1可以看出,当水解时间达到6h 时,水解效率最高;当水解时间超过6h ,水解基本趋于平衡,苷元含量不再增加。
所以,选择水解时间为6h 。
图1 酶解时间对酶解效率的影响F ig.1 E ffe c ts o f e n zym o ly s ist i m e o nth e e ffic ie n c y o f e n z ym a t ic h y -d ro ly s is2.1.2 酶解温度的选择。
图2是固定酶解时间6h ,pH 值5,酶液用量为1m l 时,温度对酶解效率的影响。
如果温度低于酶的最适温度,则酶的活力大为降低;而如果温度高于酶的最适温度,则酶可能变性失活,降低甚至失去催化能力。
从图2可以看出,随着酶解温度的升高,酶解效率逐渐增加,在40℃时达到最大值;之后,随着温度的升高,酶解效率明显下降。
这可能是由于随着温度的升高,β-葡萄糖苷酶的活力下降所致。
所以,选择酶解温度为40℃。
图2 酶解温度对酶解效率的影响F ig.2 E ffe c ts o f tem p e ra tu re o n e n zym o ly s is e ffic ie n c y2.1.3 pH 值的选择。
图3是固定酶解时间6h ,温度为40℃,酶液用量为1m l 时,pH 值对酶解效率的影响。
从图3可以看出,苷元含量随着pH 值的增加而不断提高,并且在pH 值为5时达到最大值,此后苷元含量急剧下降,说明β-葡萄糖苷酶在pH 值5左右酶解活力最高。
所以,选择水解液的pH 值为5。
2.1.4 酶浓度的选择。
图4是固定酶解时间6h ,温度为40℃,pH 值5时,不同酶浓度对酶解效率的影响。
从图4可以看出,苷元含量随着酶浓度的增大而增加,但是酶浓度达到5×10-3m g/m l 时,黄酮苷元基本不再增加。
这可能是由于在该酶浓度下酶与底物的结合已趋饱和。
所以,采用酶浓度为5×10-3m g/m l 。
2.2 酶解条件的优化 从表2可以看出,影响酶解效率因素的主次顺序为B>C>A>D 。
所以,优化后的酶解条件为A 2B 2C 2D 2,即当温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l ,在pH 值5的水解液中水解6h ,生成的苷元含量可达到18.35%。
图3 pH值对酶解效率的影响F ig.3 E ffe c ts o f pH v a lu e on e n zym o ly s is e ffic ie n c y图4 酶浓度对酶解效率的影响F ig.4 E ffe c ts o f e n zym e c o n c e n tra t io n o n e n zym o ly s is e ffic ie n c y表2 酶解正交试验结果T a b le 2 R e s u lts o f o r th o g o n a l te s t fo r e n zym o ly s is序号N o.水平L e ve lA B C D 苷元含量A g ly co n e con ten t ∥%11 1 1 1 9.342122216.523133311.714212313.455223114.59623129.58731329.728321310.64933219.83k 112.5210.839.8511.25k 212.5413.9213.3011.94k 310.0610.3712.0011.93R2.483.553.450.692.3 酶解前后银杏叶提取物及其产物的H PLC 图谱分析 从图5、6可以看出,GB E 经β-葡萄糖苷酶水解后产生了一系列新物质。