gateway重组技术
Gateway
LR反应
第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）
• 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目 的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表 达载体。目的载体必须含有attR同源序列， 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组。
为什么要构建入门载体？
• Entry Clone是作为基因的一个来源克隆以便 较容易地亚克隆到任意目标载体。 • 同时，一旦Entry Clone是测序有效的，就 不需要对多个表达载体进行测序。 • 另外，attB序列相对较小（25bp），这使得 它们更适合加到PCR引物中去（需要在5'端 附加4个G以便进行有效重组）。
用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。
实例二[1]
• 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功 能基因筛选，利用G技术入门载体pDONR222的经过酶 切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的 多克隆位点上，构建Gateway技术兼容的 p1104D植物表达载体。
谢谢听P—λ噬菌 体同源重组 位点 attB—E.coli 染色体上的 同源重组位 点
修饰后的位点信息
Gateway技术只需要两步反应就可完成表 达载体的构建。 反应 反应位点 反应产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆载体 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆载体 attB1-基因-attB2
第一步：入门载体的构建
有四种方法: A. 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入 入门载体 B. PCR克隆，以含attB的特异引物合成目的 基因资源
基于Gateway技术的表达载体构建
基于Gateway技术的表达载体构建1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。
该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。
该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。
PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。
pGWC载体的酶切反应体系如下：pGWC10 μl（约2μg）10×Eam1105 I Buffer5 μlEam1105 I2 μlddH2O34 μl共计50 μl将反应混和液于37℃温育6h。
取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。
2. PCR产物的回收与连接反应PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。
DNA片段与pGWC-T的连接：pGWC-T1μl（约50ng）DNA回收片段4μl（600bp片段约需40ng）Solution I （TaKaRa）5μl共计10μl反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。
3. 连接产物的转化取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。
4. LR反应与表达载体构建表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（EntryClone），通过与表达载体做LR反应构建目标基因的表达载体。
gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。
根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。
通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi 特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。
实验结果表明Gateway 载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。
标签：RNAi；Gateway载体；BP和LR反应Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。
λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。
这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。
这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。
与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。
Gateway
Gateway™技术提供以下可能：∙通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间∙将您的基因转入到多个表达系统∙在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。
BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
典型的效率是＞95％。
关于TOPO和GATEWAY
Gateway®克隆的强大性和灵活性
在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜
7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/ml Zeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h
或者：
Fresh PCR product1.33 µl(from Step 1)
Salt Solution0.33µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
TOPO Vector（载体）0.33 µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
FINAL VOLUME2.00µl
1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min
2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min
（图2）
TOPO克隆高效性原理
Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
Gateway
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。
据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
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Gateway 基因克隆
Gateway 基因克隆就是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1与att L2两个侧端重组序列,来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”(Gateway Entry Clone)。
据Invitrogen宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应,如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法,避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性,大大提高了克隆效率,常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体,因此又称之为高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology)。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制
Gateway被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点与重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。
Gateway的原理就是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体与细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点与大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL与attR。
这就是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis与IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB与attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来(见图1)。
这一过程的方向就是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白与重组位点。
图1、噬菌体位点专一性重组的机制
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1与attL2,大小均为100bp,中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E、coli生长,在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因,接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限(2个),同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题,因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的就是转化用的菌株必须就是不含F附加体的,因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因,影响筛选结果。
同样,目的载体(Destination Vector)也必须与Gateway系统配套,即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1与attR2,大小均为125bp,同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体(Entry Vector)转移到目的载体(Destination Vector)时,只要将两种质粒混合(线性化能有效提高重组率),加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物,attR2序列与attL2序列发生重组,生成一个融合质粒。
attL1序列再与attR1序列重组,融合质粒分解为两个新的质粒,目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换,得到一个带目的基因的目的载体(生成新的重组位点attB1、B2)与带自杀基因的入门载体(生成新的重组位点attP1、P2,见图2)。
由于带自杀基因的载体不能生长,加上抗生素筛选,转化产物重组率高达90%以上。
图2、gateway机制
由于在这个反应中attL1序列只与attR1序列重组,attL2序列只能与attR2序列重组,这个方向的反应称为LR反应。
LR反应生成新的位点称为attP1/2(200bp)与attB1/2(25bp)序列。
在一定的条件下,attP与attB序列也能发生重组,生成attL与attR序列,这个反向反应称为BP反应(见图3)[1]。
图3、BP反应及LR反应
当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体,希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时,只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上,在由入门载体转移到其它的表达载体就行。
将含目的基因的Gateway表达载体(attB1—目的基因—attB2序列)与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体(pDONR,注意这个载体不同于入门载体Entry Vector)混合,加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物, attP与attB序列也能发生重组,生成带有目的基因的入门载体(Entry Vector)与带自杀基因的表达载体。
同样,由于抗性不同以及自杀基因的作用,只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。
这即就是BP反应。
需要特别注意的就是表达载体如果也就是卡那霉素抗性,就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。
二、Gateway 基因克隆优点
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统(图4)。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆与亚克隆的步骤,而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时,还可以保证正确的方向与阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化与检测标签蛋白的表达。
图4 Gateway技术的灵活性
Gateway利用了位点特异重组,所以在构建入门载体后,不再需要使用限制性内切酶与连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆,就可以多次使用它,转移的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体(目的载体)。
此外,由于在重组时DNA片段的阅读框与方向保持不变,因而,不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时,将会节省更多的时间。
三、Gateway在构建cDNA入门文库与表达文库方面的应用
2006年,中国科学院张宁,以激活蛋白产生菌一交链孢菌为材料,用基于入噬菌体特异位点重组反应构建定向cDNA文库的Gateway技术,首次成功构建了交链孢菌cDNA入门文库与表达文库。
构建的cDNA入门文库经检测,入门文库的滴度达到6X108 文库总容量为5、6X107,其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1、53Kb。
通过LR重组把入门文库转换为表达文库。
表达文库的滴度为1、53X 106,文库总容量为6、2 X 106,其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1、62Kb。
快速、高效的构建了高质量的cDNA入门文库与表达文库,为从分子水平进一步研究蛋白激发子提供了基础。
通过大规模的免疫筛选文库获得激活蛋白全长编码基因,并进行表达与纯化,为进一步研究激活蛋白与植物受体的相互
作用机理及信号途径奠定了基础[2]。
四、Gateway在植物双分子荧光互补(BiFc)系统上的应用
2013年,周洁等充分利用Gateway技术高效快捷的优势,构建了一套基于Gateway的BiFC分析载体系统。
该系统与常规的系统一致,采用融合黄色荧光蛋白(yellow fluorecent protein , YFP)片段的方法进行互作分析。
其中的YFP片段被分为N端YFP ( N-terminal YFP nYFP)片段与C端YFP ( C-terminal YFP, cYFP)片段。
该系统包括用于目的基因N端融合的nYFP载体与cYFP载体,及目的基因C端融合的nYFP与cYFP共4个载体。
同时,还构建了带氨节青霉素(Ampicillin , Amp)抗性的入门载体,用于入门克隆。
该入门载体可由实验室自行酶切制备,并且采用TA克隆的方法进行入门载体的构建,从而大大降低了创制入门克隆的成本。
此外,该入门载体带有ccdB自杀基因,常规分子生物学实验室的制备手段就能保证非常低的背景克隆。
总体而言,其构建的BiFC载体系统,操作简单且成本低,能够快速构建互作分析用的BiFC载体,高效的进行基因互作研究[3]。
参考文献:
[1] 李明,丁博,牛有雄,等、小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建[J],华北农学报, 2011,26(2)
[2] 张宁、交链孢菌cDNA文库构建及激活蛋白基因克隆与融合表达[D]、中国农业科学院、2006
[3] 周洁,王栩鸣,陈斌,等、基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统[J]、浙江农业学
报,2013,25(5); 1024-1030、。