2 反相高效液相色谱测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸_孙绪顺
反相高效液相色谱法测定苹果酸发酵液中的有机酸
反相高效液相色谱法测定苹果酸发酵液中的有机酸黄慧敏;张伟国【摘要】Reversed phase HPLC method was applied to determine organic acid in malic acid fermentation liquor in this paper. The chromatographic conditions are finally conformed to apply to all kinds of organic acid content deter-mination in the fermentation. The conditions are as follows：COSMOSIL 5C18 - PAQ column （4.6 mm I.D. × 250 mm） was used at 23℃. UV detection wavelength was 210 nm. Solution containing 1% acetonitrile and 20mmol/L KH2PO4 at pH 2.8 was used as mobile phase with flow rate of 0.5 mL/min. The seven organic acids in malic acid fermentation liquor were preferably separated under these conditions. The recovery ratio was 94.2% - 102.7% and the method had good accuracy and precision.%采用反相高效液相色谱法分析测定苹果酸发酵液中的有机酸，最终确定了适用于发酵液中各种有机酸含量测定的色谱条件，色谱柱：COSMOSIL5C18-PAQ（4．6mmI．D．×250mm）；紫外检测波长：210nm；流动相：1％乙腈-20mmol／L KH2PO4溶液（pH2．8）；流速：O．5mL／min；柱温：23℃。
反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量(精)
反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量[ 08-05-28 16:45:00 ] 作者：邹盛勤，蒋柏泉，陈武编辑：studa20【关键词】夏枯草；,,乌索酸；,,齐墩果酸；,,反相高效液相色谱法摘要：目的建立同时测定夏枯草中乌索酸及齐墩果酸含量的方法。
方法采用反相高效液相色谱法。
色谱柱为 Nucleodur C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇:水（86∶14），流速为0.8 ml/min，检测波长为210 nm，柱温25 ℃。
结果乌索酸进样量在0.425 2 ～3.826 8 μg，齐墩果酸进样量在0.127 2 ～1.144 8 μg范围内，线性关系良好，乌索酸、齐墩果酸的加样平均回收率分别为98.0 %和98.7 %，RSD分别为1.0 %和1.4 %。
结论方法简单准确，重现性好，适用于夏枯草药材的质量控制。
关键词：夏枯草；乌索酸；齐墩果酸；反相高效液相色谱法Determination of Two Triterpene Acids in Prunella vulgaris L. by RP-HPLCAbstract：ObjectiveTo develop a new method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L．MethodsThe high performance liquid chromatography was used．The column was Nucleodur C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm) column，the mobile phase consisted of methanol - water (86∶14) , the flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear range with good linearity of ursolic acid was between 0.4252 ～3.826 8 μg and with the oleanolic acid was between 0.127 2 ～1.144 8 μg．The average recovery of ursolic acid was 98.0 % with relative standard deviation (RSD )of 1.0 % and the oleanolic acid was 98.7 % with RSD of 1.4 %.ConclusionThe method is simple, accurate, reliable and can be used for quality control of Prunella vulgaris L．Key words：Prunella vulgaris L; Ursolic acid; Oleanolic acid; RP-HPLC夏枯草Prunella vulgaris L.是唇形科夏枯草属植物，为中医临床常用中药，始载于《神农本草经》，主产于河南、安徽、江苏、浙江等地，以干燥果穗或全草入药，味辛苦、性寒，具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，用于目赤肿痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等［1］。
气相色谱法测定厌氧发酵液中挥发性脂肪酸的研究
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ：Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ｏ ｆ ＶＦＡｓ ｉ ｎ ｔ ｈｅ ａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｃ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｑ ｕｉ ｄ
ｕ ｐ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｈ ｏ ｗｎ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｐｅ ａ ｋ ｔ ｉ ｍｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ＶＦ Ａｓ ｉ ｓ ２ ０． ３ ９ ５， ２ ２． ２１ ７ ａ ｎｄ ３． ９ ２１ ｍｉ ｎ ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ — ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ， ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｃ ａ ｎ ｂｅ ｄ ｉ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｂ ｙ ＧＣ ｗｅ ｌ １ ．Ｔ ｈｅ ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｅ ｆｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｒ ｅ ａ ｌ ｌ ｌ ａ ｒ ｇ ｅ ｒ ｔ ｈ ａ ｎ ０．９ ９ ９． ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙ ｏ ｆ ｅ ｏ ｎ ｉｒ ｆ ｍａ ｔ ｏ ｒ ｖ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ＶＦ Ａｓ ａ ｒ ｅ ９ ６． ７２％ ， ９ ７． ２ ０％ ， ９ ７． １ ３％ ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ，ｗｈｉ ｃ ｈ ｓ ｈ ｏ ｗｓ ｔ ｈａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ＶＦ Ａｓ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂｉ ｃ
．
ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｃ ｏ ｎ ．
反相高效液相色谱法测定
第32卷2004年10月 分析化学(FENXI HUAXU E ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第10期1368～1370反相高效液相色谱法测定o 2烯丙基苯酚和p/o 2丁酰基苯酚在番茄中的残留量胡继业1 张文吉2 李建中311(中国科学院生态环境研究中心,北京100085) 2(中国农业大学理学院,北京100094)摘 要 建立了o 2烯丙基苯酚、p/o 2丁酰基苯酚在番茄中残留量的反相高效液相色谱分析方法。
样品前处理过程简便,方法准确可靠,灵敏度和准确度达到了农药残留检测的要求。
o 2烯丙基苯酚、p/o 2丁酰基苯酚在番茄中的最低检测浓度为0.01mg/kg ;方法的添加回收率(0.05～1.00mg/kg )在87.7%～95.1%之间。
关键词 o 2烯丙基苯酚,p/o 2丁酰基苯酚,反相高效液相色谱法,残留分析 2003209212收稿;2004205224接受1 引 言o 2烯丙基苯酚(商品名称绿帝)和p/o 2丁酰基苯酚(商品名称银泰,为p 2丁酰基苯酚和o 2丁酰基苯酚的混合物,在原药中所占比例约为7∶3)是山东省农业仿生应用工程研究中心开发研制的两个新型仿生农用杀菌剂,已获得了国家发明专利和农药临时登记(防治番茄灰霉病),现已批量生产。
它们是以银杏外种皮中的杀菌、抑菌活性化合物的化学结构为模板,经过结构简化,通过人工模拟化学合成得到。
田间药效实验证明,o 2烯丙基苯酚可有效的防治苹果腐烂病、番茄灰霉病、玉米大斑病等病害1;p/o 2丁酰基苯酚对苹果腐烂病、苹果轮纹病、番茄轮纹病、玉米大斑病及小麦纹枯病具有良好的防治效果2,3。
目前这两种农药的残留分析方法,国内外没有文献报道。
作者研究了这两种杀菌剂在番茄中残留的提取、净化方法以及高效液相色谱检测方法,为番茄田中的残留实验、正式注册登记和推广应用奠定基础。
2 实验部分2.1 仪器和试剂Waters 高效液相色谱仪及色谱工作站(美国Waters 公司);RE 252旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB 2Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);20PR 2520高速冷却离心机(日本日立公司);8782B 多功能粉碎机(深圳天南公司);WX 22无油真空泵抽滤器(临海市精工真空设备厂);HZQ 2C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子公司);电子天平(Sartorious 公司)。
高效液相色谱在食品质量检测中的应用
高效液相色谱在食品质量检测中的应用 施雪 孙敬涛 黑龙江省肇东市质量技术监督检验检测中心现代社会食品安全问题已经成为社会各界关注的焦点。
然而非常规安全威胁因素出现在现实的食品安全领域，让食品安全形势变得极为复杂，食品添加剂、化学污染、加工工艺都会对食品安全产生广泛而深远的影响。
因此如何全面而科学地检测食品质量成为焦点问题，高效液相色谱在食品检测中的应用解决了这一问题。
HPLC法的优点从食品安全检测的角度来看，高效液相色谱法具有适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围广的特点，在具体的检测活动中HPLC基本能够适应当前食品安全检测的全部内容，同时因为检测过程中采取的分离和液相处理技术都是在现代生物学和网络信息技术的支持下实现的，所以绝大部分检测工作并不需要过多的预处理和处理步骤，检测过程整体表现为快、准、稳，能够准确快速地提供检测结果。
在挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的检测中尤其有利。
高效液相色谱法在食品检测中的应用在实际的食品安全检测中，高效液相色谱法更加适应对沸点高、热稳定性较差、分子量较高物体的测试。
近年来随着食品安全问题的逐渐严峻以及食品安全威胁因素的复杂、众多，高效液相色谱法的应用范围和应用数量不断扩大，与传统的测定方法相比高效液相色谱法具有较大的优势，以下将借助五种重要的有害物质的食品安全测定对其先进性进行辅证：N-亚硝胺的测定。
在腊肉等腌制食品中，生产主体经常会添加硝酸盐或者亚硝酸盐作为腌制食品的发色剂，硝酸盐本身并不存在严重的危害，但是如果其添加的量过大，在还原作用的影响下肉制品中会生成N-亚硝胺，而N-亚硝胺对人体的危害较大，长期摄入会导致肝癌和结肠癌等恶性疾病。
针对N-亚硝胺的传统测量方法是气相色谱法，这种方法只能对被测物体中挥发性的N-亚硝胺进行测量，测量的精度不高，而且测量过程中仅色谱测定这一环节就需要一个多小时的时间，而采用高效液相色谱法全过程只需要13分钟。
反相高效液相色谱法测定瘤胃内容物中挥发性脂肪酸的方法研究-论文
ｂ ｙ ２ ８ ： ７ ２ ， ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｉ ｒ ｅ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｖ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｌ ｅ ｆ ａ ｔ ｔ ｙ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ（ Ｖ Ｆ Ａ） ｗ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｒ ｇ ｅ ｒ ｔ ｈ ａ ｎ ８ ３ ％， ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｄ ｅ ｖ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
色 谱 图见 图 ２ 。 从 图 ２可 以看 到乙 酸 、 丙 酸和 丁酸 的 目的峰 能够 和杂 峰进 行完 全分 离 ， 峰形 较好 ， 出 峰 时间分 别 为 ３ ． ０ ４ ７ 、 ４ ． ４ ９ ２ ｍｉ ｎ和 ８ ． ４ ８ ５ ｍｉ ｎ ， 在 １ ０ ｍｉ ｎ内即可 完成 检测 ， 缩 短 了样 品检 测 时间 。
１ 。标 准 品色谱 图见 图 １ 。从 图 １ 可 以看 到 ， 乙酸 、
丙 酸和丁酸出峰时间分别为 ３ ． ０ ４ ３ 、 ４ ． ４ ８ ０ ｍ ｉ ｎ和
８ ． ４ ４ ３ ｍｉ ｎ 。标 准 品 的色谱 图基 线平 稳 ， 乙酸 、 丙 酸
和丁 酸能 够完 全分 离 ， 峰形 对称 。
２ 结 果 与 分 析
１ ． １ 试 剂 乙酸 、 丙 酸 和丁 酸 均 为 色谱 纯 ； 偏 磷
酸、 硫 酸锌 、 亚铁 氰化 钾 均 为分 析 纯 ； 甲醇 为色 谱 纯； 试验 用水 均为超 纯水 。 １ ． ２ 仪器 美 国安 捷伦 高 效 液相 色 谱仪 （ Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ
表 １ 乙酸 、 丙酸 和丁 酸标 准 曲线
３
《
｛ 哐
鼍 『 ｊ
Ｕ ， ） ，） Ｉ Ｕ １ｚ ３ １ ３
反相高效液相色谱法同时测定发酵液中的阿魏酸、香草酸和香草醛
反相高效液相色谱法同时测定发酵液中的阿魏酸、香草酸和香草醛李永红 郑志强 孙志浩3(江南大学生物工程学院生物催化研究室,工业生物技术教育部重点实验室,无锡214036)2002212220收稿;2003206210接受1 引 言香草醛(Vanillin ,Vin )是食品、饮料等工业应用最广泛的香料之一,还可作为保鲜剂及医药等工业的原材料。
香草醛目前主要由化学方法制备,但化学合成制得的香草醛不属于天然香料。
天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取,得到的香草醛量少且价高。
根据美国和欧盟的规定,合成香草醛在食品添加剂中的使用会引起法律方面的争议,由此促进了用生物技术方法生产香草醛的研究。
生物转化法生产香草醛多采用阿魏酸(Ferulicacid ,FA )作为前体物质,转化过程中会产生香草酸(Vanillic acid ,VA )等中间产物。
曾报道过薄层色谱法(TLC )能同时测定阿魏酸、香草酸和香草醛,该方法是对发醇过程进行快速监测的行之有效的方法,但其缺点是定量欠准确,层析时板与板之间重现性较差。
因此,研究了能同时测定发酵或生物转化液中阿魏酸、香草酸和香草醛的RP 2HPLC 方法,该方法的重现性好,准确、可靠。
国外已有文献报道在生物转化中采用HPLC 方法测定香吞草醛,但未见同时测定阿魏酸、香草酸和香单醛的报道。
2 实验部分2.1 仪器与试剂 HP 21100型高效液相色谱仪;微量进样器,微膜过滤器。
阿魏酸(Sigma 公司),香草酸(Sigma 公司),硅胶G (中国青岛海洋化工集团公司);甲醇(色谱纯)、香草醛及其它试剂均为分析纯。
2.2 色谱条件 色谱柱:Lichrospher 100RP 218柱(250mm ×4mm i.d.,5μm ),流动相为:A =0.01%冰醋酸水溶液,B =甲醇;时间程序:开始时20%B ,保持4min ,到24min 时增加至40%,到27min 时增加至100%并保持2min ,到30min 时又降至20%,并以这种比例使柱子平衡至少5min ;流速为1mL/min 。
反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平活性代谢产物的浓度
反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平活性代谢产物的浓度目的建立反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平（OXC）活性代谢产物MHD的浓度。
方法收集血清样品经甲醇沉淀蛋白后，采用InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）色谱柱，流动相为甲醇-水（35：65），流速：0.8 mL/min，检测波长：210 nm，柱温：40℃，进样体积：20 μL。
结果血清中内源性物质对样品测定无干扰，MHD 在 4.8～38.4 μg/mL线性关系良好，回归方程为：A=13968.3C-13730.7，r=0.9990。
MHD的低、中、高3种浓度平均回收率均>95%，日内、间RSD 均95%，and intra-and inter-day RSDs were 95%，日内、日间RSD均35 μg/mL占0。
结果显示OXC在按常规剂量给药的情况下，存在部分患者血药浓度在有效浓度范围外，因此，需要在血药浓度监测下调整给药剂量，本方法能够满足临床血药浓度监测，也能用于患者过量服药情况下的中毒药物浓度监测，从而为患者制定个体化用药方案。
3 讨论从奥卡西平的药动学特征来看，口服OXC后，其活性代谢产物MHD一般在2～3 d内达到稳态血药浓度。
本文对癫痫患者口服OXC片后进行TDM，在给药前采集血样测定人血清中MHD稳态谷浓度水平。
MHD在人血清中的血药浓度测定方法已有文献报道，通常采用LC-MS/MS法[7]和HPLC法[8-16]。
LC-MS/MS专属性强、灵敏度高，但由于成本昂贵，不适用于常规检测。
目前国内关于MHD药物浓度测定的HPLC法大多采用内标法进行测定[9-11，16]，操作较为繁琐，本文采用外标法进行测定，实验结果表明该方法简便快捷，也能准确地测定MHD的血药浓度。
MHD结构中有两个苯环，具有明显的紫外吸收。
本实验在200～360 nm的波长范围内进行紫外扫描，发现检测波长为210 nm时，基线平稳，吸收值较大，灵敏度较高，因此选取210 nm作为检测波长。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 实验部分
1.1 主要仪器及试剂
净水技术 WATER PURIFICATION TECHNOLOGY
Vol. 28, No. 5, 2009
October 25th, 2009
用于非挥发性脂肪酸的测定。 气相色谱是现在应用比较普遍的一类测量挥发
性脂肪酸的方法。 在毛细管色谱柱技术发展之前使 用气相色谱法测定脂肪酸时， 常常因为脂肪酸的高 极性、 高沸点， 难气化而需要对其进行繁琐的预处 理，将挥发性脂肪酸酯化，然后通过测定酯的含量来 间接的测定脂肪酸的含量[4]。 这种方法的缺点是酯 化时间漫长，影响了测量的时间，同时增加了测试 前的步骤，增加了误差产生的概率，精确度得不到 保证 。 [3、5] 随着毛细管色谱柱技术的发展 ，使用气相 色谱测定挥发性脂肪酸可以不经过衍生、 酯化而直 接进行测定。虽然免去了繁琐复杂的预处理，气相色 谱 测 定 挥 发 性 脂 肪 酸 还 存 在 以 下 几 种 困 难 ：（1）选 择 特定检测器以消除样品中水对测定结果的影响，测 定 挥 发 性 脂 肪 酸 一 般 选 用 氢 火 焰 离 子 检 测 器 。（2）因 为挥发性脂肪酸的具有强极性，容易产生拖尾问题。 为了解决拖尾问题， 一般选用程序升温控制温度并 且选用合适的极性色谱柱。（3）挥发性脂肪酸具有强 烈的挥发性，因此要使用弱酸酸化待测样品。且选用 弱酸不破化色谱柱为原则[3]。 由此我们可以得出，虽 然气相色谱测定挥发性脂肪酸已经不需要太过繁琐 的预处理，相对于传统的测定方法已经比较快速，可 是在使用气相色谱过程中还有太多的限制。
标准曲线
y = 0.076 9x + 7.641 6 y = 0.191 5x + 9.028 7 y = 0.112 2x + 2.899 9 y = 0.042 4x - 6.594 6
R2
0.997 3 0.999 1 0.999 4 0.999 5
检出限 /(mg·L-1)
3.17 4.78 2.56 2.59
- 64 -
荧光法、薄层色谱法、气相色谱法等方法。 使用比色 法、滴定法等传统常规的化学方法具有直观的优点， 在液相色谱和气相色谱等方法未普及之前得到了广 泛的应用。同时因为比色法、滴定法传统化学方法所 需预处理方法复杂、实验时间漫长、分析结果误差大 以及实验劳动量大等缺点限制了此类方法的进一步 使用，另外比色法、滴定法等传统化学方法只能分析 待测溶液中挥发性脂肪酸的总量，无法分离、测定不 同种类挥发性脂肪酸的浓度数据， 因此无法满足现 代实验对挥发性脂肪酸分类分析的要求。 荧光法测 定挥发性脂肪酸原理是将挥发性脂肪酸转化成具有 强烈荧光特性的物质， 通过荧光分光光度测定挥发 性脂肪酸。 此方法因为需要挥发性脂肪酸可以转化 成带有强烈荧光特性的物质，因此不能够广泛使用。 薄层色谱法是将待测样品涂布与玻璃板、 塑料或其 他材料上，成一层均匀薄膜，反应一段时间后与对照 物的色谱图进行对比得出结果。 因此此类方法只适
净水技术 2009，28（5）：64-66
!"
Water PuVrifoilc.a2t8io, nNoT.e5c, h20n0o9logy !!!!!!"
分析与监测
!!!!!!"
!"
反相高效液相色谱测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸
பைடு நூலகம்
孙绪顺，褚春凤，李春杰
（上 海 交 通 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院 ，上 海 200240）
紫外检测波长 210 nm[6]。 进样量 10 μL。 1.2.2 色谱条件的优化
（1）流动相缓冲溶液浓度的优化 理论上缓冲溶液浓度的高低会直接影响挥发性 脂肪酸在流动相中的存在形式及离子强度， 从而影 响色谱的分离效果。缓冲溶液的浓度越高，挥发性脂 肪 酸 在 流 动 相 中 以 酸 分 子 形 式 存 在 稳 定 性 越 高 [6]。 如缓冲液浓度过高则会导致挥发性脂肪酸在流动相 的本底吸收过大，影响色谱检出灵敏度，同时还会减 小色谱柱的使用寿命，增加实验成本。 为了能够更好的分离各种挥发性脂肪酸， 同时 又可以保护色谱柱，进行大量的预实验。预实验结果 表明流动相浓度的改变对挥发性脂肪酸的分离效果 影响不大。 但考虑过高的流动相盐浓度可能会影响 色谱系统、减小色谱柱的使用寿命。 因此，本实验选 择磷酸二氢钠浓度为 10 mmol/L 的流动相。 （2）流动相中缓冲溶液与甲醇比的优化 流动相中含有少量甲醇能够较好的改变峰型， 并且可以减少挥发性脂肪酸的保留时间。 甲醇含量 过少， 则对峰型与挥发性脂肪酸保留时间的改变不 明显，达不到实验预期效果。 如甲醇含量过高，则会 使各种不同种类的挥发性脂肪酸保留时间间隔太 小，导致不同种类的脂肪酸峰面重叠，同样不能较好 的分离各种脂肪酸。 经过大量的预实验， 对比在不同缓冲溶液与甲 醇比的情况下，各种脂肪酸的分离情况。本文选定盐 与甲醇的体积比为 78∶22 时作为实验条件。 （3）流动相 pH 的优化 pH 是决定挥发性脂肪酸在流动相中以何种形 态存在的重要因素。 参照前人的研究经验 ， [6-10] 本实 验选择 pH＝2.5 的缓冲液作为流动相。 按照以上优化条件，具体色谱分析图为图 1。
使用上述建立的方法测定甲酸、乙酸、丙酸、正
丁酸标准溶液中脂肪酸的含量， 取噪音峰值的 2 倍
作为此方法的最低检出限。 四种酸的标准曲线以及
相关系数见表 1。
表 1 四种挥发性脂肪酸测定参数
Tab.1 Parameters of four VFAs
脂肪酸
甲酸 乙酸 丙酸 正丁酸
保留时间 /min 3.112 3.991 6.258 7.902
Abstract Volatile fatty acids(VFA) are important parameters in the anaerobic fermentation reaction system. Accurate understanding of various types of volatile fatty acids content is an important step to ensure the normal operation of anaerobic fermentation reaction. The experiment set up a method by high performance liquid chromatography (HPLC) to determine the formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid. The result shows that the recoveries of four VFAs are larger than 87 %, detection limits and RSD ranged from 2.56 mg/L to 4.78 mg/L and 8.23 % to 10.31 %. It proved that this measurement can be accomplished to determine the content of VFA smoothly and exactly. Key words high performance liquid chromatography(HPLC) volatile fatty acids(VFA) anaerobic reaction
1.1.1 仪器 岛津 2010A 型高效液相色谱仪。 CLASS-VP 色谱工作站。
1.1.2 试剂 磷酸、磷酸二氢钠、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸均
为国产分析纯药品。甲醇采用进口色谱纯试剂，实验 用水均为超纯水。
1.2 实验条件
1.2.1 色谱条件 色谱柱使用岛津公司出产的 C18 反相色谱柱。
流动相使用磷酸盐缓冲溶液（PBS），pH＝2.5。 磷酸二 氢钠浓度为 10 mmol/L。 流速 1 mL/min。 柱温 30 ℃。
1.3 样品的处理
本实验所使用厌氧发酵液样品为本实验室 CSRT 系统厌氧发酵上清液。
样品采集后使用离心机 3 500 转离心 15 min 取 离心后的上清液使用。 为避免 HPLC 色谱柱的堵塞 使 用 0.45 μm 的 微 孔 滤 膜 将 离 心 后 的 上 清 液 过 滤 去除悬浮物和微生物。 而后把处理好的样品存放在 0 ℃的冰箱里以待测试。 从采集样品到使用 HPLC 测试样品时间间隔不超过 3 d。
挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）是厌氧 过程酸化阶段的主要产物， 是厌氧过程中一种重要 的中间产物。有机物在厌氧过程中首先经过水解、发 酵作用产生挥发性脂肪酸， 产甲烷菌利用厌氧反应 过程中产生的挥发性脂肪酸产生甲烷。 有研究显示 在厌氧过程中产甲烷菌利用脂肪酸产生甲烷的过程 是 厌 氧 反 应 的 一 个 重 要 的 控 制 过 程[1]，因 此 在 厌 氧 反应系统中系统的失衡常常伴随着挥发性脂肪酸的 积 累[2]，即 在 厌 氧 反 应 过 程 中 适 时 的 监 控 系 统 中 脂 肪酸的含量可以有效了解系统中甲烷菌的活跃程度 和反应器的运行情况[3]。 所以在厌氧反应中，挥发性 脂肪酸是反应系统的一个重要的指标。
2 实验结果
2.1 标准曲线的测定
- 65 -
孙绪顺，褚春凤，李春杰. 反相高效液相色谱 测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸
Vol. 28, No. 5, 2009
a: formic acid b:acetic acid c:propionic acid d:butyric acid 图 1 四种挥发性脂肪酸色谱图 Fig.1 Chromatogram of four VFAs