慢病毒介导的RNAi技术
最新RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系
12用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（１－３）后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时RNAi短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA或是能够编码siRNA的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。
转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。
转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。
或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。
.不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。
转染的外源DNA由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。
一旦所转染的细胞中siRNA消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平。
采用转染技术来产生基因沉默通常要在４８－７２小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持２４－９６小时。
因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA干扰效率。
当前，由于siRNA转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。
长久RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。
siRNA转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。
构建用慢病毒载体介导的RNAi敲除ABCG2的Caco-2细胞模型
第１ ３ ６卷 期
３０ ７
２１ ０ ０年 ９月
天 津 医 科 大 学 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｔ ＡＮＪＮ Ｉ Ｉ ＭＥＤＩ ＡＬ ＵＮＩ Ｃ ＶＥＲＳＴＹ Ｉ
RNAi技术_一项使特异基因表达沉默的新技术
专题论述RNAi 技术 一项使特异基因表达沉默的新技术黎 真,傅 衍*(浙江大学动物科技系,浙江杭州 310029)摘要:R NAi 技术是新近发展起来的一种使特异基因表达沉默的方法,这项技术还处于起步阶段。
本文对R NAi 技术的概念、作用机制和应用前景等方面作了介绍。
关键词:R NAi 技术;作用机制;基因沉默;应用前景中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:0529-5130(2003)11-0037-03 研究一个基因的作用,最好的办法之一就是把它关掉后观察发生了什么,这通常是一个辛苦的工作。
最近,研究者们发现了一种在哺乳动物细胞里使特定基因沉默的新方法 RNA 干涉技术(RNAi)[1-4]。
虽然这项技术还处于起步阶段,但可以预料,RNAi 技术必将越来越完善,并得到广泛应用。
马萨诸塞州立大学医学中心的Phillip Zamore 预言说, RNAi 技术将在哺乳动物体细胞基因学中引起革命。
不再是1年里花6个月时间设法关闭一个哺乳动物基因的表达,人们现在可以1个星期内关掉10个基因。
1 RNAi 技术的发现及其概念大约10年前,人们在牵牛花中发现了一个奇怪的现象。
为了加深牵牛花的紫色,Rich Jorgensen [5]等人引入了一个处于强启动子之下,能产生色素的基因,然而实验的结果却出人意料,牵牛花的紫色非但没有加深,许多花还表现出杂色,有的甚至是白色。
对此现象,Jorgensen 称之为 共抑制 (cosup -pression),因为它同时抑制了引入基因及与之同源的内源基因的表达。
此后,研究者们在植物、昆虫、真菌、原生动物等多种生物中都发现了 共抑制 现象[1-3]。
现在 共抑制 的概念已经明朗,它是由转入基因或病毒的感染而引起的内源基因的沉默,既可以指转录后沉默(PTGS),又可以指转录水平的沉默(TGS)。
现在普遍认为PTGS 是由于dsRNA (双链RNA)、外源基因或病毒的导入而引起的内源同源基因的表达沉默,其中由于导入dsRNA 引起的PTGS 就是RNA 干涉技术(RNAi)。
《RNAi技术原理》课件
RNAi技术在基因功能研究中的应用
基因功能研究
RNAi技术可以帮助科学家研究基因的功能和调控机制，揭示细胞过程和生物系统的运作。
RNAi筛选技术
利用RNAi技术，可以进行高通量筛选，快速鉴定和验证潜在治疗靶点，加速药物发现的进 程。
药物治疗副作用减轻
利用RNAi技术可以精确地抑制药 物治疗中的副作用基因，提高治 疗效果，减轻患者的不良反应。
RNAi技术的局限性和未来的发展方向
1 off-target效应问题
RNAi技术存在着非特异性的副作用，需要进一步解决off-target效应问题，提高其精确性 和可靠性。
2 载体选择和优化
选择合适的载体并优化传递效率是RNAi技术在应用中需要关注的重要问题，以提升治疗 效果。
3 RNAi技术与CRISPR技术联合应用的前景
RNAi技术与CRISPR技术的联合应用有望进一步拓展其应用范围，为基因疾病治疗和基 因编辑提供更多可能性。
RNAi技术在药物靶点发现中的应用
通过RNAi技术，可以筛选和验证抑制剂对特定基因的影响，为药物研发提供新的靶点。
RNAi技术在生物治疗中的应用
癌症治疗
借助RNAi技术，可以靶向抑制肿 瘤相关基因，实现个体化的癌症 治疗，为患者提供更精确的治疗 方案。
病毒感染治疗
RNAi技术可用于抑制病毒复制和 感染，为病毒性疾病的治疗提供 新的思路和方法。
《RNAi技术原理》PPT 课件
欢迎来到《RNAi技术原理》PPT课件。这是一门关于RNA干扰技术的课程， 通过基因沉默的原理，实现基因功能研究和生物治疗。让我们开始探索吧！
RNAi：新一代生物技术及其在植物保护中的应用
RNAi：新一代生物技术及其在植物保护中的应用导读本文共3616字阅读约需要10分钟RNA干扰（RNA interference, RNAi）是真核生物中高度保守的基因沉默现象。
基于RNA干扰技术的生物农药被认为是未来植保领域的颠覆性技术，将很大程度上改变人类防治农业病、虫、草等有害生物的思路和策略。
本文给大家介绍RNA干扰技术的基本作用机制，在农业上的研发和商业化进展，探讨其在应用层面所面临的机遇、挑战及风险。
分子生物技术总是存在或多或少的争议，新技术像把双刃剑，作为新农人，你又有怎样的见解，欢迎评论区留言讨论！1 神奇的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）介导的同源mRNA高效特异性降解的现象，也称为转录后基因沉默（PTGS），在植物、线虫、昆虫、脊椎动物等真核生物中普遍存在。
该现象在上世纪90年代发现，并成为一种重要的基因干扰技术。
2001~2002年连续两年被《Science》杂志评为年度十大科学进展！该技术被认为是农业绿色防控中最具有应用潜力的生物技术之一。
1.1 小小知识点在世间万物的生命活动中，各式各样的蛋白质承担重要作用。
蛋白质的基本构成单位是氨基酸（20多种），而氨基酸则是根据对应的基因编码来排序，从而形成不同空间结构和不同功能的蛋白质。
基因编码就是ATGC碱基对（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C）序列，“存储”在双螺旋DNA（脱氧核糖核酸）上。
通常情况下，DNA的载体是染色体。
从DNA到蛋白质，需要经历DNA复制、转录、蛋白质翻译和各种修饰。
1DNA复制复制就是从DNA制造相同DNA的过程2DNA转录转录是从DNA生成RNA（核糖核酸）的过程，即基因信息从DNA传递给RNA，也就是DNA上的ATGC编码变成了RNA上的AUGC（尿嘧啶U，替代DNA中的T）编码，这是基因表达最关键的一步，有很多类型的RNA，例如mRNA（信使RNA）、rRNA（核糖体RNA）、tRNA（转运RNA）等。
APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
司 ） 羊 抗 鼠 ＩＧ－ ； ｇ ＨＲＰ抗 体 （ 国 Ｓ ｎａ Ｃ ｕ 美 ａ ｔ ｒｚ公
８ ６
福 建 医科 大 学学 报
２１ ０ ０年 ４月 第 ４ ４卷第 ２ 期
Ａ Ｅ 基 因 Ｒ Ａ 慢 病 毒 载体 的构 建 与 鉴定 Ｐ１ Ｎ ｉ
李艳 菊 ，郑智 华 ，刘景 丰。 ，高 美钦 ，黄 爱 民
摘要 ： 目的 构 建 ＡＰ １基 因 慢 病 毒 载 体 ， Ｅ 为其 后 续 的 体 内 外 实 验 研 究 提 供 基 础 。 方 法 应 用 基 因 工 程
与细胞 的增 殖 、 亡 和 分 化 等 多 种 关 键 的 细 胞 反 凋
应， 是损 伤修 复 、 化 应 激 和 转 录 因子 调 控 基 因表 氧
司） ；总 Ｒ ＮＡ 提 取 试 剂 、 ＭＬ 逆 转 录 酶 、 Ｍ－ Ｖ Ｍｇ １ 、 ＮＴＰ Ｒｎ ｓ ｎ ｉｉ ｒ和 Ｐ Ｅ Ｔ（ 国 Ｃ ２ｄ 、 ａ ｅＩ ｈｂｔ ｏ Ｇ Ｍ－ 美
细胞 组 。Ｒ ａ ｔ Ｃ 和 Ｗｅｔｒ ｌｔ 测 ＭＨＣ ９一 细 胞 中 ＡＰ １基 因 的 ｍＲＮ 和 蛋 白 的表 达 。 结 果 ｅｌ ｉ Ｐ Ｒ ｏ ｍｅ ｓｅｎｂｏ 检 Ｃ ７Ｈ Ｅ Ａ
Ｐ Ｒ 及 测 序 结 果 与 预 期 结 果 一 致 ， － Ｅ 一ｈ ＮＡｌ Ｌ － Ｅ 一ｈ ＮＡ２的 病 毒 滴 度 为 ４× １。 Ｕ／ Ｃ Ｌｖ ＡＰ １ｓＲ 、 ｖ ＡＰ １ｓ Ｒ Ｏ Ｔ ｍＬ 和
菌株 Ｄ ａ 笔 者 科 室 保 留 ） 慢 病 毒 载 体 ｐ Ｃ Ｌ Ｈ５ （ 、 Ｇ Ｉ－
ＧＦ 包装 系统 ｐ ｌｅ １ ０及 ｐ ｌｅ２ ０ 上 海 吉 Ｐ、 Ｈｅｐ ｒ． Ｈｅ ｒ． （ ｐ 凯基 因化学 技术 公 司） 慢病 毒 的包装 细胞 ２ ３ 细 ； ９Ｔ 胞株 （ 国科 学 院 上 海 生 物 所 细 胞 库 ） Ａｇ 、 中 ； ｅＩ
RNAi技术
五、RNAi技术应用
出
HIV-1
临床疾病治疗
①病毒性疾病的治疗
芽
淋 巴 球
设计合成的lenti病毒载体引入 病毒载体引入siRNA，激发 设计合成的 病毒载体引入 ， RNAi使其抑制了 使其抑制了HIV-1的辅助受体 的辅助受体CCR5进 使其抑制了 的辅助受体 进 入人体外周Ｔ淋巴细胞， 入人体外周Ｔ淋巴细胞，而不影响另一种 HIV-1 的辅助受体CCR4， 而使 lenti 的辅助受体 ， 病毒载体 引 siRNA进入细胞 进入细胞 治疗HIV-1 其 病毒 了 ， 治疗 性疾病的 性 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病 毒等
siRNA siRNA siRNA siRNA 和 诱 导 的 基 因 默 沉
miRNA miRNA miRNA miRNA
RNAi 《
机
制
视
频
四、RNAi的特点 RNAi的特点
RNAi的特点 RNAi的特点
生物体内广泛存在的RNAi作用是什么？ 生物体内广泛存在的RNAi作用是什组 研究的开展， 研究的开展，我们的视野不再局限于单 个的基因， 个的基因，整个研究领域都在期待呼唤 更为强大的、 更为强大的、全基因组高度的基因功能库，可以用于建立功能缺陷(loss 的生物或细胞库， of function) 的生物或细胞库，进行表 型的筛选。 型的筛选。
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度金小花;秦高【摘要】目的：探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数（ multiplicity of infection，MOI）及BSD基因筛选抗生素（ blasticidin）浓度。
方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120（ TU number／cell）分别侵染INS-1空白细胞，培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率（％）及死亡率（％），以确定最佳MOI值。
小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg／mL blasticidin，第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率，以确定细胞抗生素敏感浓度。
使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒（病毒滴度：1×108 TU／mL）按照最佳MOI值侵染细胞，并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选，获得混合系细胞。
当细胞的荧光率达90％时，进行单克隆稳转细胞系的构建。
结果最佳MOI值为60，此时细胞的荧光率达100％，但细胞的死亡率＜0.5％，细胞保持原有的形态。
当blasticidin敏感浓度为2μg／mL，此时空白细胞失去原有的贴壁性，全部死亡。
INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58，且siRNA的干扰效率为77.78％，siRNA 成功表达，混合稳转细胞系构建成功。
成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。
结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。
%Objective To optimize multiplicity of infection ( MOI) and antibiotics ( blasticidin) concentration selecting BSD gene in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.Methods The INS-1 cells were transfected byfluorescence labeled negative control SGMS2-siRNA lentivirus at MOI of 0, 10, 30, 60 and 120 TU number/cell.The cells were photographed under fluorescent microscopy after 72 h cultivation, then fluorescence ratio and apoptosis rate were calculated to determine optimal MOI.The INS-1 cells were treated by blasticidin with different concentrations of 0, 1, 2, and 3 μg/mL, and the apoptosis rate was observed to acquire optimal concentration of antibiotics.The INS-1 cells were transfected by negative control SGMS2-siRNA lentivirus and SGMS2-siRNA lentivirus (virus titer:1 ×108TU/mL) at optimal MOI and positive-transfected cells were selected by blasticidin at optimal concentration, then mixed cell lines were acquired.The monoclonal cell line was constructed at fluorescence ratio of 90%.Results The optimal MOI was 60 with 100% fluorescence ratio, less than 0.5% apoptosis rate and keep original cellular morphology.The optimal concentration of blasticidin was 2 μg/mL with cell adherence disappear and all cells apoptosis.The Ct value of INS-1-SEMS2 cells detected at the second time was 28.21, which was greater than 27.58 at the first time.The interfering efficiency of siRNA was 77.78% which indicated a successful expression of siRNA and construction of monoclonal stable cell line ( INS-1-SEMS2 ).Conclusion The monoclonal stable cell line was successfully constructed by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】4页(P51-53,56)【关键词】小鼠胰岛素瘤INS-1细胞;感染复数;BSD基因筛选抗生素;细胞稳转株【作者】金小花;秦高【作者单位】苏州农业职业技术学院食品科学系化学与生物技术教研室，苏州215008;上海诺百生物科技有限公司，上海 200233【正文语种】中文【中图分类】Q78在动物细胞学和分子学试验中，将外源目的基因通过病毒介质转入动物细胞中，是一个非常重要的试验步骤[1]。
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慢病毒介导的RNAi技术一、概述慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。
由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转入细胞内转录siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。
但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。
利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点：● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。
● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。
● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin可以在2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。
慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图1。
二、pLKO.1载体美国RNAi协作组（The RNAi Consortium）已经利用pLKO.1载体骨架构建了针对15,000个人类基因和15,000小鼠基因的shRNA库，详细信息见文献Moffat et al., Cell 2006 Mar; 124(6): 1283-98。
pLKO.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导入细胞，作为常规RNAi载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。
一旦进入细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin 抗性，Puromycin筛选可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。
图2，3分别为pLKO.1载体的图谱和shRNA的示意图。
元件注释5’ LTR5’ 长末端重复序列（long terminal repeat）RRE Rev反应元件，介导转录本出核，从而被有效包装U6 人类U6启动子，RNA聚合酶Ⅲ可以识别，指导下游shRNA转录shRNA insert 小发卡RNA插入片断cPPT Central polypurine tract，促进载体片断入核，提高整合效率hPGK 人类磷酸甘油激酶启动子，指导puromycin抗性基因的组成性表达Puro R 表达的蛋白使细胞具有puromycin抗性，方便选择sin 3’ LTR3’ 失活长末端重复序列F1 ori f1细菌复制起点Amp R 氨苄青霉素抗性基因pUC ori pUC细菌复制起点三、shRNA寡核苷酸序列的设计和合成A. 设计确定一段合适的21个碱基的靶序列是有效的敲低某个基因的非常重要的第一步。
现在一些互联网上的服务器能够帮助提供一些线索。
例如，由Whitehead生物医学研究所（The Whitehead Institute for Biomedical Research）设立和维护的siRNAext程序（/siRNAext），登记个人信息后，便可免费使用。
下面为一些设计siRNA的基本原则：1. 从起始密码ATG下游25个核苷酸后开始，寻找21个核苷酸，排列模式符合AA(N19)。
如果没有符合上述模式的序列，可以寻找符合NAR(N17)YNN这种排列模式。
N为任一核苷酸，R为嘌呤，Y为嘧啶。
2. GC含量介于36%-52%。
3. “sense”链3’端稳定性较低，在15-19核苷酸位置，至少有一个A或T。
4. 避免靶向内含子。
5. 避免21个核苷酸内有连续4个或更多重复的核苷酸，尤其避免重复的T，因为重复的T可以导致RNA 聚合酶Ⅲ转录终止。
为了避免设计的siRNA有靶向其它基因的脱靶（off-target）效应，需要进一步利用NCBI的BLAST 程序进行同源性搜索，选择至少和其它基因序列有3个错配的序列。
（通常需要选择多条序列来靶向同一基因，一是为了选择比较有效的siRNA序列，二是为了避免不可预知的脱靶效应，如果两条siRNA引起了相同的细胞表型改变，通常可以消除脱靶效应的疑虑。
B. 合成：一旦确定了靶序列，可以将靶序列放入下面的基本骨架：正向寡核苷酸（Forward oligo）5’ CCGG-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列-TTTTTG3’反向寡核苷酸（Reverse oligo）5’ AATTCAAAAA-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列3’基本骨架内红色标记的核苷酸为必须存在的核苷酸，这样，退火（Annealling）以后，寡核苷酸两端会形成以后能够连接入载体的粘性末端。
举例如下：如果靶序列为：AA（TGCCTACGTTAAGCTATAC）。
合成的寡核苷酸应为如下序列：正向寡核苷酸（Forward oligo）5’CCGG AATGCCTACGTTAAGCTA TAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCA TT TTTTTG3’反向寡核苷酸（Reverse oligo）5’AATTCAAAAA AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT 3’上述寡核苷酸合成规格为100nmol，纯化方式为PAGE纯化。
四、siRNA序列克隆入pLKO.1载体酶切pLKO.1克隆载体，合成的正向和反向寡核苷酸退火以后形成寡核苷酸双链，两端具有和酶切后的载体兼容的粘性末端，经过连接反应，便能产生含有shRNA序列的pLKO.1载体。
A.实验材料AgeI (NEB, #R0552S)，EcoRI (NEB, #R0101S)，Buffer 2(NEB, #B7002S)，Solution I (Takara, D6022)，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（QIAGEN，#28704），1.5ml微型离心管（Biologix, 货号：80-1500）。
B. 寡核苷酸退火溶解合成的寡核苷酸，终浓度20µM（高压灭菌水溶解核酸，水的体积=（合成得到的核酸nmol数X50）µl），按照表2反应体系在1.5ml微型离心管内配制反应。
在1L烧杯内准备700-800ml温度为95o C-100o C的水，将微型离心管置入烧杯，放置于试验台上，缓慢降温至室温，这个过程约需要2小时。
表2：退火反应体系5µl Forward oligo5µl Reverse oligo5µl 10 x NEB Buffer 235µl H2OC. 酶切pLKO.1克隆载体1. 首先用AgeI酶切，反应体系如下：4µg pLKO.1克隆载体5µl 10 X NEB buffer 12µl AgeI补水至总体积50µl37o C水浴孵育1小时。
2. 用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切反应产物，30µl H2O洗脱。
3. 纯化产物用EcoRI酶切，反应体系如下：30 µl AgeI酶切产物5µl 10 X NEB buffer for EcoRI2µl EcoRI13 µl H2O37o C水浴孵育1小时。
4. 在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离酶切后载体，可看到一约7kb的片断（AgeI和EcoRI酶切会切出约60bp 的寡核苷酸，在0.8%的凝胶上无法看到），切胶，回收，30µl H2O洗脱。
5. 测量核酸浓度。
D. 连接和转化按照下述反应体系配制连接反应：2µl 退火的寡核苷酸双链（步骤四. B）1µl 20ng/ µl 酶切的pLKO.1克隆载体2µl H2O5µl solution I22o C孵育15分钟，然后进行转化：取5 µl连接产物加入50 µl感受态细胞内，冰上放置30分钟，42o C水浴90秒，速置于冰上2分钟，将感受态细胞涂布于氨苄平板上。
16小时后可见有白色克隆。
同时，如果第一次使用酶切载体，推荐进行一个对照连接反应，不加寡核苷酸双链，用水补齐体积，酶切良好的载体为对照连接反应没有克隆或1-2个克隆，而加入寡核苷酸的连接反应可以得到10个以上的克隆。
E. 阳性克隆的鉴定挑取3-5个克隆，提取质粒，通过酶切和测序来鉴定阳性克隆。
1. 酶切鉴定1 µg 质粒2 µl 10 X NEB buffer for EcoRI0.8 µl EcoRI0.8 µl NcoI补水至总体积20µl37o C水浴孵育1-2个小时。
电泳可以见到2kb和5kb的两个片断。
2. 测序鉴定有时因为碱基修饰的原因，质粒不能被切开，这时可以通过直截测定序列的方法来鉴定。
酶切鉴定得到阳性克隆后，进一步需通过测序的方法来证实寡核苷酸序列是否正确。
测序引物为5’ CAAGGCTGTTAGAGAGA TAATTGGA 3’。
五. 制备病毒颗粒进行这些实验的实验室必须具有操作HIV和HIV相关病毒的资质和经验。
pLKO.1载体可以被作为常规载体使用，通过转染操作导入细胞，瞬时敲低基因。