植物检疫专业核酸检测方法验证程序试行
第四章 植物检疫程序.ppt
2019-8-9
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四、物理处理
利用热力、电磁波、超声波、核辐射等物理方法杀菌 灭虫的一种处理方式
应用范围：植物种子、无性繁殖材料、水果、蔬菜、 土壤等。
低温处理：包括速冻处理和冷冻处理 高温处理：包括干热法、湿热法、温汤浸泡法 电磁波处理：微波加热灭虫和60Co－射线辐射灭虫 气调处理：低O2和高CO2对害虫致死作用
2019-8-9
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3 品质检验
列入《实施检验检疫的进出境商品目录》的进 口植物及其产品，按照国家技术规范的强制性要求 进行检验；尚未制定国家技术规范强制性要求的， 可以参照国家质检总局指定的国外有关标准进行检 验。未列入目录的进出口商品申请品质检验的，按 合同规定的检验方法进行，合同没有规定检验方法 的按我国相关检验标准进行检验。其它检验内容按 相关标准进行。
件：一批货物中每一个独立的袋、箱、筐、桶、捆、托等。
散装货物以一定重量为一件
样本量：一份样品的重量或体积 样本数：一批货物中的几份样品即为样本数 取样方法：随机取样、百分比取样法 小样：初级样品，由一批货物的不同容器内或散堆的不同部
位分别抽取的样品。
混合样品：所取数份小样在容器内混合 平均样品：送检样品，小样混合后，再次进行取样。
4 样品由实验室保存。一般样品保存6个月（易腐烂的 样品除外），需对外索赔的保存到索赔期满方可处 理。
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四、结果评定与出证
1 检验检疫合格的 检验检疫结果符合要求的，出具《入境货物检验检疫
证明》《卫生证书》或《检验证书》。 2 检验检疫不合格的 2.1发现我国进境植物检疫危险性有害生物（一、二
植物检疫的具体流程
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国家质量监督检验检疫总局关于印发《进出境植物有害生物检疫鉴定管理规范(试行)》的通知
国家质量监督检验检疫总局关于印发《进出境植物有害生物检疫鉴定管理规范(试行)》的通知文章属性•【制定机关】国家质量监督检验检疫总局(已撤销)•【公布日期】2010.11.05•【文号】国质检动[2010]589号•【施行日期】2010.11.05•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】动植物检疫正文国家质量监督检验检疫总局关于印发《进出境植物有害生物检疫鉴定管理规范（试行）》的通知（国质检动[2010]589号）各直属检验检疫局，检科院：为加强进出境植物有害生物检疫鉴定管理，提高有害生物鉴定水平，总局制订了《进出境植物有害生物检疫鉴定管理规范》（试行），现印发你们，请遵照执行。
执行中如遇问题，请及时报告总局。
二〇一〇年十一月五日进出境植物有害生物检疫鉴定管理规范（试行）一、目标为加强进出境植物有害生物检疫鉴定管理，提高有害生物鉴定准确性，充分发挥并整合植物检疫鉴定人才资源，积极推行有害生物标本菌种毒株保存、有害生物远程鉴定等工作，根据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》及其实施条例等法律法规，制订本管理规范。
二、适用范围本规范适用于检验检疫机构进出境植物检疫截获有害生物和国内疫情监测有害生物的鉴定管理，重点针对检疫性有害生物或具有检疫意义的植物有害生物。
三、鉴定管理机构及职责国家质量监督检验检疫总局（简称国家质检总局）负责全国进出境植物有害生物检疫鉴定管理的组织与协调。
中国检验检疫科学研究院（简称检科院），受国家质检总局委托，承担全国进出境植物有害生物检疫鉴定技术协助。
直属出入境检验检疫局（简称直属局）负责本辖区植物有害生物鉴定管理。
四、鉴定人员资质要求及审定程序（一）植物有害生物鉴定人员资质分鉴定人、鉴定专家两类，分别由直属局、质检总局审定。
原则上，每年审定一次，并根据情况实施动态调整。
（二）鉴定人应具备以下条件：1. 具备植物有害生物检测鉴定专业背景，并具有本专业中级职称或相当于中级职称的资历。
《植物检疫程序》课件
不断改进植物检疫政策和法规，完善检疫流程和操作标准。
结束语
工作的重要性
植物检疫是保护农业生产和生态环境的关键工 作。
未来趋势
随着全球贸易的增加和气候变化的影响，植物 检序》PPT课 件
植物检疫是保护农业生产和生物多样性的重要措施。本课件将介绍植物检疫 的概述、操作程序、标准、措施、重点以及未来发展方向。
植物检疫概述
定义
植物检疫是防止有害生物传入或扩散的一系列措施。
意义
植物检疫保护农业、生态环境和人类健康，确保农产品质量和国际贸易安全。
植物检疫操作程序
技术措施
运用生物学、生态学和遗传学等技术手段进行植物检疫。
法律措施
制定法律法规、规章制度，加强检疫力度和处罚力度。
植物检疫的重点
进口植物检疫重点
防止有害生物通过进口途径传入，保护国内植物生态系统。
出口植物检疫重点
确保出口产品质量，满足国际市场要求。
植物检疫的未来
技术的发展
利用先进的检测技术和设备，提高植物检疫的精准性和效率。
准备工作
检查工具和装备，制定检疫计划。
主要内容
植物检疫包括查验、检测、隔离、处理和记录等操作。
处理工作
及时销毁有害生物，清理检疫区域，完善相关记录。
植物检疫标准
分类
植物病害和有害生物根据传播途径和危害程度进行分类。
法规和标准
植物检疫遵守相关法律法规和国际标准，确保执行的科学、公正和准确。
植物检疫措施
植物检疫的方法
植物检疫的方法嘿，咱今儿就来唠唠植物检疫的那些事儿！你知道吗，植物检疫就像是植物世界的健康卫士呢！咱先说说产地检疫吧，这就好比给植物们做个全面的体检。
在植物生长的地方，仔细检查它们有没有啥毛病，有没有害虫啊、病菌啊之类的。
这可不是随便看看就行的，得认真仔细，不放过任何一个小细节。
就像我们出门前要好好整理自己一样，得确保植物们干干净净、健健康康地出去闯荡。
然后呢，还有调运检疫。
这就像是植物们的旅行安检。
当它们要去到别的地方时，得好好检查一番。
万一有个“捣蛋分子”混在里面，那可不得了。
这就好比你要去朋友家做客，总不能带着一身脏东西去吧，那多不礼貌呀！调运检疫就是要确保植物们在运输过程中不会带来什么危害。
还有啊，市场检疫也很重要呢！想象一下，植物们就像一个个小宝贝，来到了热闹的市场。
这时候就得有人来把关，看看它们是不是都符合标准。
要是有问题的植物混进来了，那不是会影响其他健康的植物嘛，就像一群小朋友里混进了一个爱捣蛋的，那可不行！那怎么做好这些检疫呢？这可得靠专业的人员和先进的技术啦！他们就像植物的超级英雄，用各种厉害的手段来保护植物。
比如说，他们会用放大镜仔细观察植物的每一个部位，看看有没有异常。
这就像我们找东西一样，得瞪大眼睛，仔仔细细地找。
而且，检疫可不是一次就行的，得经常进行呢！就像我们每天都要刷牙洗脸保持卫生一样，植物检疫也得时刻保持警惕。
不然，那些害虫病菌可就有机可乘啦！咱再想想，如果没有植物检疫，那会怎么样呢？哎呀，那植物世界不就乱套了嘛！各种病虫害到处传播，植物们都遭罪，我们的生活也会受到影响啊！我们吃的蔬菜水果可能就没那么安全健康了，那多可怕呀！所以说呀，植物检疫真的太重要啦！这是保护植物、保护我们生活的重要手段呢！大家可都得重视起来，一起为植物们的健康保驾护航。
让我们的植物朋友们都能茁壮成长，为我们的生活增添更多的美好和生机！你说是不是这个理儿呢？。
植物检疫程序讲解
二、检疫申报(也称报检)
检疫申报是有关检疫物进出境或过境时由货主或代理人向 植物检疫机关及时声明并申请检疫的法律程序。
管理机构：国家质量监督检验检疫总局所属各口岸植物检疫 机关。
申报手续：一般由报检员负责办理报检手续。 应进行检疫申报的检疫物主要包括：输入、输出以及过境的
植物、植物产品、装载植物或植物产品的容器和材料、输入 货物的植物性包装物、铺垫材料以及来自植物有害生物疫区 的运输工具等。
第四章 植物检疫程序
检疫许可 检疫申报 现场检验 实验室检测 检疫处理与出证 检疫监管
附：中国内检、外检主要程序
植物检疫程序示意图
植物检疫程序
检
检
现
实ห้องสมุดไป่ตู้
检疫
疫
疫
场
验
处理 检疫
许
申
检
室
与 监管
可
报
验 检测 出证
第一节 植物检疫程序 一、检疫许可(检疫审批)
检疫审批指在调运、输入某些检疫物或引进禁止 进境物时，输入单位须向当地植物检疫机关预先 提出申请，检疫机关经过审批做出是否批准引进 的法定程序。
任。
报检员资格实行全国统一考试制度。
《报检员资格证》和《报检员证》由国家质检总局统一印制
报检单
报检
检疫证书
检
员填
产地证书
疫
写报 检单
贸易合同
机 关
信用证
发票
三、现场检验
现场检验是检疫人员在现场环境中对应检物进行检查、 抽样，初步确认是否符合相关检疫要求的法定程序。
现场检查和抽样是现场检验的主要内容。
无论国际还是国内贸易，凡是涉及植物及植 物产品调运的，均须事先办理检疫许可手续。在 对外签订贸易合同或者协议之前办妥 检疫审批手 续。
植物检疫程序
2.3 检查植物性包装材料、铺垫材料是否符合我国进境植物检 疫要求。
3 按规定抽取样品，需进行实验室检验检疫的，应填写送样 单并及时将样品连同现场发现的可疑有害生物一并送实验室 检验检疫。
四、结果评定与出证
1 检验检疫合格的 检验检疫结果符合要求的，出具《入境货物检验检疫证明》
《卫生证书》或《检验证书》。 2 检验检疫不合格的 2.1发现我国进境植物检疫危险性有害生物（一、二类）、潜在
危险生物、政府及政府主管部门间双边植物检疫协定、协议 和备忘录中订明的的有害生物、其它有检疫意义的有害生物 的，出具《检验检疫处理通知书》，报检人要求或需对外索 赔的，出具《植物检疫证书》。 2.2 安全卫生检验不合格的，出具《卫生证书》。 2.3 品质检验不合格的，出具《检验证书》。
申报要求：①必须事先向植物检疫部门提出申请；②必 须详细说明需要引进物的品名、品种、产地、引进的特殊 需要和使用方式； ③提供具有符合检疫要求的监督管理 措施。
办理进境检疫许可手续后，在有下列4种特殊情况之 一时，货主、物主或者代理人应当重新申请办理检疫许可 手续。这些特殊情况包括：变更了品种或数量；变更了输 出国家和地区；变更了进境口岸；超过了检疫许可有效期。
2.5 经审核符合出入境检验检疫报检规定的，接受报检。否则， 不予受理报检。
3 受理与时限规定
3.1 入境清关货物，应在进境前或进境时向入境口岸检验检疫 机构报检，由入境口岸检验检疫机构实施检验检疫。
入境清关货物，需调离到指运地实施检验检疫或因口岸 条件限制等原因确实无法在入境口岸完成检验检疫的货物， 入境口岸检验检疫机构可办理相关调离手续，并将货物流向 的有关信息通知指运地检验检疫机构，由指运地检验检疫机 构实施检验检疫。
植物检疫程序
• 产地检疫和预检的意义： （1） 提高检疫结果的准确性、可靠性； （2） 简化现场检验的手续，加快商品流通； 经过产地检疫和预检合格的植物和植物 产品，在进出境时一般不需再检疫。 （3） 避免货主的经济损失。
应用现状：
• 实践中能用噬菌体检验的植物病原细菌不 多，因噬菌体和细菌都有生理分化现象。 • 解决方法 获得能侵染大多数细菌菌系的广谱性寄 生的噬菌体株系。 如：日本柑橘溃疡病菌的Cp1和Cp2两个 噬菌体菌株，能侵染日本98%以上的柑橘溃 疡病菌菌株。
第五节 检疫监管与检疫检测
• 一、检疫监管
实施先后
实施现场 主要任务 主要方法 所需设备 人员要求
先
现场（机场、车站、码头、 邮局、货场等） 检查单证、抽取样品 肉眼检查
后
实验室（检疫部门、 检测中心等） 制定样品、鉴定种类 镜检、生化检查
放大镜、多孔筛、X光机、检 解剖镜、显微镜、离 疫犬等 心机等 应具专业基础知识和现场经 验 应具扎实的专业技能、 掌握检测方法
3、现场抽样
注意事项：代表性、害虫的移动性和趋性等。 样本量：一份样本的重量、体积和个体数量。 样本数：从同一批货物中抽取的样本的份数。
检疫抽样中样本数的确定需要视货物类型而定。
抽样方法： 根据不同有害生物的分布规律及生物学特性、货
物数量、装载方式、堆放形式等而定。
常用方法：对角线取样法、棋盘式取样法和随机
i. 漏斗分离法：分离可活动的线虫。也称改良贝尔曼 漏斗法。 ii. 过筛检验法：分离可活动的病原线虫。
iii. 漂浮分离法：分离土壤中马铃薯金线虫 （Globodera rostochiensis）和各种胞囊线虫 （Heterodera）的胞囊。 原理：干燥的胞囊比重较轻，可从水中漂浮出来。 方法：漂浮器分离法入的植物、植物产品、 种苗、繁殖材料；
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植物检疫专业核酸检测方法验证程序（试行）
第一章总则
目的
为提高植物检疫专业核酸检测方法的科学性和适用性，规范验证流程，特制定本程序。
范围
本程序适用于标准制修订过程中核酸检测方法的验证，包括采用现有方法和自主研发的新方法制修订的标准。
此外，实验室采用非标准方法及自主研发新方法时,也可参照本程序用以判定其可靠性，不做强制性要求。
若所制定的标准为等同采用国际标准，仅采用第二章中本实验室验证程序即可，但鼓励标准制修订方进行完整的验证流程。
若所制定的标准为修改采用国际标准，且修改了关键性技术，则应进行完整的验证流程。
组织机构
植物检验检疫标准化专业技术委员会（以下简称“委员会”）负责本专业有害生物核酸检测方法验证的组织、审核等管理工作。
委员会通过下设秘书处承担具体职责，包括审核验证实验室的资质，指定并组织验证实验室开展验证工作，组织专家进行验证材料的审核及验证数据的统计分析等。
术语与定义
1.4.1核酸检测方法验证
核酸检测方法验证（以下简称：检测方法验证）是确认某一核酸检测方法
适用于某一检测对象的过程。
1.4.2 本实验室验证
标准制修订实验室在合理的时间间隔内，以方法适用范围内不同样品为对象，对同一方法的验证指标进行确证的过程，初步判断方法可靠性。
1.4.3 独立实验室验证
独立于标准制修订方的实验室验证，判定方法的验证指标能否达到预期用途。
验证程序
开展验证工作的具体步骤如下，验证程序图见附录A。
1.5.1 本实验室验证
（1）标准制修订方完成方法草案，并设计验证方案。
（2）标准制修订方根据验证方案完成验证，并向秘书处提交验证材料。
验证材料应包括标准草案、验证方案和验证报告。
（3）秘书处组织专家审核验证材料的完整性与有效性。
1.5.2 独立实验室验证
（1）标准制修订方的验证材料审核通过后，秘书处组织实验室进行独立实验室验证。
（2）验证实验室完成验证后，直接提交验证实验报告及验证评价报告至秘书处。
秘书处组织专家审核独立实验室的验证评价结果。
验证结果的应用
根据独立实验室的验证结果，秘书处组织专家组评估方法能否满足预期用途，并形成评估结论。
若方法不能满足预期用途，秘书处将通知标准制修订方作必要修改；若存在严重缺陷，视为验证不通过，不能参加标准的审定。
评估将作为标准征求意见材料的附件，供征求意见专家参考，并作为标准审定时的重要依据。
第二章本实验室验证程序
验证方案
2.1.1 方法要求
待验证的检测方法应为标准化的，描述应明确完整。
所有涉及该方法的因素，包括阳性样品核酸、阴性样品核酸的来源及阳性样品鉴定报告、试剂、耗材、仪器、设备、器具、仪器设备的参数设置、样品的制备等均应包括在文件中。
2.1.2 方法的预期用途
标准制修订方应根据实际情况描述方法的预期用途，应当包括检测方法的适用范围和样品类型等。
2.1.3 验证指标
标准制修订方应根据方法的预期用途（2.1.2）选择合适的验证指标，设计并形成验证方案。
典型的验证指标包括方法的特异性、灵敏度、重复性、重现性等。
本实验室验证
标准制修订方应按照验证方案（），首先验证文本中规定的适用范围，初步判断方法的可靠性。
各指标的具体验证程序见附录B。
验证过程中，若某一指标的结果表明检测方法不能满足检测目标的特定要求，应对该方法作必要的修改并重新验证，直至能够证明其满足预期用途。
验证材料的审核
标准制修订方完成验证后，须向秘书处提交验证材料，具体包括：a）标准草案、b）验证方案、c）验证报告。
秘书处组织专家评估提交材料的完整性与符合性及验证方案的合理性。
若提交的材料不完整，应要求其补足材料；若材料完整，验证方案合理，且验证结果能够满足预期用途的要求，则进行独立实验室验证程序。
第三章独立实验室验证程序
秘书处组织验证实验室按照标准制修订方设计的验证方案进行独立实验室验证。
验证实验室通过重复测试验证指标，以审核方法的技术参数是否满足预期用途。
验证实验室的选择
3.1.1 验证实验室数量
参加验证的实验室不少于5个，原则上要求获得至少5个实验室的有效数据报告。
在特殊情况下，如参加独立验证实验的实验室确实不足等原因，经秘书
处商定后，可在较小的实验室范围内进行验证实验，但至少有两家以上有效数据报告。
3.1.2 验证实验室的要求
参加验证的实验室应具代表性，由秘书处从验证实验室库(附录C)中抽取，验证实验室按照验证方案开展实验。
验证样品核酸的要求
标准制修订方负责验证样品核酸的准备，核酸的质量应满足标准所列方法的要求，并满足核酸的稳定性和均匀性要求，并经相关学科的复核鉴定专家确认无误后方可使用。
测试完成后，将测试结果提交到秘书处。
原则上验证样品核酸应包括特异性实验所需的近似种样品核酸（针对具体有害生物种类，近似种的选取及数量由相关学科复核鉴定专家商定，若不能提供近似种样品核酸，需提供2位相应学科复核鉴定专家的书面同意意见及理由），考虑到验证过程中可能会出现操作失误，样品数量应充分满足测试所需。
验证实验的实施
秘书处与选定的验证实验室联系并经实验室确认后，根据验证方案，标准制修订方将验证样品核酸和验证方案分发给各验证实验室。
各实验室应在规定时间内完成验证实验，每个验证实验室应需重复测试3次。
验证材料的提交
参加验证的实验室应根据标准草案的要求，在规定期限内将验证实验报告及评价报告（附录D）提交至秘书处，秘书处组织专家审核报告。
若结果不能
完全满足方法的预期用途，秘书处将结果反馈给标准制修订方，并要求其对方法进行必要的审查并重新进行本实验室的验证程序；若结果满足方法预期用途，则完成独立实验室验证程序。
特异性
特异性是指某一检测方法只能检测特定检测对象。
若采用的方法特异性不能满足预期用途，应采用多个方法予以补充，方法特异性的任何限制都应在方法中有文件化的规定。
特异性原则上应满足以下要求：（1）对待检对象不同地理种群的检测结果为阳性；（2）与待检对象亲缘关系较近的有害生物的检测结果为阴性；（3）同寄主上的其他有害生物尤其是引起类似症状的有害生物的检测结果为阴性；（4）对适用范围中健康寄主植物及其产品的检测结果为阴性。
灵敏度
该验证指标的意义在于考察方法是否具备足够的灵敏度以满足口岸检疫的要求。
对于每种代表性样品需要独立验证其灵敏度。
可用已知的阳性样品进行实验，对阳性样品制备的核酸溶液梯度稀释的方式确定最低检测灵敏度，以刚好能被有效检出的浓度水平作为灵敏度。
重复性
对于同一样品的检测，需重复3次实验以上，分析各检测结果之间的差异是否显著，以测试方法的可靠性。
重现性
在不同地区，不同实验室，不同主流品牌试剂，不同操作人员的情况下，测试方法的稳定性与可靠性。
方法应适用于实验室拥有的同类主流检测仪器，
若所用参数不同，应在文件中说明。
对方法中涉及的关键仪器设备，需在主流型号的仪器上测试，确保结果的可靠性。
附录C 独立验证实验室库
独立验证实验室的选择
秘书处根据需验证的有害生物的种类及口岸检疫的具体情况，结合实验室认可、指定口岸等因素，考虑地域、仪器和人员配置等条件，选择独立验证实验室。
独立验证实验室库
独立验证实验室库中包含（1）总局规划的重点实验室及区域性重点实验室（2）技术能力较强，具有开展核酸检测能力的系统内实验室；（3）某些产品的指定口岸所在的检验检疫局实验室；（4）国内其他具有能力的相关实验室。
附录D 验证报告参考格式
验证实验报告
验证实验室应提供验证实验中涉及关键步骤的原始记录（包括PCR电泳图、荧光PCR的荧光图谱或芯片检测的原始数据图等），以确保实验结果的可追溯性。
验证实验报告应包括详细的实验步骤、关键仪器型号、操作及数据结果等，并对结果进行分析，报告需反映实验及结果的真实性。
验证评价报告
验证者根据验证实验的结果，填写验证评价报告，报告格式参考表。
表验证评价报告参考格式
标准名称及立项号
起草单位及起草人
验证单位及验证人
岗位职称
联系电话电子邮件
方法特异性□特异完全满足使用要求
□比较特异基本满足使用要求□特异性不够不能满足使用要求描述：
方法灵敏度□灵敏度高完全满足使用要求□比较灵敏基本满足使用要求□灵敏度不够不能满足使用要求
描述：
重复性
请验证专家根据实际情况评价。
方法重现性
请验证专家根据实际情况评价。
方法的可操作性□方法科学，可操作性强，适合口岸实际情况
□可操作性一般，时间长，试剂购买难，操作比较复杂
□难于操作常规实验室不具备硬件及软件条件，不适合目前口岸实验室使用。
描述：
方法的安全性1、对人员及环境安全性
□安全所用试剂安全环保，对操作人员及环境无伤害
□安全性尚可需要防护设施，适合应用
□不安全易导致操作人员伤害，需要常规实验室不具备的防护设施。
2、有害生物逃逸及扩散的可能性
□安全常规操作不会导致有害生物逃逸及扩散
□安全性尚可需要防护设施，能有效防止有害生物逃逸及扩散
□不安全易导致有害生物逃逸及扩散
综合评价
验证人员签字时间单位公章时间。