淋巴细胞种类检测的方法和意义
淋巴细胞亚群测定
1检验目的检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等）的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。
2 检验方法和原理2.1 方法：流式细胞术2.2 原理：在含有准确数量荧光计数微球的试管(如BD TruCount)中，加入一定体积的抗凝血液和六色荧光素标记的单克隆抗体进行免疫荧光染色，按溶血／免洗方法进行流式细胞仪检测，以CD45／SSC设定淋巴细胞门，应用FACS Canto软件自动进行多重逻辑设门和统计分析数据，可以准确计数血液中淋巴细胞亚群的绝对数量。
3 原始样本种类3.1 样本类型：KEDTA抗凝静脉血样本。
2EDTA或肝素抗3.2 样本容器：盛放样本的容器为洁净的一次性真空采血管（K2凝）。
3.3 样本保存：抽取样本后置于加有抗凝剂（一般选择EDTA或肝素）的试管中，室温（20-25℃）保存，尽量于采血后48小时内处理样本；标记后的样本最好在24小时内完成上机检测。
4设备和试剂4.1 设备名称：BD FACS Canto II流式细胞仪型号：Canto II厂家：美国BD公司4.2 试剂4.2.1 主要试剂本实验采用BD公司的试剂。
4.2.1.1 BD MultiTEST 6-color TBNK Reagent货号：337166规格：1ml厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
只有相同批号的各种成分才能相互混用。
4.2.1.2 绝对计数管（TruCOUNT Tubes）货号：340334规格：25tubes/盒厂家：美国BD公司储存条件：2-25℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
TruCOUNT Tubes 从冰箱拿出后需平衡至室温，方可打开包装袋。
每次用前，需要检查包装袋内的干燥剂，如果由蓝色变成粉色，则TruCOUNT Tubes不能继续使用。
4.2.1.3 溶血素Lysing Solution（10X Concentrate）货号：349202规格：100mL厂家：美国BD公司储存条件：2-8℃避光保存，在试剂盒标识的有效期前使用。
淋巴细胞及其亚群检测的临床意义ppt新版
1、T细胞在胸腺中的发育
三个阶段 三个重要事件 三个重要结果
双阴性阶段 (DN) 双阳性阶段 (DP) 单阳性阶段 (SP)
TCR基因重排 阳性选择 阴性选择
获得功能性TCR 获得MHC限制性 获得自身耐受
T细胞受体（TCR）的发育
过程： DP细胞
CD8+ T细胞
杀伤靶细胞 有重要的负 答 初始T细胞（naive T cell） 引起迟发 调节功能 型超敏反 CD4+和CD8+T细胞有助于监测患有免疫缺陷疾病（如SCID、AIDS的病人体内CD4+细胞亚群的百分率相对降低，而CD8+群体的百分
率相对升高），自身免疫性疾病（如在SLE病人中，CD8+淋巴细胞的相对百分比往往会降低，但当使用类固醇药物治疗时，也可能上
TCR
和
TCR
两种类型。
二、 T淋巴细胞的分化发育
释放穿孔素，颗粒酶杀伤靶细胞
CD3分子的低度表达 按T细胞的CD4和CD8分子表型
主要表面标志：CD8+CD28初始T细胞（naive T cell）
对免疫应答有重要的负调节功能
部位：胸腺皮髓质交界处及髓质区。
初始T细胞（naive T cell）
按T细胞所处的活化阶段 初始T细胞（naive T cell） 效应T细胞（effector T cell） 记忆性T细胞（memory T cell）
按TCR的表型分类 TCR + T细胞 TCR + T细胞
按T细胞的CD4和CD8分子表型 CD4+ T细胞 CD8+ T细胞
按T细胞的功能分类 Th（help T cell） Tc/C TL（cytotoxic T cell） Tr（regulatory T cell）
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
T淋巴细胞亚群分类检测详解
T淋巴细胞亚群分类检测详解T淋巴细胞是来源于骨髓的淋巴样干细胞，简称T细胞。
它负责细胞免疫功能，参与抗肿瘤、抗细胞内感染微生物、移植排斥、迟发型超敏反应；对部分体液免疫发挥辅助功能。
它在免疫应答中处于中心位置，是最重要的免疫细胞之一。
通过T淋巴细胞亚群的检测可了解不同情况下体内免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，监测、指导临床治疗。
T淋巴细胞分群T淋巴细胞的种类相当多样，按照细胞表面识别分子可以分为CD8+和CD4+两大亚群。
目前齐鲁检验所主要做以下项目的检测：总T淋巴细胞（CD3+）、CD4+细胞、CD8+细胞和CD4+/CD8+的比值：总T淋巴细胞可以结合总B淋巴细胞（总淋巴减T淋巴细胞）来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。
CD4+、CD8+T细胞有助于监测患有免疫缺陷疾病，如SCID（先天性免疫缺陷）、AIDS（艾滋病）的病人体内CD4+细胞亚群的百分率相对降低，而CD8+群体的百分率相对升高；自身免疫性疾病，如SLE（系统性红斑狼疮），CD8+淋巴细胞的相对百分比往往会降低，但当使用类固醇药物治疗时，也可能上升；在急性GVHD（移植物抗宿主病）和移植排斥中，CD8+淋巴细胞所占的比例多表现异常。
CD4+/CD8+的比值评价那些自身免疫失调、被怀疑免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人，以免受到急性GVHD的攻击。
CD4/CD8 升高：自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、SLE；CD4/CD8 降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。
CD4/CD8比值与恶性肿瘤恶性肿瘤患者术前CD4/CD8比值低，术后比值恢复正常；当发生癌转移时，CD3 、CD4 细胞数明显减少的同时CD8 细胞数明显增多,CD4/ CD8 比值明显降低,提示恶性肿瘤患者晚期细胞免疫功能更低,预后更差；肿瘤终未期患者CD4/CD8比值异常，可预测患者存活期。
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？
淋巴细胞亚群检测报告怎样看懂？淋巴细胞是一种包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等多个亚群的白细胞，它们各自具备不同的免疫作用，协同工作来维护机体免疫平衡和抵御外部侵害。
淋巴细胞亚群检测可以帮助医生了解不同亚群的数量和比例，从而判断免疫系统是否受到影响，同时也能够为一些免疫相关疾病的诊断提供重要参考依据。
在本文中，我们将详细介绍淋巴细胞亚群检测报告中的各项指标含义及其正常值范围，希望能够帮助您更好地理解和解读检测结果。
1.淋巴细胞亚群是如何检测淋巴细胞亚群的检测通常采用流式细胞术、荧光素标记技术等方法。
流式细胞术是一种通过测量单个细胞的光学和物理特性来分析淋巴细胞亚群的数量和比例的技术。
通过将淋巴细胞标记上荧光素等物质，然后把标记的淋巴细胞注入流式细胞术仪中，利用激光束照射、散射、荧光及电导等特性检测并分析细胞的类型、数量、活性等参数，从而识别出各类淋巴细胞亚群。
而荧光素标记技术则是一种在淋巴细胞前处理过程中进行标记的技术，该技术可将淋巴细胞分类并标记在表面（例如用荧光标记）后，再使用流式细胞仪来测量并分析淋巴细胞亚群的数量、活性以及分布情况等。
这些检测方法都是无创的、准确度较高、操作简便、结果可靠，已经成为临床上常用的检测手段之一。
1.淋巴细胞亚群检测的临床意义2.1 评估机体免疫功能淋巴细胞是机体免疫系统中最重要的细胞类型之一，在免疫应答中发挥着重要作用。
淋巴细胞亚群检测可以对机体免疫功能进行全面评估，了解机体是否有免疫功能障碍或免疫力下降等问题。
2.2 辅助诊断病情淋巴细胞亚群检测可以帮助医生判断感染性疾病的类型及病情轻重，如通过测定CD4+ T细胞数目，可以确定HIV感染者的病情进展及治疗效果；通过测定CD8+ T细胞数目，可以推测病毒性肝炎等疾病的病情程度。
2.3 指导免疫治疗方案针对某些自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等，淋巴细胞亚群检测可以帮助医生选择合适的免疫调节治疗方案。
科普分享｜帮助了解你的免疫力，淋巴细胞亚群检测知多少
近两年，在起起伏伏的新冠疫情和疫苗的接种普及之中，“免疫”这个词被越来 越多的提及，大家也逐渐认识到到免疫功能的重要性。适度的免疫力是对抗疾病 的强有力保障，而免疫功能过度活跃又有可能引发不同程度的炎症反应，甚至引 发器官衰竭导致死亡。若想了解我们机体的免疫力水平，检验科开展的“淋巴细胞 亚群和绝对值计数”项目就可以帮助到您。此项目有什么临床意义？适用于哪些人 群？一堆令人眼花缭乱的CD分子又代表什么呢？且听小编为你细细道来。
五 淋巴细胞亚群检测相关注意事项
标本采集：EDTA-K2抗凝血（紫管），抽取全血标本2mL 标本运输：常温保存运输，24小时内标本送检到实验室 文字：魏清 施碧胜 审核：李敏 网站：张琪
一 什么是淋巴细胞亚群
人体的免疫系统就像一支训练有素的军队，时刻消灭外敌，防止内乱，保卫我们人体家 园的稳态和健康。在这浩浩荡荡保家卫国的免疫大军中，单核－巨噬细胞系统分布于各组织 器官，具有较强的吞噬和杀伤能力，是免疫系统的“边防哨兵”，此类细胞还具有抗原提呈作 用，又是汇报敌情的“通讯兵”。中性粒细胞是随着血液循环四处巡逻准备狙击病原体的“野战 兵”。除此之外，人体免疫还有一支非常重要的“主力军”，能够实现现代化作战方式，将病原 体（尤其是病毒）消灭，这就是淋巴细胞。
三 哪些人群需要进行“淋巴细胞亚群和绝对值计数”检测
在机体免疫功能（免疫防御、免疫监视、免疫自稳）受损的情况下需要考虑进行淋巴细 胞亚群检测，主要有以下人群： 免疫功能低下、缺陷或者亢进的患者，尤其是幼儿、老人和自身免疫病患者等 慢性病患者：如II型糖尿病、慢性肝炎、慢性肾炎和心脑血管疾病患者等 当下处于放／化疗过程中的肿瘤患者 血液病患者 器官移植患者 复发性流产、子宫内膜异位症和不孕症患者等 不明原因发热患者，排查病因
淋巴细胞标志和功能的检测
淋巴细胞标志和功能的检测人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。
临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。
因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。
第一节T细胞表面标志的检测一、特异性抗原的检测检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。
自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。
常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如表21-1所示。
表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特异性用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。
两类方法各有优缺点。
以下叙述有代表性的方法。
（一）间接免疫荧光法本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。
如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。
（二）免疫细胞化学法通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。
为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。
该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。
淋巴细胞亚群检测五项解读
淋巴细胞亚群检测五项解读
淋巴细胞亚群检测，是一种检测人体免疫系统活动的实验方法，主要用于诊断感染性疾病，判断炎症反应和抗原抗体的变化情况。
检测时，将血液样本中的淋巴细胞按照不同形态特征进行分类，如：B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞等，从而了解患者的免疫状态，进而更好地诊断和治疗疾病。
淋巴细胞亚群检测五项解读：
1）B细胞比例：B细胞是淋巴细胞的主要组成部分，可以产生抗原抗体，从而帮助抗击外界病原体的侵袭。
正常情况下，B细胞比例多在20%~30%之间。
2）T细胞比例：T细胞主要负责维持人体的免疫平衡，其中CD4+T细胞和CD8+T细胞是T细胞的重要组成部分，正常情况下，CD4+T细胞比例在40%~50%之间，CD8+T 细胞比例在20%~30%之间。
3）自然杀伤细胞比例：自然杀伤细胞（NK细胞）是免疫系统的重要组成部分，可以有效抑制病毒感染和恶性肿瘤的生长。
正常情况下，NK细胞比例多在15%~20%之间。
4）单核细胞比例：单核细胞也是淋巴细胞的一种，可以促进炎症反应，也可以抑制炎症反应。
正常情况下，单核细胞比例多在3%~7%之间。
5）淋巴细胞比例：淋巴细胞比例反映着人体免疫系统的活动情况，正常情况下，淋巴细胞比例多在25%~45%之间。
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检测CD4+T淋巴细胞数的标准方法是流式细胞术。
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是目前公认的测定淋巴细胞百分比和CD4+T 淋巴细胞绝对数目的金标准。
它是一种对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。
流式细胞仪是集合了激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。
随着相关技术的迅速发展，流式细胞仪成为日益完善的细胞分析和分选的工具。
几乎临床医学各学科都涉及流式细胞分析技术的应用，它已成为推动临床医学发展的重要手段之一。
人们发现HIV病毒感染者由于CD4+T淋巴细胞的减少而逐渐发展成为获得性免疫功能缺陷症(AIDS)后，流式细胞术由一种研究性的工具迅速发展成为常规临床诊断不可或缺的技术。
在HIV感染者疾病进程观察、抗HIV病毒治疗时机的确定及抗病毒药物疗效的监测中，CD4+T淋巴细胞百分比及绝对数目的变化对临床均有重要的意义。
为提高对艾滋病等疾病的诊断和治疗效果，改善艾滋病患者特别是农村患者的生存质量，中国已先后从美国BD公司进口了110台流式细胞仪，目前已配备到全国25个省的疾控中心和医院，专门用于艾滋病患者CD4+T淋巴细胞计数。
目前国内三级以上医院的临床实验室绝大多数已开展了流式细胞分析工作。
淋巴细胞各亚群百分比的测定
影响CD4+T淋巴细胞计数的因素有季节、昼夜差、某些并发症和皮质醇类药物等，而性别、成人年龄、紧张、生理性应激和妊娠对CD4
细胞数虽有影响，但影响不大。
由于CD4+T淋巴细胞百分数受变异影响较绝对计数小，故CD4+T淋巴细胞百分率有时比绝对数对临床更有意义。
随着荧光素种类的丰富，可以同时对样本的多种淋巴细胞亚群和亚类进行测定(表10．4)。
1．实验原理
利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标上荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面的CD分子特异性地结合，然后用流式细胞仪检测，结合分析软件的自动分析即可得出各亚群细胞的百分比。
2．主要实验设备及试剂
低速离心机(可调速；可放置12mm×75mm小管的转子)，移液器及涡旋混合器，烧杯，量筒或移液管，可放置12mm×75mm小管的试管架。
PBS溶液：O．22um滤膜过滤。
蒸馏水：0．22um滤膜过滤。
NaClO3：滤纸过滤，清洗时请用蒸馏水10%稀释次氯酸钠，现配现用。
多聚甲醛：贮存液为4％多聚甲醛溶液，pH7.2～7.4，置于2～8℃保存。
使用时，用PBS稀释为1％浓度，0.22／um滤膜过滤后使用，2～8℃保存可用一周。
3．实验步骤
1)取出流式试管进行编号。
采抗凝血2～3ml(室温放置不超过6h)，颠倒混匀，分别取100ul全血加入每支试管中，不要碰到管壁。
2)轻轻混匀，依次加入20ul双标(CD3／CD4、CD3／CD8、CCl45／CDl4、CD3／CDl9、CD3／CDl6+CD56等)或三标荧光抗体(CD3／CD4／CD8、CD3／CDl9／CD45等)及同型抗体(Isotype)对照(鼠
IgG1/IgG2a)。
混匀后室温避光保存20min。
3)取出试管，每管加入10倍稀释的FACS Lysing Solution 2ml，轻轻混匀，避光<10min。
待管内液体透亮。
然后1200r／min离心5min，弃去上清液。
4)每管加入1ml的PBS，轻轻混匀，1200r／min离心5min，弃去上清液。
然后加入0．3ml PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入O．3ml 1％的多聚甲醛，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。
5)在检测之前，先启动。
FACSComp软件，对仪器用CaliBRITE Beads 试剂进行校准调试：取试剂盒中的未标记试剂一滴加人第一支试管，加入鞘液1ml，混匀；取4种试剂(FITC、PE、PerCP、Unlabeled)各一滴加入第二支试管，加入鞘液2ml，混匀。
然后进行仪器的校准。
6)启动Simulset软件或Cellquest软件检测标本(图10．1为检测结
果样图)。
4．注惹事项
1)弃掉试管中的上清液时，一定保证垂直倒掉。
2)2～8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定。
过期试剂不能使用。
3)抗体试剂不能冻存，保存期间或与细胞孵育时不能直接暴露于光线。
试剂瓶应保持干燥。
4)操作时如未按指定的孵育和离心次数或温度进行，容易发生错误。
5)为了得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h内染色。
6)任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。
抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错误结果。