第九章 放射性核酸探针的制备及应用
核酸荧光探针的设计和应用
核酸荧光探针的设计和应用随着生物技术的发展和突破，核酸荧光探针在遗传学、病毒学、药物研发等领域中得到广泛的应用。
本文将介绍核酸荧光探针的设计和应用。
一、核酸荧光探针的设计核酸荧光探针可以被分为两类，一类是“探针+靶标”，另一类是“探针+氧化还原剂”。
前者的原理是利用探针与靶标结合后，通过信号转导发出关于靶标的信息。
而后者则是直接在探针上标记一个氧化还原剂，使其发生氧化还原反应，从而发出荧光信号。
设计核酸荧光探针需要考虑两个因素：探针本身的性质和靶标的特异性。
探针本身应具有良好的荧光性质，如高荧光强度和较长的寿命，以便于准确测定其信号。
同时，探针应该具有发光与反应的特异性，以保证不受其他杂质或干扰物的影响。
在设计核酸荧光探针时，需要注意一些重要的角度：首先是选择标记物。
标记物的大小和化学活性将决定探针的靶向特异性和探针的合成方法。
其次是选择反映机制。
不同的反映机制可以用于反映核酸的变化，我们需根据实际情况选择不同的反映机制。
最后是考虑自身的生物学意义。
我们需对不同的机制研究设计探针，以满足不同的生物学需要。
二、核酸荧光探针的应用核酸荧光探针可以广泛应用于多种领域中。
下面我们将重点介绍一些常用的应用举例。
1、基于核酸荧光探针的分子诊断技术核酸荧光探针可以非常灵敏地检测DNA和RNA的变化，这为分子诊断技术提供了基础。
分子诊断技术通过检测某些特定基因或蛋白质的变化，以诊断一些常见疾病，如艾滋病、癌症等。
分子诊断技术具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。
核酸荧光探针在诊断方面的应用已被广泛研究和开发。
例如，某些病毒、细菌或寄生虫性疾病的核酸荧光探针已被广泛应用。
2、基于核酸荧光探针的基因表达分析技术核酸荧光探针可以非常灵敏地检测基因的变化，包括基因表达和调节。
基因表达分析技术通过检测某些基因的变化，以研究这些基因的生物学功能和生物学作用。
基因表达分析技术具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。
核酸荧光探针在基因表达分析方面的应用已被广泛研究和开发。
核酸探针的原理及应用
２０ 年 第 ４ 卷 第 ７期 ０６ １
生
物
学
通
报
核 酸 探 针 的 原 理 及 应 用
张 明琴 窦 远 张 建华 ｚ 宁 中琰 陈吉 宝 。
（ １河 南 省 邓 州 市 成 人 专 科 学 校 河 南 邓 州 ４ ４ ５ ２河 南 省 邓 州 市 教 委 河 南 邓 州 ７ １０ ４４５ ７ １０ ３ 中 国 农 业 科 学 院 作 物 科 学 研 究 所 北 京 １０ ８ ） ０ ０ １
摘 要 近 年 来核 酸探 针 作 为 一 种 基 因诊 断技 术 逐 渐被 人 们 接 受 ， 综 述 了核 酸 探 针 的 设 计 原 理 、 制
作 方 法及 其 在 生 物领 域 中的 应 用 ， 中学 生 物 学教 学提 供 参 考 。 为
关 键 词 核 酸探 针 Ｓ ｕｈ ｒ 印 迹 杂 交 ｏ ｔｅｎ 基 因诊 断
１ 核 酸 探 针 的 原 理
对 原 则 设 计 的 一 种 检 测 目标 Ｄ Ａ 序 列 是 否 存 在 的 一 Ｎ
段 核 酸 序 列 ．探 针 与 目标 序 列 的 这 种 结 合 称 为 杂 交 。 般先将探 针核酸 分子用某 种可 检测 的物质标记 ， 然
一
后 用 探 针 去 和 待 检 测 的序 列 杂 交 ， 果 探 针 与 被 检 测 如
探 针 ｆｒｂ） 常 是 指 针 对 某 种 特 定 目标 物 的探 测 ｐｏｅ通 器 ，基 于 核 酸 分 子 杂 交 原 理 的 核 酸 探 针 （ｕ ｌｏｉｅ ｎｃ ｔ ｅ ｄ
ｐｏ ｅ 可理解 为一类 能 特异 性 识别 目标 分 子（ 酸 序 列） ｒｂ ） 核 ， 并适 合 直接 检测 或 带有 可 检测 标记 物 的核苷 酸 序列 。 核 酸 探 针 技 术 具 有 专 一 性 强 、 敏 度 高 、 速 、 确 等 特 灵 快 准 点 。 些优 势使 其在 生 物大 分 子研 究 、 物 分析 、 这 药 司法 鉴 定 、 床疾病 诊 断 和治 疗 等方 面都 发 挥 出 巨大作 用 。 临 １ １ 核 酸 探 针 的原 理 生 物 体 含 有 相 对 稳 定 的 Ｄ Ａ ． Ｎ 序 列 ， 易 受 外 界 环 境 因素 的 影 响 而 改 变 。一 般 来 说 不
核酸探针的制备
万方数据 3"’""%$ ， 546782： 97:;<=7:> 7?6=@ 1A=@ B:
・ S>・
安徽医科大学学报O !"#$ %&’()*+’#$#’+ ,)-’"’&$.’+ !&/0’O &..6 T+H； 67 （=）
!"# 以灭活内源性过氧化物酶； 切片上滴加 $% 柠檬 酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化 & !"#， 加入 ’()*+ , 水解细胞中 ’(-； 每张切片 &. !/ 加预杂交液， 置 $0 1 2.3 杂交箱中预杂交 & 1 2 4； 每张切片加 &. !/ 浓度为 .5 6 1 & !7 8 9 的地高辛标记探针的杂交液； 置 $0 1 2.3 杂交箱中杂交过夜； 依次用 & : ;;< 、 .5 6 : ;;< 洗涤、 .5 & : ;;< 洗涤 =6 !"# 洗涤后滴加封闭 液， $. !"# 后滴加生物素化鼠抗地高辛置 $03 >. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗 6 !"# : 2 次。勿用其它缓 冲液和 蒸 馏 水 洗 涤； 加 ;-A< $03 &. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗 6 !"# : $ 次。勿用其它缓冲液和蒸馏 水洗涤； 滴加生物素化过氧化物酶 $03 &. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗涤； 按 ’-A 显色试剂盒说明滴加 显色剂， 镜下控制显色， 苏木精复染， 充分水洗， 酒精 脱水， 二甲苯透明， 封片。 !" 结果 !# $" %&’ ()&’ 检测标记探针 " 纯化的 ’,B 标记的 C;DE= F’(- 探针经 ’?G H/?G 鉴定， 结果表明其可与 目的 ’(- 有效互补结合 （ 图 =） ， 提示该探针可用于 组织切片的 ’(- 原位杂交、 I(- 原位杂交和 ;?JG4E +K# H/?G、 (?KG4+K# H/?G 等试验。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
生物探针的制备及其在生物研究中的应用
生物探针的制备及其在生物研究中的应用生物探针是生物学研究中不可或缺的重要工具。
生物探针应用广泛，在基因、蛋白、细胞等多个层面发挥了重要作用。
本文将重点介绍生物探针的制备方法及其在生物研究中的应用。
一、生物探针的制备生物探针的制备涉及多个环节，包括探针的设计、合成、修饰等。
常用的制备方法有以下几种。
1. 普通引物法普通引物法是制备DNA和RNA探针的常见方法。
该方法基于DNA和RNA的互补配对原理，使用DNA或RNA合成机制合成一段与目标DNA或RNA互补的序列作为探针，并加标荧光或化学物质来标记探针。
该方法制备的探针基本上只能用于特定序列的探测，具有较好的特异性。
2. 荧光染料标记法荧光染料标记法常用于制备荧光探针。
该方法先合成一段与目标DNA或RNA互补的探针序列，再用荧光染料标记探针。
该方法制备的荧光探针可以用于真菌、细菌等多种生物体的检测。
3. 蛋白质标记法蛋白质标记法常用于制备蛋白质探针。
该方法基于酶标技术，将目标蛋白质与酶结合，形成酶标记蛋白。
酶标记蛋白可以通过抗体检测方法定量检测其特定靶向蛋白质。
该方法制备的蛋白质探针在疾病诊断、药物筛选等方面有着广泛的应用。
二、生物探针在基因研究中的应用1. 基因测序生物探针在基因测序中有着至关重要的作用。
生物学家可以根据DNA序列设计合适的引物，使用引物进行PCR扩增，并用测序技术读取DNA序列信息。
生物探针扩增技术可以快速得到基因信息，为基因功能研究提供重要支持。
2. 基因表达分析生物探针可以用于分析基因的表达情况。
以微阵列分析为例，可以将已知的基因序列设计为生物探针，制备而成微阵列分析芯片。
将待分析样品RNA转录成cDNA，然后加标可检测的荧光标记，与微阵列分析芯片杂交，通过测定荧光信号强度鉴定哪些基因表达水平上调或下调。
3. 基因诊断生物探针在基因诊断中也有着广泛应用。
例如PCR技术配合荧光标记的探针可以分析目标基因的突变情况。
生物学家可以根据某一突变位点，设计荧光染料标记的探针，进行PCR扩增，再通过荧光信号检测突变状况。
核酸探针标记
硷基
OOO
H H(OH)
2、放射性标记物的优缺点
优点：灵敏度高：0。01pg
半衰期短，不能长期保存
二）非放射性标记物
1、优缺点
优点：无放射性污染
成本低、操作简单
缺点：敏感性、特异性均低于放射性核
素
2、常用的标记物
1）生物素：1-2pg
生物素化核苷酸：bio-16-dUTP
（一）缺口翻译法或切口平移 （nick translation）
5‘ 3‘
5’
3’ 5’
3‘ 限量DNA酶I 5‘
5’-3外切酶和5’-3 内切酶
5’ 3’
DNA聚合酶I+ 32P-dNTP
变性
32P部分标记的 单连DNA片段
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一 条连上产生若干个单连缺口
酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜
（二）随机引物法（random priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用
E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段 （仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶 的活性）
产生射线的核素：32P、3H、35S
产生射线的核素：125I
1、常用的放射性核素
1） 32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最 常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）： 位和位标记。
2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感 度底
O(S) O(S) O(S)
OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O
生物素化的核苷酸和 光敏生物素
第九章 放射性核酸探针的制备及应用
•根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。
第一节 放射性核酸探针的基本类型与制备方法
•一、双链DNA探针 • 1、切口平移法(Nick translation) • 2、随机引物合成法 •二、单链DNA探针 • 1、从M13载体衍生序列合成DNA探针 • 2、从RNA合成单链cDNA探针 •三、末端标记DNA探针 • 1、3，末端标记 • 2、5，末端标记 • (1) 前向反应(Forward reaction) • (2) 交换反应(Exchange reaction) •四、寡按苷酸探针 • 1、 T4多核苷酸激酶标记 • 2 、末端转移酶标记(Altar等，1989) • 3、 Klenow片段标记 重组子，通常都采用杂交进行筛选，以便在较短的时间内获得阳 性克隆。用DNA片段作为探针进行杂交的溶液主要有：甲酰胺； 水溶液。这两种溶液都能得到良好的结果。
•（ 4 ）鉴定作物品种 由于不同品种的作物，其DNA 和mRNA 存在 着差异，因此用特定的核酸探针进行不同品种间的分子杂交，可 得到不同品种在遗传物质上的差异。
第九章 放射性核酸探针的制备及应用
•探针（probe）是指经放射性等物质标记的特定的DNA或RNA序列。 •利用探针通过核酸杂交可检、鉴定和分析的许多方面都涉及到利用探针进行析目的基因的转录和加工情况需要用标记探针与 RNA杂交，定位特定 目的基因的位置，需要Southern 杂交；构建限制酶图谱也可利用杂交。 总之，核酸杂交的使用范围很广。 •因杂交是在目的 DNA 与放射标记探针之间进行，故在进行利用杂交的 分子克隆工作中经常需要制备各种核酸探针。 •核酸探针根据核酸的性质可分为DNA和RNA探针； •根据用放射性标记物标记与否，可分放射性核酸探针和非放射性核酸 探针； •根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；
核酸探针技术的原理和应用
核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。
本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。
一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。
该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。
2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。
常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。
标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。
3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。
常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。
这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。
二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。
以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。
通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。
2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。
例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。
3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。
通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。
4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 第二节 放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用
• 放射性核素（32P、3H、35S或125I）标记的核酸探针，已成为分
子生物学研究的重要工具。
• 它的利用，使得人们能够从分子水平上直接进行遗传物质的检 测（即基因的定位、定量和顺序分析）以及重组DNA中目的片 段的鉴定。这已成为同位素示踪技术的一项新的内容。 • 放射性核素探针与分子杂交技术相结合，可以用来鉴别重组子、 分离基因、分析DNA片段、研究基因表达。 • 本节主要介绍放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用，同 时介绍有关分子杂交的部分内容。
第九章 放射性核酸探针的制备及应用
•探针（probe）是指经放射性等物质标记的特定的DNA或RNA序列。 •利用探针通过核酸杂交可检测特定的基因或转录产物。
•在基因克隆、鉴定和分析的许多方面都涉及到利用探针进行析目的基因的转录和加工情况需要用标记探针与 RNA杂交，定位特定 目的基因的位置，需要Southern 杂交；构建限制酶图谱也可利用杂交。 总之，核酸杂交的使用范围很广。 •因杂交是在目的 DNA 与放射标记探针之间进行，故在进行利用杂交的 分子克隆工作中经常需要制备各种核酸探针。 •核酸探针根据核酸的性质可分为DNA和RNA探针； •根据用放射性标记物标记与否，可分放射性核酸探针和非放射性核酸 探针； •根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；
•根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。
第一节 放射性核酸探针的基本类型与制备方法
•一、双链DNA探针 • 1、切口平移法(Nick translation) • 2、随机引物合成法 •二、单链DNA探针 • 1、从M13载体衍生序列合成DNA探针 • 2、从RNA合成单链cDNA探针 •三、末端标记DNA探针 • 1、3，末端标记 • 2、5，末端标记 • (1) 前向反应(Forward reaction) • (2) 交换反应(Exchange reaction) •四、寡按苷酸探针 • 1、 T4多核苷酸激酶标记 • 2 、末端转移酶标记(Altar等，1989) • 3、 Klenow片段标记 •五、RNA探针
Southern blotting ： 1975 年 ， E. M. Southern利用毛细作 用 将 DNA 转 移 到 硝 酸纤维纸上，…….
•三、放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用 •（ 1 ）筛选载体 外源DNA 需要与某种工具重组，然后才能导入 宿主细胞中进行克隆和保存或表达外源 DNA中的遗传信息，这种 将外源DNA携带进入宿主细胞的工具称为载体。根据核酸序列的 同源性，利用放射性核酸探针与转化后宿主细胞中的质粒或噬菌 体进行杂交，可以筛选出重组的质粒或噬菌体。从而实现重组载 体的筛选。 •（ 2 ）检测基因表达 细胞核内的 DNA 片段通过转录形成 mRNA 并 释放到细胞质中。被检测基因在细胞中的转录情况可以进行如下 分析： •① Northern杂交 检查细胞中是否含有特定的mRNA，测定特定 mRNA在总RNA中的比例，由此获得目的mRNA的转录情况。 •② 斑点杂交 应特异性探针检测mRNA，并估计表达过程中mRN重组子，通常都采用杂交进行筛选，以便在较短的时间内获得阳 性克隆。用DNA片段作为探针进行杂交的溶液主要有：甲酰胺； 水溶液。这两种溶液都能得到良好的结果。
•（ 4 ）鉴定作物品种 由于不同品种的作物，其DNA 和mRNA 存在 着差异，因此用特定的核酸探针进行不同品种间的分子杂交，可 得到不同品种在遗传物质上的差异。
• 一、分子杂交的基本原理 • 互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对 而形成稳定的双链分子的过程称为杂交。 • 形成杂交分子的前提是核酸单链之间具有一定 的互补序列（即有某种同源性）。 • 分子杂交是通过印迹将核酸分子固定在固体支 持物上，然后用放射性标记或非放射性标记的 探针与被固定的分子杂交，经显影显示出目的 DNA或RNA分子所处位置。
• 二、Soபைடு நூலகம்thern杂交
Northern blotting ： 1977年，Alwine利用 毛 细 作 用 将 RNA 转 移到硝酸纤维纸上， …….
Western blotting： 1979 年， Towbin 利 用电场作用进行蛋 白质转移，…….
Middle
Eastern blotting ： 1982 年 ， Reinhart 利用电聚焦作用进 行蛋白质转移， …….