谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一
寄生虫谷胱甘肽转移酶的研究进展
中国兽医科学 2021,51(01): 113-118Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-12-04 D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0015 中图分类号：S852.7 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2021 )01-0113-06寄生虫谷胱甘肽转移酶的研究进展李爽，刘群*(中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室，北京100193)摘要：谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase,GST)是由多基因编码、具有多种功能的超基因家族 酶，是细胞内转运的“通用”栽体蛋白。
哺乳动物的GST可调控细胞增殖和死亡信号通路，具有参与运输、新陈 代谢和生理反应等的能力。
已有研究表明，多种寄生虫的GST参与虫体的生命活动。
综述了有关寄生虫GST 的研究进展，为后续相关研究提供思路。
关键词：寄生虫；谷胱甘肽转移酶（GST);功能；药物靶点Advances in the research of glutathione S-transferase in parasitesLI Shuang,LIU Qun*(National A nimal Protozoa Laboratory, College of Veterinary Medicine ,Chirm Agricultural University, Beijing 100193, C/iiraa)Abstract：Glutathione S-transferase (GST) is a supergene fami ly enzyme encoded by a supergene family which has multiple functions. They were thought to be 'all-purpose' carrier proteins involved in intracellular transport. Mammalian GST regulates cell proliferation and death signaling pathways and is involved in transportation,metabolism,and physiological responses. Previous studies have demonstrated that GST of various parasites plays an important role in diversified life activities of parasites. This review mainly describes the progress of research about GST on parasites and provides in- sights for the related research.Key words：parasite；glutathione S-transferase (GST) ；function；drug target* Corresponding author：LIU Qun,E-mail ：**************.cn谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase,GST)主要分为3个家族：胞质GST、线粒体G S T和微粒 体GST，其中胞质型G ST是其最大的家族。
遗传学研究中的抑制剂筛选和评价
遗传学研究中的抑制剂筛选和评价抑制剂是指一类能抑制生物体内特定酶或蛋白质活性的化合物，在药物研发和基因治疗等领域具有广泛的应用。
遗传学研究中，抑制剂的使用可以帮助科学家深入探索不同基因的作用机制。
这一篇文章将着重讨论如何从抑制剂中筛选出合适的化合物，并对其效果进行评价。
一、抑制剂筛选抑制剂的筛选一般涉及以下几个方面：1. 靶点的确定首先需要确定研究的靶点。
一般而言，基因组学研究中可以通过CRISPR/Cas9技术沉默不同的基因，然后观察其对细胞或生物体影响的变化来确定靶点。
抑制剂的使用可以进一步验证这些基因的作用机制。
2. 抑制剂库的构建确定了靶点后，接下来需要构建抑制剂库，即收集可能有抑制作用的化合物。
这个过程一般有两种方法，一是通过现有的文献数据或其他资源进行预测，二是进行高通量筛选，即在大量化合物中对其作用进行快速筛选，沉淀出具有潜力的抑制剂。
无论采用哪种方法，抑制剂库的建立对于后期的抑制剂评价具有非常重要的意义。
3. 抑制剂的筛选与鉴定将抑制剂添加到细胞或生物体中，通过测定抑制剂对靶点的作用程度，确定哪些抑制剂具有潜力。
鉴定合适的抑制剂可以使用多种方法，如荧光素酶法、荧光标记探针等。
二、抑制剂效果评价抑制剂的效果评价主要关注三个方面：1. 抑制剂的效力使用荧光素酶法、RNA测序等技术，来测试抑制剂的效力。
2. 抑制剂的选择性选择性指抑制剂对其他酶或蛋白质的干扰程度。
一般而言，选择性越高，抑制剂对靶点的效果就越显著。
3. 抑制剂的毒性除了考虑抑制剂对靶点的作用，还需要考虑其对整个细胞的影响。
抑制剂毒性的测定可以通过细胞存活率、细胞缺陷等多种方法来进行评估。
总之，在遗传学研究中，抑制剂的作用机制非常复杂。
只有在确定了靶点的基础上，对抑制剂进行快速筛选和评价，才能为研究提供更可靠的数据支撑。
随着技术的不断发展，人们在抑制剂筛选和评价方面也会有更多的进步。
人谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒说明书
人谷胱甘肽（GSH）酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽（GSH）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人谷胱甘肽（GSH）水平。
用纯化的人谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（GSH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人谷胱甘肽（GSH）的含量。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一
谷胱甘肽转移酶（GST）还原型谷胱甘肽占绝大多数。
谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。
GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。
GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。
通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。
研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。
因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。
与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。
近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。
抗肿瘤药物与GSH作用模式图：图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起，其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤；③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。
机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。
谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(DTNB法)说明书
谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(DTNB 法)产品简介：谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(DTNB 法) (Glutathione Reductase Assay Kit with DTNB)是一种简单易行的通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)活性的试剂盒。
谷胱甘肽还原酶在许多组织中都有分布，可以维持细胞内充足的还原型谷胱甘肽(GSH)水平。
GSH 可以清除自由基和一些有机过氧化物，或作为谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase)的底物来清除一些过氧化物。
谷胱甘肽还原酶可以还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH 可以和生色底物DTNB 反应产生黄色的TNB 和GSSG ，并可以通过测定A 412来检测TNB 的生成量。
适当设置应体系，前后两个反应合并起来后，GSSG/GSH 过量而GR 相对不足时，该反应体系中谷胱甘肽还原酶就成为整个反应体系的限速因素，此时黄色的TNB 生成量和谷胱甘肽还原酶的活性呈线性正相关。
从而通过测定A 412就可以计算出谷胱甘肽还原酶的活性水平。
本试剂盒的具体反应原理如下：两个反应相合并：本试剂盒检测肝脏样品的检测效果如图1所示。
图中可见，对于肝脏样品可以检测到比较强的谷胱甘肽还原酶的活性并且有很好的剂量效应。
图1. 谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(DTNB 法)用于肝脏裂解样品的实测效果图。
本试剂盒可以检测组织匀浆液上清、细胞裂解液上清等生物样品中的谷胱甘肽还原酶的活性。
一个试剂盒共可以进行100次检测。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线: 400-1683301或800-8283301 订货e-mail :****************** 技术咨询: ***************** 网址: 碧云天网站 微信公众号保存条件：-20ºC保存，一年有效。
天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展
天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展近年来，随着生物技术的不断发展，人们对于天然产物中的酶抑制剂的研究日益深入。
酶抑制剂是一类能够抑制酶活性的化合物，对于研究和开发新药物具有重要意义。
然而，由于天然产物复杂多样的特点，如何快速筛选出具有酶抑制活性的潜在候选化合物一直是一个挑战。
本文将对天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展进行探讨。
一、酶抑制剂的筛选方法在天然产物中筛选出具有酶抑制活性的化合物需要经过一系列的实验步骤。
目前，常用的筛选方法包括分离、纯化、鉴定和评价。
1. 分离和纯化：首先，需要从天然产物中分离出具有潜在酶抑制活性的化合物。
这可以通过常规的分离技术，如层析和萃取等来实现。
分离后，需要对所得化合物进行纯化，以获得高纯度的样品。
2. 鉴定：分离和纯化后的化合物需要经过结构鉴定，以确定其化学结构和组成。
这可以通过波谱学、色谱质谱等技术进行。
3. 评价：最后，需要对已知化合物进行酶抑制活性的评价。
目前常用的方法有体外酶活性测定、酶动力学研究等。
二、快速筛选方法的研究进展为了提高天然产物中酶抑制剂的筛选效率，科研人员不断探索和研究各种快速筛选方法。
以下是几种经典的研究进展：1. 高通量筛选技术：高通量筛选技术是一种能够在短时间内对大量样品进行酶抑制活性测试的方法。
其核心是建立自动化实验平台和高效的样品处理系统，以快速筛选出具有活性的化合物。
2. 转基因酵母筛选系统：转基因酵母筛选系统是一种利用酵母细胞作为基础的快速筛选方法。
通过在酵母细胞中表达目标酶蛋白，然后加入天然产物样品，观察酵母细胞生长或荧光表达等指标变化，以筛选出具有酶抑制活性的化合物。
3. 胶体金颗粒法：胶体金颗粒法是一种通过胶体金纳米颗粒的变色反应快速筛选出具有酶抑制活性的化合物的方法。
其原理是当酶抑制剂存在时，酶活性会发生变化，导致胶体金颗粒的颜色发生可见变化。
三、进一步发展与应用酶抑制剂在新药物研发、疾病治疗等领域具有广阔的应用前景。
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, γ-GT)试剂盒使用说明
γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT）试剂盒使用说明分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC1220规格：50管/48样产品内容：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃保存。
工作液（在试剂二瓶中配制）：临用前配制，把试剂三倒入试剂二瓶中，充分溶解（室温过低时可以40℃水浴促进溶解）；然后把试剂四倒入试剂二瓶中，混匀后室温保存。
产品说明：γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。
γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。
也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。
γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通过测定405nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性。
自备仪器和用品可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
二、γ-GT测定操作1.分光光度计预热30min，调节波长到405nm，蒸馏水调零。
2.试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min（保证无沉淀）。
素材：单克隆抗体制备的三次筛选--高二下学期生物人教版选择性必修3
单克隆抗体制备的三次筛选科学家们是如何做到运用特定的培养基将肉眼无法观察的细胞筛选出来的呢？在动物细胞工程的教学中，设计到非常重要的应用——单克隆抗体的制备过程，这个过程技术很成熟了，但这个技术背后的原理教材上只是做了非常简单的描述，这个过程真的有点复杂，主要是化学物质的名称有点拗口，很多同学甚至老师都不明白。
DNA合成的两条途径：核酸的合成有两条途径：一条是全合成途径，即从一些小分子物质先合成为嘌呤、嘧啶，最后合成代谢必需的核酸，氨基蝶呤（aminopterin，A）能够阻止DNA全合成途径。
另一条是应急途径，可直接利用外源核苷酸合成 DNA。
次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸苷激酶（TK）是应急途径中的两种重要酶。
HGPRT的作用是将次黄嘌呤、鸟嘌呤转变成次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸参与 DNA 合成。
TK 的作用是将胸腺嘧啶核苷转化为脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸（dTMP），再进一步合成 DNA。
HAT培养基筛选杂交瘤细胞是将融合的细胞放入 HAT选择培养基中，该培养基有三种关键成分：次黄嘌呤（hy-poxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。
氨基蝶呤可阻断骨髓瘤细胞利用全合成途径合成 DNA，使骨髓瘤细胞致死。
在这样的培养基上，细胞就只剩下一条应激途径可以合成DNA了。
B细胞和骨髓瘤细胞都只剩下这一条路径了，B细胞无法增殖——死亡，骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合的细胞怎么区分呢？第一次筛选——诱导应激路径有缺陷的骨髓瘤细胞通过突变诱导次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞，并经过毒性培养基筛选出的HGPRT-或 TK-骨髓瘤细胞。
具体方法是将诱导突变的骨髓瘤细胞放入含氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的鸟嘌呤类似物培养基上，含HGPRT-的骨髓瘤细胞会将氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤转变成相应的核苷酸形式参与 DNA 合成而发生毒性作用，使细胞致死。
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谷胱甘肽转移酶（GST）
还原型谷胱甘肽占绝大多数。
谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。
GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。
GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。
通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。
研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。
因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。
与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。
近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。
抗肿瘤药物与GSH作用模式图：
图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起，
其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤；
③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。
机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。
筛选方法：
方法一：比色法
在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。
实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。
实验材料：
试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。
仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。
实验步骤：
1.在384孔板中，分别加入3.5 mmol/L CDNB底物和酶液各10uL，待测样品孔中加入样品5uL，阳性对照孔中加入NaOCl 5uL，空白对照孔中加入PBS 5uL；
2.振荡混匀，30℃保温1 h；
3.然后，各孔加入3.5mmol/L GSH底物10uL，反应总体积35uL；
4.振荡混匀，于340 nm测定各孔吸收度(A1)；
5.30℃保温2 h，测定各孔吸收度(A2)。
实验步骤流程图：
3.5 mmol/L CDNB底物和酶液各10uL 振荡混匀
待测样品孔中加入样品5uL 各孔中加入 3.5mmol/L GSH底物10uL
阳性对照孔中加入NaOCl 5uL 30℃保温1 h
空白对照孔中加入PBS 5uL
振荡混匀 30℃保温2 h
于340 nm测定各孔吸收度(A1) 测定各孔吸收度(A2)
实验数据处理：
根据下式计算样品对GST的抑制率(％)：
抑制率(％)=[(空白对照A2-1A一样品A2-A1)／空白对照A2-A1]×100％
然后再以抑制率与样品剂量对数作图，可以得到一条S形曲线，得到待测样品的IC50。
IC50值越小，GST抑制剂效果越好。
实验结果:
NaOCl是强效GST抑制剂，反应2 h，NaOCl抑制GST的IC50为0.597 8 mmol/L。
通过以上实验步骤，我们可以对大量化合物进行初筛。
按上述方法确定的最佳条件，文献中对31 098个化合物进行筛选，初筛发现抑制率大于85％的样品185个，复筛活性较高、量效关系较好的样品有4个，其编号分别为W3437、W3438、DF00197及DF00200，IC50值分别为3.94、4.05、74.85及77.41 mg/L。
如下图：
（注：这张图是31098个化合物对于GST抑制活性的分布图，通过初筛，其中有185个化合物抑制率超过85%。
可以看出，随着抑制率数值的升高，达标的化合物越来越少。
）
实验优点：以CDNB和GSH为底物的比色法操作简便，对仪器要求简单，试剂成本低。
实验缺点：该方法灵敏度相对较低，有时为了达到信号在线性范围内，需要较大的酶量和底物浓度。