薄层快速分析多糖的单糖组成概要
多糖单糖组成和甲基化步骤
4、单糖组成分析样品的水解乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿所需试剂 TFA(三氟乙酸) 甲醇 NaBH4取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。
水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。
将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4,室温下还原3h，期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4，至溶液不再产生气泡为止。
PH应在4-5之间，加甲酸多次，减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。
次日，于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3-5ml醋酐和3ml吡啶，密塞，100℃下反应1h，冷却，加甲苯多次共蒸除去多余醋酐，真空干燥。
将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积（约0.1ml）后直接进行气相色谱分析。
GC（气相色谱）条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min；柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。
5、糖残基连接方式的确定所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH4 5.1甲基化将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。
分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中，加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解，然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。
取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0.6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。
然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。
再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。
流水透析至反应液颜色转为无色，冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。
高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖
高效薄层色谱法鉴别6种中药多糖杨成，管佳，章江生，李绍平*（澳门大学中华医药研究院，澳门）摘要：目的鉴别不同来源的中药多糖。
方法采用高效薄层色谱法分析多糖酸水解产物，同时应用2种显色剂以及薄层扫描技术，获得可区别中药多糖的特征图谱。
结果以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5: 5:4.5:1.5:1.5(v/v)为展开剂，7种标准单糖和2种糖醛酸为对照，使用苯胺-二苯胺为糖类成分显色剂，结合茚三酮显色剂检查氨基酸类成分，获得了多糖酸水解产物中两类成分的特征薄层色谱，可用于区分来自冬虫夏草、灵芝、黄芪、人参、西洋参和三七的6种多糖组分。
结论建立了一种可鉴别6种中药多糖的高效薄层色谱法，此法简单快速，经济实用，可以用于多糖类成分质量控制。
关键词：多糖，高效薄层色谱，质量控制，中药Discrimination of Polysaccharides from Six Traditional Chinese Medicines using High-performance Thin-layer ChromatographyYANG Cheng, GUAN Jia, ZHANG Jiang-sheng, LI Shao-ping* (Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao SAR, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To distinguish the polysaccharides from different Traditional Chinese medicines (TCMs). METHODS The acid hydrolyzates of polysaccharides were analyzed by high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) combined with two coloration methods and thin layer scanning technique. RESULTS The chromatography was performed on nano silica gel 60 plate with n-butanol -methanol-chloroform- acetic acid-water (12.5:5:4.5:1.5:1.5, v/v/v/v/v) as mobile phase. 7 monosaccharides and 2 glycuronic acids were used as reference compounds. The aniline-diphenylamine solution and ninhydrin solution were employed for detection of saccharides and amino acids, respectively. The polysaccharides from Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Astragalus memberanaceus, Panax ginseng, Panax quinquefolii and Panax notogiseng were easily discriminated based on their characteristic TLC profiles. CONCLUSION A simple, rapid and effective HPTLC method was developed for distinguishing the polysaccharides from 6 TCMs, which is helpful to control the quality of polysaccharides from Chinese medicine.KEY WORDS: Polysaccharides; HPTLC; Quality control; TCMs多糖是一类由单糖（通常大于10个）通过糖苷键连接而成的生物大分子聚合物，是生物体维持生命活动的必需物质。
多糖薄层色谱
多糖薄层色谱多糖薄层色谱，是一种常用的分离和分析多糖混合物的方法。
多糖是一类由多个单糖单元组成的生物大分子，包括淀粉、糖原、纤维素、果胶、唾液酸等等。
多糖的结构、含量和分布对于生物体的生长、发育、代谢等方面至关重要，因此多糖的研究备受关注。
下面将从多糖薄层色谱的基本原理、实验步骤以及应用领域三个方面进行介绍。
一、多糖薄层色谱的基本原理多糖薄层色谱是一种分离和分析多糖混合物的方法，其基本原理是根据多糖分子在一定条件下的化学性质和物理性质的差异进行分离和鉴定。
多糖的化学性质和物理性质包括大小、形状、电荷、水溶性、易降解性等方面，这些性质的不同使得多糖在分离柱上的滞留时间和移动距离不同，从而实现多糖混合物的分离和鉴定。
二、多糖薄层色谱的实验步骤1. 根据不同多糖的特点选取合适的分离柱和色谱条件，如氨基硅胶、正相色谱、离子交换色谱等；2. 将多糖混合物加入样品槽中，以恒定的流速将样品注入分离柱中；3. 调节移动相和固定相的比例和流速，通过分离柱，将多糖混合物分离开来，得到多个单糖峰；4. 通过色谱检测器检测不同单糖峰的吸收峰值，获取单糖的含量和结构信息。
三、多糖薄层色谱的应用领域多糖薄层色谱广泛应用于食品科学、生物医学、环境科学等领域。
在食品科学领域中，多糖薄层色谱可用于分离和鉴定不同来源的多糖混合物，如豆浆中的异黄酮糖苷和牛奶中的乳糖等。
在生物医学领域中，多糖薄层色谱可用于分离和纯化不同来源的多糖，如草药中提取的多糖和人体内分泌系统分泌的多糖等。
在环境科学领域中，多糖薄层色谱可用于分离和鉴定水环境中含有的多糖，如污水中的多糖和地表水中的藻类多糖等。
综上所述，多糖薄层色谱是一种常用的分离和分析多糖混合物的方法，其基本原理是根据多糖分子在一定条件下的化学性质和物理性质的差异进行分离和鉴定。
多糖薄层色谱广泛应用于食品科学、生物医学、环境科学等领域，有着广泛的研究和应用前景。
多糖的结构
多糖的结构一、多糖的概念多糖是由许多单糖分子通过糖苷键连接而成的大分子化合物。
它们是生物体内重要的能量来源，也是构成细胞壁、细胞膜和组织结构的重要成分。
多糖可以分为两类，即多糖和寡糖，其中多糖由许多单糖分子组成，而寡糖则由较少的单糖分子组成。
二、多糖的结构多糖的结构非常多样，可以是直链状、分枝状或环状。
这些结构的差异主要取决于单糖分子之间的连接方式和连接位置。
1. 直链状多糖直链状多糖是指单糖分子通过糖苷键直接连接在一起，形成一条直线。
这种结构通常具有较高的溶解度和可溶性，因为这种结构可以使水分子更容易与多糖分子相互作用。
直链状多糖在生物体内起着能量储存和结构支持的作用。
2. 分枝状多糖分枝状多糖是指单糖分子通过糖苷键连接成主链，同时还有其他单糖分子通过糖苷键连接在主链上，形成分支结构。
这种结构使得多糖的空间结构更加复杂，增加了多糖的稳定性和生物活性。
分枝状多糖在生物体内具有重要的生物功能，例如细胞识别、细胞黏附和信号传导等。
3. 环状多糖环状多糖是指单糖分子通过糖苷键形成一个或多个环状结构。
这种结构使得多糖分子更加紧密和稳定。
环状多糖在生物体内广泛存在，例如淀粉和纤维素等。
它们在植物细胞壁中起着结构支持的作用。
三、多糖的功能多糖在生物体内具有多种功能，包括能量储存、结构支持、细胞识别、细胞黏附和信号传导等。
1. 能量储存多糖是生物体内重要的能量来源。
例如，淀粉是植物细胞中的能量储存物质，动物体内的糖原也是通过多糖形式储存的能量。
2. 结构支持多糖可以构成细胞壁、细胞膜和组织结构的重要成分，起到支持和保护细胞的作用。
例如，纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，赋予植物细胞结构稳定性。
3. 细胞识别多糖具有特异的生物学活性，可以与细胞膜上的受体结合，以实现细胞间的相互识别。
这对于细胞的正常功能和生物体的正常发育至关重要。
4. 细胞黏附多糖可以通过与细胞表面的特定受体结合，促进细胞的黏附和聚集。
这对于细胞间的相互作用和组织形成至关重要。
糖类的提取分离与薄层层析分析
糖类的提取分离与薄层层析分析实验简介：薄层层析(thin layer chromatography,TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。
本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。
一、实验目的1、了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。
2、学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。
二、实验原理1、单糖及多糖的提取凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。
单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。
由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。
而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。
因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。
多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。
在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。
多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。
因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。
2、薄层层析薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。
糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。
在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。
硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。
多糖结构构象及生物活性概述
3·2 3·2·2部分酸水解
• 通过部分酸水解的方法将多糖水解成易于分 析的小片段。一般来说， 析的小片段。一般来说，吡喃型糖基比呋喃型糖 基稳定，己糖比戊糖稳定， 基稳定，己糖比戊糖稳定，1-6糖苷键对酸水解相 对稳定，主链的糖基比支链的糖基稳定。因此， 对稳定，主链的糖基比支链的糖基稳定。因此， 通过部分酸水解可以判断糖苷键的断裂次序， 通过部分酸水解可以判断糖苷键的断裂次序，推 断可能的糖苷键类型。 断可能的糖苷键类型。多糖可在温和条件下水解 或者在剧烈条件（高温、较高浓度酸）下水解。 或者在剧烈条件（高温、较高浓度酸）下水解。 在完全水解前，终止水解， 在完全水解前，终止水解，可得到不同的寡糖片 段和可能的多糖主链，然后综合采用单糖测定、 段和可能的多糖主链，然后综合采用单糖测定、 甲基化分析和核磁共振等方法可深入解析多糖结 构。
•
多糖结构的分析手段很多， 多糖结构的分析手段很多，不仅有仪器 分析法，如红外、核磁共振、质谱等， 分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有 化学方法，如部分酸水解、完全酸水解、 化学方法，如部分酸水解、完全酸水解、高 碘酸氧化、 降解、 碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以 降解 甲基化反应等， 及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、 及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫 学方法等（见表1） 学方法等（见表 ）
表1 多糖的结构分析方法
3·1 3·1 相对分子质量的测定
• 多糖的相对分子质量可以用量均相对分子质 Mw）、数均相对分子质量（Mn）、 ）、数均相对分子质量 ）、重均相 量（Mw）、数均相对分子质量（Mn）、重均相 对分子质量（Mw）和粘均相对分子质量（Mv） 对分子质量（Mw）和粘均相对分子质量（Mv） 表示。 表示。 目前测定多糖相对分子质量的方法主要有渗 透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、 透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、 超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法 HPGPC（高效凝胶渗透色谱法） 和HPGPC（高效凝胶渗透色谱法）等。HPGPC 测定多糖相对分子质量具有快速、 测定多糖相对分子质量具有快速、高分辨率和重 现性好等优点，在国内外得到广泛使用。 现性好等优点，在国内外得到广泛使用。
多糖的结构分析课件
第6章 多糖的结构分析
多糖结构测定的意义 从天然物质中分离得到的单体多
糖化合物即使具有很强的活性与具有较 大的安全性, 但如果结构不清楚, 则无法 进一步开展其药理学与毒理学研究, 也 就不可能进行人工合成或结构修饰改造 工作, 更谈不上进行高质量的新药开发 研究, 其学术及应用价值将会大大降低。
OH 2 OC2 H OHC2 H OH
以1→2位键合(1→2,6类似)
O H H
HO
0
H O H
C2 H OH
CH2O H
IO -4
O N aB H 4
O H+
CH 2OH
CH OO HCOOC H 2O HH O H 2C
OH 2O2CHOH
O
CH 2OH
以1→4位键合(1→4,6类似)
.
第6章 多糖的结构分析
3.甲基化（单糖残基的连接方式） 是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基
甲基化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖 产物，就可能推测组成多糖分子中单糖间连 接的位置（羟基所在的位置，即为原来单糖 残基的连接点）。 （氢化钠、碘甲烷） （1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于 100ml试剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入 1.5gNaH，渐渐加温，然后恒温在65-70℃46小时。最终颜色为墨绿色。整个过程通氮， 并搅拌。
多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似, 其与过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二 分子比例之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二 元醇相似, 其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。 对于非末端的（1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘酸盐 影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成 和剩余糖的比例, 就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
多糖单糖组成和甲基化步骤
4、单糖组成分析样品的水解乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿所需试剂 TFA（三氟乙酸）甲醇 NaBH4取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。
水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。
将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4，室温下还原3h,期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4，至溶液不再产生气泡为止。
PH应在4-5之间，加甲酸多次,减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。
次日,于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3—5ml醋酐和3ml吡啶,密塞，100℃下反应1h，冷却,加甲苯多次共蒸除去多余醋酐,真空干燥.将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积(约0.1ml)后直接进行气相色谱分析.GC（气相色谱)条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min;柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。
5、糖残基连接方式的确定所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH4 5.1甲基化将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。
分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中,加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解,然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。
取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0。
6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。
然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。
再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。
流水透析至反应液颜色转为无色,冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。
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干扰物质NaCl KCl Ca(NO 32葡萄糖麦芽糖果糖蔗糖酒石酸柠檬酸倍数200200200100100100100100100表 1 干扰物质的影响Table 1 Effect of foreign species 样品编号加入 (×10-5mol/L检出a (×10-5mol/L10.550.5420.760.7330.790.8240.970.98表 2 样品测定结果Table 2 Results of the determination of samples注:a 10次检测的平均值。
误差控制在±5%之内时。
因此,该电极应用于蔬菜和水果中抗坏血酸的测定将具有很好的选择性。
2.3.2样品测定为了验证该修饰电极能否在实际样品中抗坏血酸含量进行正确的测量,我们自制了几种样品。
自制样品组成为:1.0×10-4mol/L NaCl 、KCl 、Ca(NO 32、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、酒石酸及柠檬酸及0.5×10-5~1×10-5mol/L 抗坏血酸。
其测定结果如表2所示。
由表2可知,测定的抗坏血酸含量与已知含量基本一致。
3结论该新型的修饰电极具有极高的化学稳定性,且对溶液中的抗坏血酸具有良好的电催化作用,已成功地应用于水果中抗坏血酸含量的测定,获得了比较满意的结果,可望成为能满足不同需要的抗坏血酸传感器。
参考文献:[1] D W Martin Jr. Harper's Review of Biochemistry, 19th ed Eds: D W Martin Jr, PA Mayes, V W Rodwell. Lange, Los Altos, CA, 1983. 112.[2]胡慰望, 谢笔钧. 食品化学[M]. 北京: 科学出版社, 1992. 243.[3]黄伟坤, 等. 食品检验与分析[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1989.96.[4]A H Ensminger, M E Ensminger, J E Konlande, 等. 食品与营养百科全书[M]. 王淮洲, 王惟球, 王模善, 等译. 北京:农业出版社, 1989.收稿日期:2006-07-26 *通讯作者基金项目:四川省中医药管理局重点及专项项目(2003A001、2003C001作者简介:颜军(1971-,男,实验师,研究方向为生物活性成分的提取及检测。
TLC 快速分析多糖的单糖组成颜军,郭晓强,李晓光,邬晓勇,苟小军*(成都大学中药化学实验室,四川成都610106摘要:本文采用薄层色谱法分析多糖的单糖组成。
从斑点分离度、清晰度、有无拖尾现象及展层时间等方面综合评价展层效果。
通过实验确定了适合的展开剂为展开系统(乙酸乙脂:吡啶:无水乙醇:水=8:1:1:2、合适的显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂。
通过此体系确定了单糖的Rf 值,可用于快速分析水解多糖的单糖组分。
关键词:多糖;单糖组成;薄层色谱TLC to Fleetly Analyze Monosaccharide Composition of PolysaccharideYAN Jun ,GUO Xiao-qiang ,LI Xiao-guang ,WU Xiao-yong ,GOU Xiao-jun*(Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, ChinaAbstract :Applying TLC to analyze monosaccharide composition of polysaccharides was stuided. A mixed solution composed of ethylacetate, pyridine, alcohol and water in a ratio of V C 4H 8O 2:V C 5H 5N :V C 2H 6O :V H 2O = 8:1:1:2 by volume is used as extending system.A solution containing aniline and diphenylamine dissolved in acetone is used as coloration system. Satisfactory separation isacquired as shown by the thin layer chromatogram. Qualitative results can be obtained in accordance with the R f value of the standard spots. Distinct figures indicating the monosaccharide composition of polysaccharides obtained by the modified TLC.The extending system and coloration system can be used in monosaccharide composition analysis.Key words:polysaccharide;monosaccharide composition;thin-layer chromatography ( TLC中图分类号:TS207.3 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(200612-0603-05多糖作为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合物,是构成生命的四大基本物质之一。
随着人们对多糖组成、性质、结构与功能研究的不断深入。
对多糖的生物活性也有了更多的认识,能提高机体免疫力,增强机体耐缺氧能力,清除自由基,抑制肿瘤,可用于治疗高血压、高血脂、糖尿病、乙型肝炎等多种现代医学中的疑难病症[1~3]。
多糖的研究受到了越来越广泛的重视。
并取得了丰硕的成果,已有香菇多糖、灵芝多糖等应用于临床。
国内外研究表明,多糖的活性与许多因素有关,如分子量、溶解性等,特别是与其空间结构密切相关[4,5]。
由于一级结构是空间结构的基础,而多糖的单糖组成是一级结构的主要内容,所以有必要找到一种简便、灵敏的方法以确定多糖的单糖组成。
单糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相色谱法(HPLC、气相色谱法(GC、薄层色谱法(TLC等[6]。
采用G C测定糖类,遇到的主要困难是糖本身没有足够的挥发性,所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。
另外,由于糖的异构化,在某些衍生物的制备过程中,会产生衍生物的异构体,使色谱分析时每种糖产生几个峰,这往往影响组分的分离和定量。
H P L C有分离速度快、分辨率高、分离效果好、重现性好、不破坏样品的优点。
但糖类本身没有紫外吸收,只能采用示差折光检测器(RI或蒸发光散射检测器(ELSD检测。
RI分辨率低而ELSD虽然效果好但目前价格昂贵。
另外,采用H P L C分析时,色谱柱的选择也比较困难。
一般采用氨基柱但分离效果欠佳,而专用的糖柱又十分昂贵。
为了找到一种常规实验室即可快速分析单糖组成的方法,我们摸索了薄层色谱法(T L C。
该方法是一种微量而快速的分析方法。
它兼备了柱层析和纸层析两者的优点并且操作方便,设备简单,容易掌握、便宜、灵活的特点。
本文采用T L C 对水解多糖的单糖组成进行分析,确定了适用于单糖分析的展开系统、显色系统及R f值。
1材料与方法1.1药品与材料银耳多糖本实验室自制;D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖上海试剂二厂;盐酸、乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、正丁醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、醋酸、磷酸、硫酸、苯胺、二苯胺皆为分析纯试剂;实验用水为蒸馏水。
微量定量点样毛细管美国科尔帕默公司;20cm×20cm硅胶层析板德国默克公司。
1.2单糖和混合单糖标准溶液的配置分别称取果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖,分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液。
浓度均为1.00mg/ml。
分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖,共溶于2ml蒸馏水制得混合单糖标准液。
各单糖在混合单糖标准液中的浓度为0.50mg/ml。
1.3水解多糖样品的制备称取20mg多糖,溶解在5ml重蒸水中,加入12mol/L 的HCl 0.25ml,置于高压釜中在120~126℃条件下水解4h。
中和、透析后稀释至10m l。
1.4展开系统配置展开系统1:分别把乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、水按8:1:1:2(体积比的比例混合摇匀。
展开系统2:分别把正丁醇、丙酮、水按4:3:1(体积比的比例混合摇匀。
展开系统3:分别把正丁醇、乙酸乙脂、异丙醇、醋酸、水、吡啶按35:100:60:35:30:30(体积比的比例混合摇匀。
1.5显色剂的配置显色剂1(苯胺-二苯胺-磷酸显色剂:2%二苯胺丙酮溶液:2%苯胺丙酮溶液:85%磷酸按5:5:1的比例混合摇匀。
显色剂2:把10ml硫酸缓慢倒入90ml水中混合冷却,制得10%的硫酸溶液装瓶待用。
1.6操作步骤1.6.1点样将水解多糖、已知单糖标准液和混合单糖标准液,7种样品按一定顺序分别点样在薄层板上。
点样量约10μl,分次滴加,使点样扩散后其直径不超过2mm。
点样过程中用吹风机使样品干燥。
1.6.2展层将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中,用配置的展开剂,采用倾斜上行法,将薄层板的下端浸在展开剂中0.3~0.5cm ,至展开剂距离薄层板的上端约1cm 左右时取出自然风干。
1.6.3显色在除去溶剂后的薄层板上,均匀喷上显色剂,烘箱中加热显色。
2结果与分析2.1展开剂的比较2.1.1展开系统1用展开系统1按1.6对样品(1.混合单糖;2.果糖;3.半乳糖;4.葡萄糖;5.木糖;6.鼠李糖;7.水解多糖进行T L C 分析,展层效果见图1。
图1 展开系统1的展层效果图Fig.1 The result presented by using No.1 extending system1234567由图1可得,在展开系统1中混合单糖中各单糖完全分离,各单糖斑点集中无拖尾现象;水解多糖中呈现半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖斑点。
由所得的T L C ,计算展开系统1中各单糖斑点的R f 值,结果见表1。
编号2果糖3半乳糖4葡萄糖5木糖6鼠李糖R f =0.398R f =0.305R f =0.374R f =0.563R f =0.7421混合单糖+++++7多糖++++表1 展开系统1中检出单糖组分表Table 1 The monosaccharide composition analyzed by usingNo.1 extending system注:“+”表示存在(下同。