微生物检测技术--金黄色葡萄球菌检测【内容丰富】
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
ISO 6888 食品和动物饲料的微生物学金黄色葡萄球菌检验
ISO 6888-1:1999食品和动物饲料的微生物学血清凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他球菌）序ISO是国际标准的全球性组织。
准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。
每一个团体成员负责各自的学科。
与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。
ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。
国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。
起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。
发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。
国际性标准ISO 6888-1 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。
ISO 6888-1的第一个版本，以及ISO 6888-2，取代ISO 6888：1983，做了计数上的修改。
ISO 6888由以下部分组成，一般标题为食品与动物饲料微生物学——一般方法计数血浆凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其它种类）：——第一部分：方法使用BP琼脂培养基；——第二部分：方法使用兔血浆纤维蛋白琼脂培养基。
0. 绪论0.1 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。
在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。
否则，要尽可能地完全遵循本标准。
当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。
同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。
希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。
0.2 ISO 6888描述了两种平行的方法（第一部分和第二部分）来检测血浆凝固酶阳性葡萄球菌，其中以证明该菌产生肠毒素。
其中较大可能是金黄色葡萄球菌，也有可能是中间链球菌或猪葡萄球菌。
0.3 ISO 6888本部分的目的在于，葡萄球菌的证实基于血浆凝固酶的阳性反应，但也有研究证明一些受损的金黄色葡萄球菌会出现血浆凝固酶弱阳性。
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析【摘要】金黄色葡萄球菌是导致多种感染的重要病原体，对其进行准确快速的检验至关重要。
本文首先介绍了金黄色葡萄球菌检验技术的原理，包括典型菌株鉴定和培养特点；其次详细描述了金黄色葡萄球菌检验方法，包括传统和分子生物学技术；接着分析了检验结果的意义和如何应对不同结果；最后探讨了金黄色葡萄球菌检验技术的优势和在临床应用中的意义。
在文章讨论了金黄色葡萄球菌检验技术的发展前景以及其局限性和未来发展方向。
通过本文的介绍和分析，读者将更全面地了解金黄色葡萄球菌检验技术，有助于提高对该病原体的检测与管理水平，促进临床诊疗水平的提升。
【关键词】金黄色葡萄球菌、检验技术、原理、方法、结果分析、优势、临床应用、发展前景、局限性、未来发展方向1. 引言1.1 背景介绍金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可导致多种感染性疾病，如皮肤感染、败血症等。
因其对抗生素的抗性逐渐增加，使得对其进行有效检验和监测显得尤为重要。
金黄色葡萄球菌检验技术是一种能够快速准确检测金黄色葡萄球菌的方法，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
背景介绍的部分主要从以下几个方面展开：介绍金黄色葡萄球菌的基本特征，包括其形态特征、生长条件等；说明金黄色葡萄球菌对人体的危害和致病机制，引出对其进行检验的必要性；介绍目前金黄色葡萄球菌感染的流行状况和抗生素抗性情况，指出对其进行检验的紧迫性；简要介绍当前金黄色葡萄球菌检验技术的发展现状和存在的问题，为后续正文内容做铺垫。
通过背景介绍，读者可以对金黄色葡萄球菌检验技术的研究和应用有一个初步的了解，为后续内容的阐述提供了必要的背景信息。
1.2 研究意义金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，在医疗卫生领域中具有重要的病原检测价值。
对于金黄色葡萄球菌的检测技术的研究意义主要可以从以下几个方面来看：1. 临床诊断：金黄色葡萄球菌是导致各种感染的主要细菌之一，如皮肤感染、呼吸道感染等。
准确检测金黄色葡萄球菌的存在可以帮助医生及时诊断并采取相应的治疗措施，有助于提高治疗效果和减少治疗成本。
食品中微生物的检测-金黄色葡萄球菌检验
免疫学方法
抗原制备
从金黄色葡萄球菌中提取特异性抗原，制备 成免疫原。
抗体制备
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过凝集 反应、沉淀反应等方法检测样品中的金黄色
葡萄球菌。
抗原抗体反应
将免疫原注射到动物体内，刺激机体产生特 异性抗体。
结果判定
根据反应结果判断样品中是否含有金黄色葡 萄球菌。
分子生物学方法
食品中微生物的检测-金黄 色葡萄球菌检验
目录
• 引言 • 金黄色葡萄球菌概述 • 样品采集与处理 • 微生物学检测方法 • 理化检测方法 • 结果分析与报告 • 质量控制与实验室安全
01
引言
目的和背景
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是一种常见的食品污染源，可引起食物中毒，对公众健康构成威胁。因此，检测食品中的金黄 色葡萄球菌对于保障食品安全具有重要意义。
适量性
根据检测方法和目的，采 集适量样品，以满足检测 需求。
样品保存与运
低温保存
样品应尽快放入低温环境 （如4℃冰箱）中保存，以 减缓微生物的生长速度。
避免反复冻融
尽量避免样品在保存过程 中反复冻融，以免影响微 生物的存活和检测结果的 准确性。
快速运输
样品在运输过程中应保持 低温，并尽快送达实验室 进行检测。
04
微生物学检测方法
传统培养法
增菌培养
将液体样品接种到选择性增菌液 中，于适宜温度下培养一定时间 ，使金黄色葡萄球菌得以增殖。
鉴定
通过观察菌落形态、革兰氏染色 、血浆凝固酶试验等生化特征进 行鉴定。
01
02
样品处理
取适量食品样品，进行均质化处 理，得到均匀一致的液体样品。
03
04
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
实验十二金黄色葡萄球菌
致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。
精品课件
5
金葡菌镜下特征
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6
操作流程
检样25g(mL) +稀释液225mL，均质
7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
36℃±1 ℃， 18h~24h
Baird-Parker平板，血平板
36℃±1 ℃
B-P平板18h~24h或45h~48h 血平板 18h~24h
涂片染色
观察溶血
BHI肉汤和营养琼脂斜面 血浆凝固酶试验
结果报告
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7
菌落特征
Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色， 周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径 2mm~3mm。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典 型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干 燥。
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23
取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中， 再加入 BHI培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇 匀，置 36 ±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时 观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管 倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原 体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆 凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培 养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明 书操作，进行血浆凝固酶试验。
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3
生化特性
典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病 性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长， 常呈双球菌或短链状排列。
本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰 氏染色阳性。
金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为 5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制 杂菌。
GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
中华人民共和国国家标准G B4789.10 2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.10 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验“㊁S N/T0172 2010‘进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法“㊁S N/T2154 2008‘进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术“㊂本标准与G B4789.10 2010相比,主要变化如下:试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤㊂食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:36ħ~56ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊂2.5均质器㊂2.6振荡器㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌锥形瓶:容量100m L㊁500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10涂布棒㊂2.11p H计或p H比色管或精密p H试纸㊂3培养基和试剂3.17.5%氯化钠肉汤:见A.1㊂3.2血琼脂平板:见A.2㊂3.3 B a i r d-P a r k e r琼脂平板:见A.3㊂3.4脑心浸出液肉汤(B H I):见A.4㊂3.5兔血浆:见A.5㊂3.6稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6㊂3.7营养琼脂小斜面:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9无菌生理盐水:见A.9㊂第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1㊂图1金黄色葡萄球菌检验程序5操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或放入盛有225m L7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~ 2m i n㊂若样品为液态,吸取25m L样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀㊂5.2增菌将上述样品匀液于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长㊂5.3分离将增菌后的培养物,分别划线接种到B a i r d-P a r k e r平板和血平板,血平板36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂5.4初步鉴定金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂在血平板上,形成菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验㊂5.5确证鉴定5.5.1染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm㊂5.5.2血浆凝固酶试验:挑取B a i r d-P a r k e r平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5m LB H I和营养琼脂小斜面,36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂取新鲜配制兔血浆0.5m L,放入小试管中,再加入B H I培养物0.2m L~0.3m L,振荡摇匀,置36ħʃ1ħ温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果㊂同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照㊂也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验㊂结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5m LB H I,36ħʃ1ħ培养18h~48h,重复试验㊂5.6葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素㊂6结果与报告6.1结果判定:符合5.4㊁5.5,可判定为金黄色葡萄球菌㊂6.2结果报告:在25g(m L)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌㊂第二法金黄色葡萄球菌平板计数法7检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2㊂图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序8操作步骤8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有225m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25m L样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.3用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂8.1.4按8.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头㊂8.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1m L样品匀液以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L接种量分别加入三块B a i r d-P a r k e r平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如B a i r d-P a r k e r平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂8.3培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂8.4典型菌落计数和确认8.4.1金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂8.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20C F U~ 200C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂8.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验㊂分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板36ħʃ1ħ培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂9结果计算9.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20C F U~200C F U之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.2 若最低稀释度平板的典型菌落数小于20C F U ,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.4 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20C F U~200C F U 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.5 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20C F U~200C F U 之间,按式(2)计算㊂9.6 计算公式式(1):T =A BC d(1)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d 稀释因子㊂式(2):T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 1第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A 2第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂10 报告根据9中公式计算结果,报告每g (m L )样品中金黄色葡萄球菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 金黄色葡萄球菌M P N 计数11 检验程序金黄色葡萄球菌M P N 计数检验程序见图3㊂图3金黄色葡萄球菌M P N法检验程序12操作步骤12.1样品的稀释按8.1进行㊂12.2接种和培养12.2.1根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1m L样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1m L,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36ħʃ1ħ培养,18h~24h㊂12.2.2用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养,24h~48h㊂12.3典型菌落确认按8.4.1㊁8.4.3进行㊂13结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录C),报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装,每瓶225m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2血琼脂平板A.2.1成分豆粉琼脂(p H7.5ʃ0.2)100m L脱纤维羊血(或兔血)5m L~10m LA.2.2制法加热溶化琼脂,冷却至50ħ,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板㊂A.3B a i r d-P a r k e r琼脂平板A.3.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂(L i C l㊃6H2O)5.0g琼脂20.0g蒸馏水950m LA.3.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50m L与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10m L混合,保存于冰箱内㊂A.3.3制法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节p H至7.0ʃ0.2㊂分装每瓶95m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂临用时加热溶化琼脂,冷至50ħ,每95m L加入预热至50ħ的卵黄亚碲酸钾增菌剂5m L摇匀后倾注平板㊂培养基应是致密不透明的㊂使用前在冰箱储存不得超过48h㊂A.4脑心浸出液肉汤(B H I)A.4.1成分胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(12H2O)2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500m LA.4.2制法加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装16mmˑ160mm试管,每管5m L置121ħ,15m i n灭菌㊂A.5兔血浆取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100m L,溶解后过滤,装瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂兔血浆制备:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血4份,混好静置(或以3000r/m i n离心30m i n),使血液细胞下降,即可得血浆㊂A.6磷酸盐缓冲液A.6.1成分磷酸二氢钾(K H2P O4)34.0g蒸馏水500m LA.6.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500m L蒸馏水中,用大约175m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.2,用蒸馏水稀释至1000m L后贮存于冰箱㊂稀释液:取贮存液1.25m L,用蒸馏水稀释至1000m L,分装于适宜容器中,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7营养琼脂小斜面A.7.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LA.7.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L调节p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13mmˑ130mm试管,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.8.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.8.4染色法a)涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n,水洗㊂b)滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂c)滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂d)滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.9无菌生理盐水A.9.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000m LA.9.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000m L蒸馏水中,121ħ高压灭菌15m i n㊂附录B葡萄球菌肠毒素检验B.1试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合G B/T6682对一级水的规定㊂B.1.1 A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒㊂B.1.2p H试纸,范围在3.5~8.0,精度0.1㊂B.1.30.25m o l/L㊁p H8.0的T r i s缓冲液:将121.1g的T r i s溶解到800m L的去离子水中,待温度冷至室温后,加42m L浓H C L,调p H至8.0㊂B.1.4p H7.4的磷酸盐缓冲液:称取N a H2P O4㊃H2O0.55g(或N a H2P O4㊃2H2O0.62g)㊁N a2H P O4㊃2H2O2.85g(或N a2H P O4㊃12H2O5.73g)㊁N a C l8.7g溶于1000m L蒸馏水中,充分混匀即可㊂B.1.5庚烷㊂B.1.610%次氯酸钠溶液㊂B.1.7肠毒素产毒培养基B.1.7.1成分蛋白胨20.0g胰消化酪蛋白200m g(氨基酸)氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢钾1.0g氯化钙0.1g硫酸镁0.2g菸酸0.01g蒸馏水1000m Lp H7.3ʃ0.2B.1.7.2制法将所有成分混于水中,溶解后调节p H,121ħ高压灭菌30m i n㊂B.1.8营养琼脂B.1.8.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LB.1.8.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L校正p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化㊂分装烧瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂B.2仪器和设备B.2.1电子天平:感量0.01g㊂B.2.2均质器㊂B.2.3离心机:转速3000g~5000g㊂B.2.4离心管:50m L㊂B.2.5滤器:滤膜孔径0.2μm㊂B.2.6微量加样器:20μL~200μL㊁200μL~1000μL㊂B.2.7微量多通道加样器:50μL~300μL㊂B.2.8自动洗板机(可选择使用)㊂B.2.9酶标仪:波长450n m㊂B.3原理本方法可用A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成㊂本方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(E L I S A)㊂96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A㊁B㊁C㊁D㊁E 型葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控,包被了非免疫动物的抗体㊂样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450n m波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比㊂B.4检测步骤B.4.1从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mmˑ180mm)36ħ培养24h,用5m L生理盐水洗下菌落,倾入60m L产毒培养基中,36ħ振荡培养48h,振速为100次/m i n,吸出菌液离心,8000r/m i n 20m i n,加热100ħ,10m i n,取上清液,取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法B.4.2.1牛奶和奶粉将25g奶粉溶解到125m L㊁0.25M㊁p H8.0的T r i s缓冲液中,混匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备㊂将牛奶于15ħ,3500g离心10m i n㊂将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶㊂用蒸馏水对其进行稀释(1ʒ20)㊂取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2.2脂肪含量不超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂必要时,移去上面脂肪层㊂取上清液进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.3脂肪含量超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂吸取5m L上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入5m L的庚烷,充分混匀5m i n㊂于15ħ,3500g离心5m i n㊂将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷㊂将下部水相层进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.4其他食品可酌情参考上述食品处理方法㊂B.4.3检测B.4.3.1所有操作均应在室温(20ħ~25ħ)下进行,A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用㊂测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头,用过的吸头以及废液处理前要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜㊂B.4.3.2将所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)㊂将样品液加入微孔条的A~G 孔,每孔100μL㊂H孔加100μL的阳性对照,用手轻拍微孔板充分混匀,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,置室温下孵育1h㊂B.4.3.3将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体㊂每孔用多通道加样器注入250μL的洗液,再倾倒掉并在吸水纸上拍干㊂重复以上洗板操作4次㊂本步骤也可由自动洗板机完成㊂B.4.3.4每孔加入100μL的酶标抗体,用手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育1h㊂B.4.3.5重复B.4.3.3的洗板程序㊂B.4.3.6加50μL的TM B底物和50μL的发色剂至每个微孔中,轻拍混匀,室温黑暗避光处孵育30m i n㊂B.4.3.7加入100μL的2m o l/L硫酸终止液,轻拍混匀,30m i n内用酶标仪在450n m波长条件下测量每个微孔溶液的O D值㊂B.4.4结果的计算和表述B.4.4.1质量控制测试结果阳性质控的O D值要大于0.5,阴性质控的O D值要小于0.3,如果不能同时满足以上要求,测试的结果不被认可㊂对阳性结果要排除内源性过氧化物酶的干扰㊂B.4.4.2临界值的计算每一个微孔条的F孔和G孔为阴性质控,两个阴性质控O D值的平均值加上0.15为临界值㊂示例:阴性质控1=0.08阴性质控2=0.10平均值=0.09临界值=0.09+0.15=0.24B.4.4.3结果表述O D值小于临界值的样品孔判为阴性,表述为样品中未检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素;O D值大于或等于临界值的样品孔判为阳性,表述为样品中检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素㊂B.5生物安全因样品中不排除有其他潜在的传染性物质存在,所以要严格按照G B19489‘实验室生物安全通用要求“对废弃物进行处理㊂附录C金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表每g(m L)检样中金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)的检索见表C.1㊂表C.1金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表阳性管数0.100.010.001M P N 95%置信区间下限上限000<3.0 9.5 0013.00.159.6 0103.00.1511 0116.11.218 0206.21.218 0309.43.638 1003.60.1718 1017.21.318 102113.638 1107.41.320 111113.638 120113.642 121154.542 130164.542 2009.21.438 201143.642 202204.542 210153.742 211204.542 212278.794阳性管数0.100.010.001M P N95%置信区间下限上限220214.542 221288.794 222358.794 230298.794 231368.794 300234.694 301388.7110 3026417180 310439180 3117517200 31212037420 31316040420 3209318420 32115037420 32221040430 323290901000 330240421000 331460902000 33211001804100 333>1100420注1:本表采用3个稀释度[0.1g(m L)㊁0.01g(m L)和0.001g(m L)]㊁每个稀释度接种3管㊂注2:表内所列检样量如改用1g(m L)㊁0.1g(m L)和0.01g(m L)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (m L)㊁0.001g(m L)㊁0.0001g(m L)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推㊂。
PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌
实验结果
实验中分别对含金黄色葡萄球菌的乳品样本和不含该菌的样本进行了PCR检 测。结果显示，含有金黄色葡萄球菌的样本在凝胶电泳中出现了明显的目标条带， 而不含该菌的样本则没有目标条带。这表明该PCR方法可以准确检测乳品中的金 黄色葡萄球菌。
实验评估
实验灵敏度
通过对比不同浓度的金黄色葡萄球菌悬液进行PCR检测，发现该方法可以检 测到低至10 CFU/mL的金黄色葡萄球菌。因此，该PCR方法具有较高的灵敏度。
文献综述：
金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界和人类环境中，肉类及肉制品是其主要污 染源之一。近年来，由于抗生素滥用和耐药性的增加，金黄色葡萄球菌引起的食 物中毒事件时有发生。因此，建立一种准确、快速的检测方法对于预防和控制金 黄色葡萄球菌的传播具有重要意义。
研究方法：
本研究采用PCR技术，设计特异性引物和探针，对肉及肉制品中的金黄色葡 萄球菌进行检测。同时，采用优化后的采样和洗涤方法，以提高检测的灵敏度和 准确度。具体实验步骤包括样品处理、DNA提取、PCR扩增和产物检测。
参考内容
摘要：
本研究旨在建立一种高效、特异的PCR方法，用于检测肉及肉制品中的金黄 色葡萄球菌。通过优化采样和洗涤方法，提高了检测的灵敏度和准确度。结果表 明，该方法具有较高的实用性和推广价值，对于保障食品安全具有重要意义。
引言：
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，可引起食物中毒、烫伤样皮肤 综合征、毒性休克综合征等多种疾病。在肉类及肉制品中，金黄色葡萄球菌的污 染较为普遍，因此建立一种快速、准确的检测方法对于保障食品安全至关重要。 本研究采用PCR技术，针对金黄色葡萄球菌的特异性基因片段进行扩增，以提高 检测的灵敏度和准确度。
PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌
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用于筛选菌种。
参考内容
6
在普通营养琼脂平板上培养18～24ｈ，可形成圆形、表面 光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性， 不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。
参考内容
参考内容
18
4、GB 4789.10—2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
1 范围
本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法。
本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌 的定性检验；
第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄 球菌的计数；
7
血平板：可形成完全透明溶血环（溶血）
溶血：红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，
简称溶血。
溶血素是细菌分泌的一种参考毒内容性因子
8
细菌的溶血现象
根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现 象：
α溶血:产生溶血素，不完全性溶血，在血琼脂平皿上菌落 周围有1～2mm，较窄半透明的草绿色溶血环。
β溶血: 呈完全性溶血，在血平皿上菌落周围有2～4mm宽、 界限分明、无色透明的溶血环。
γ溶血:不产生溶血素，在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血 环。
参考内容
9
可产生卵磷脂酶，在卵黄高盐培养基上形 成周围有白色沉淀环的菌落。
参考内容
10
1.3 生化反应
大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗 糖，产酸不产气。
蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水
10.0 g 5.0 g 75 g 1 000 mL
参考内容
21
检测步骤---增菌
或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤（污染严重时）
胰酪胨（或胰蛋白胨）
17.0 g
植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g
氯化钠
100.0 g
磷酸氢二钾
2.5 g
丙酮酸钠
10.0 g
葡萄糖
流行病学
在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动 物的排泄物中都可找到。
作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和 动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的 皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受 其污染的机会很多。
参考内容
16
金黄色葡萄球菌的流行病学
一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品 食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染 食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了 肠毒素，引起食物中毒； 熟食制品包装不严，运输过程受到污染； 奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污 染。
第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食 品中金黄色葡萄球菌的计数。
参考内容
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检验前准备工作 采集与送检 预处理
菌落总数
大肠菌群
致病菌
前增菌 分离培养
纯化 多项鉴定及检测实验
分析、报告
参考内容食品微生物检验的一般程20 序
检测步骤---增菌
利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受 15%的氯化钠），用含7.5%氯化钠肉汤
食品的微生物学检验 致病菌
参考内容
1
主要内容
金黄色葡萄球菌（GB4789.10-2010） 大肠杆菌（GB 4789.38-2012） 沙门氏菌（GB 4789.4—2010） 副溶血性弧菌（GB 4789.7—2013 ）
参考内容
2
金黄色葡萄球菌检验 p153
1、生物学特性 （重点） 2、致病性 3、流行病学 4、国标检验方法 （重点） 5、快速检测方法
分解甘露醇，产酸。
参考内容
11
2、致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，为条件 致病菌。可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。
参考内容
12
葡萄球菌皮肤感染
参考内容
13
菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：
a.溶血素：外毒素，分α、β、γ多种，能损伤血小板，破坏溶酶体，
蒸馏水
1 000 mL
参考内容
22
检测步骤 ---分离
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在 血平板上产生明显的溶血环。
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大 而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
参考内容
23
血平板
参考内容
24
检测步骤 ---分离
Baird－Parker琼脂平板(BP平板)
参考内容
17
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球 菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。
++++金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题， 在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个 细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国 每年发生的此类中毒事件也非常多。
参考内容
3
1、生物学特性
1.1形态与染色
金黄色葡萄球菌无芽孢，无鞭毛， 大多数无荚膜
革兰氏染色阳性；
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直 径0.8μm左右，显微镜下排列成葡 萄串状。
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1.2 培养特征
易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。 需氧或兼性厌氧，在好氧条件下生长最好； 大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度30-37℃）
e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性
肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。
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2、致病性
++++当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品， 如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10 小时即可相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受100度煮沸 30min而不被破坏。人摄食该污染产品后2-3h便可出现中 毒症状。其引起的食物中毒典型症状为呕吐和腹泻。
引起肌体局部缺血和坏死；
b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；
c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆
中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄 球菌形成的感染易局部化与此酶有关；
d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐
受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；
胰蛋白胨