金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
金黄色葡萄球菌的速测技术—试剂盒法
金黄色葡萄球菌的速测技术—试剂盒法金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，隶属于葡萄球菌属(Staph-ylococcus aureus )，是引起食源性疾病的主要致病因子。
金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，大多数食品及食品原料，如肉、乳、蛋制品，糖果，糕点等，均要求对金黄色葡萄球菌举行检测，我国明确规定食品中金黄色葡萄球菌不得检出。
免疫学办法是金黄色葡萄球菌的传统检测法，因其时光冗长、操作烦琐易导致食品积压，且常浮现假阳性或假阴性的结果。
依照传统的金黄色葡萄球菌检验办法(GB/T4789.10-2008)，从取样至鉴定结果最快需要4d。
利用病原微生物中特异性酶而进展起来的挑选性显色培养基技术，特异性强、敏感性好，已得到广泛的认可和应用。
DNA酶和凝固酶是重要的标志酶，目前国内外已有多种显色培养基或测试片产品。
开发敏捷、迅速、简易的检测办法对食品平安检测技术的进展有很大推进作用。
目前通常采纳的办法有反向胶乳凝聚实验(RPLA),酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等。
1．速测原理本试剂盒将病原体RNA逆转录、DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测四种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对金黄色葡萄球菌特异性引物和一对特异性探针，一次性完成金黄色葡萄球菌RNA的逆转录、DNA扩增及杂交过程，然后用防污染核酸迅速检测装置对金黄色葡萄球菌感染举行定性诊断。
2．速测范围本试剂盒用于食品中的金黄色葡萄球菌恒温扩增迅速检测。
检测敏捷度可达到＜5个病原体/mL。
3．试剂盒组成 (1)试剂盒A(-20℃保存)：恒温扩增反应液(14uL/管)，20管；阳性对比品(40uL/管)，1管(红色瓶盖)；阴性对比品(40uL/管)，1管(白色瓶盖)。
(2)试剂盒B(室温干燥保存)：防污染核酸迅速检测装置(3号装置)，20份。
(3)RNA提取试剂盒(室温干燥保存)：RNA提取试剂，20份。
食品中金黄色葡萄球菌检验 GBT4789.10-2010
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定性方法
2003版
结 果 判 定
划线Baird-Parker平板：
§菌落直径为2mm～3mm ； §颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈； §用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非 脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈；
§长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥；
方法的注意事项
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使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
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Baird-Parker法
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计算
统一了样品的处理程序 增加了计数要求 选择20—200cfu菌数的平板
ml 无 加 10 10ml 菌水溶解
于37°C 下进行孵育 24小时
Baird Parker 琼脂 + RPF 与平板表面计数法的比較
g样品 + 225 ml 稀释液 25 25g 225ml
第一天
第二天
BPA+RPF BPA
阅读結果 ) (无需确认 无需确认)
挑可疑菌落 酶试验 进行凝固 行凝固酶试验
第三天
确认结果
MPN法
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依据
AOAC 987.09 FDA BAM 2001 德国 DIN EN ISO 6888-3:2003 SN0172-92标准 台湾检验方法 欧美国的一些产品的卫生标准要求
图 1 Baird －Parker 平板法检验程序 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌Baird Baird－ Parker平板法检验程序
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
实验十二金黄色葡萄球菌
致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。
精品课件
5
金葡菌镜下特征
精品课件
6
操作流程
检样25g(mL) +稀释液225mL，均质
7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
36℃±1 ℃， 18h~24h
Baird-Parker平板，血平板
36℃±1 ℃
B-P平板18h~24h或45h~48h 血平板 18h~24h
涂片染色
观察溶血
BHI肉汤和营养琼脂斜面 血浆凝固酶试验
结果报告
精品课件
7
菌落特征
Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色， 周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径 2mm~3mm。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典 型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干 燥。
精品课件
23
取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中， 再加入 BHI培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇 匀，置 36 ±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时 观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管 倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原 体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆 凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培 养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明 书操作，进行血浆凝固酶试验。
精品课件
3
生化特性
典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病 性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长， 常呈双球菌或短链状排列。
本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰 氏染色阳性。
金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为 5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制 杂菌。
金黄色葡萄球菌的试验方法
5 操作步骤
取样上述增菌液中取1～2接种环，划线接种在琼血脂培养基上，置35℃±2℃培养24～48 h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。
挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞.取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养24 h。
精简是否有自荚膜。若符合上述情况，应进行下列试验：
甘露醇发酵试验：取上述菌落接种甘露醇培养液，置35℃±2℃培养24 h，发酵
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文件编号
WI-03-34
版号
A.0
金黄色葡萄球菌的测定方法
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甘露醇产酸者为阳性。
血浆凝固酶试验：玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验；试管法：吸取1∶4新鲜血浆0.5 mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL。混匀，放35℃±2℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24 h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5 mL作阳性与阴性对照。
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1．目的
制订金黄色葡萄球菌的测定方法，对从事检测的操作人员进行培训指导，按测定方法操作。
实验五 金黄色葡萄球菌检测概述
后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48 h。
+ 称取本品63 克,加入950ml蒸馏水中,加热煮沸溶解，分装,121℃ 高压灭菌15分钟备用。冷至50℃，每95ml加入预热至50℃的卵 黄亚碲酸钾增菌液(04-025)配套试剂（用法与用量见配套试剂说 明）。摇匀后倾注平皿。培养基应是致密不透明的。使用前在 冰箱储存不得超过48h）
+ 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色 常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。
+ 金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主 要实验是测定其凝固酶。
+ 对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进 一步确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏 感性实验、耐热核酸酶实验等。
+ A.3.2 制法：加热溶化琼脂，冷却至 50 ℃，以无菌操作加入脱 纤维羊血，摇匀，倾注平板。
+ 血琼脂平板：蛋白胨10g 牛肉膏5g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸 馏水1000ml
+ 煮沸至充分溶解，高压灭菌15~20min 待冷却至50 ℃左右时加
入50ml抗凝羊血（除去纤维）或兔血。摇匀或搅匀倒平板或试 管斜面。 温度过高，培养基呈棕褐色；温度过低则不利于血液 与培养基混匀。
+ 传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、 粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在 室温20℃-22℃放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒 素。
+ 季节分布，多见于春夏季；
+ 中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外， 剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有 报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜 化脓性感染部位常成为污染源。
金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌的测定1 卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
2 检验方法2.1 术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。
显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。
是常见的引起食物中毒的致病菌。
常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。
2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.3 培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。
（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。
3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。
分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。
临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存不得超过48h。
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金黄色葡萄球菌的测定
1 卫生学意义
金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
2 检验方法
2.1 术语与定义
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。
显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。
是常见的引起食物中毒的致病菌。
常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。
2.2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.3 培养基和试剂
（1）7.5%氯化钠肉汤
1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；
2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。
（2）B－P琼脂平板
1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2
2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。
3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。
分装每
瓶95mL，121℃高压灭菌15min。
临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存不得超过48h。
（3）脑心浸出液肉汤(BHI)
1）成分：胰蛋白质胨：10.0g；氯化钠：5.0g；磷酸氢二钠（K
2HPO
4
）：2.5g；
葡萄糖：2.0g；牛心浸出液：500mL；pH：7.4±0.2；
2）制法：加热溶解，调节pH，分装16 mm×160 mm 试管，每管5mL置121℃，15min灭菌。
（4）磷酸盐缓冲液
1）成分：磷酸二氢钾（KH
2PO
4
）：34.0g；蒸馏水：500mL；pH：7.2；
2）制法：
贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的
1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
（5）革兰氏染色液
①结晶紫染色液
1）成分：结晶紫：1.0g；95％乙醇：20.0mL；1％草酸铵水溶液：80.0mL；
2）制法：将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
②革兰氏碘液
1）成分：碘：1.0g；碘化钾：2.0g；蒸馏水：300mL；
2）制法：将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
③沙黄复染液
1）成分：沙黄：0.25g；95％乙醇：10.0mL；蒸馏水：90.0mL
2）制法：将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
④染色法
1) 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
2) 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
3）滴加95％乙醇脱色15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
4) 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。
（6）无菌生理盐水
1）成分：氯化钠：8.5g；蒸馏水：1000mL；
2）制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 检验程序
2.5 操作步骤
（1）样品的处理
称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min 均质1min～2 min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。
若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。
（2）增菌和分离培养
1）将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。
金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
2）将上述培养物，分别划线接种到B-P平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18 h～24 h。
B-P平板36℃±1℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。
3）金黄色葡萄球菌在B-P平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。
用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。
挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
（3）鉴定
1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。
2）血浆凝固酶试验：挑取、B-P平板或血平板上可疑菌落1个或1以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。
同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。
也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。
（4）葡萄球菌肠毒素的检验
可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。
2.6 结果与报告
（1）结果判定：符合上述增菌和分离培养中的3）、（3）鉴定，可判定为金黄色葡萄球菌。
（2）结果报告：在25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。