遗传毒性杂质的警示结构_马磊
基于多成分测定及特征图谱评价不同批次肠炎宁片质量
·2170·氯丁酸甲酯（methyl 4-chlorobutyrate） 2．4-氯丁酸乙酯（ethyl 4-chlorobutyrate）·2172··2174··2176·gallic acid） 4.新绿原酸（neochlorogenic acid） 6.绿原酸（chlorogenic acid） 7.隐绿原酸（cryptochlorogenic acid （rutin） 17.迷迭香酸（rosmarinic acid） C．254 nm 混合对照品色谱图Chromatograms of mixed reference substancesChineseJournal of Pharmaceutical Analysis·2178·同图1（same as Fig. 1）320 nm C．254 nm 肠炎宁样品色谱图Chromatograms of Changyanning samples试品色谱图比较，可以判定1和15号色谱峰均存在于金毛耳草、地锦草、香薷及枫香树叶四味药材中，号峰存在于金毛耳草和枫香树叶中，9号峰存在于地锦草药材中，17号主要存在于香薷药材中；通过记录没食子酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、柯芦丁和迷迭香酸的峰面积，计算各化学成分结果见表2。
由表可知，10批样品中没食子酸5.69~8.79 mg·g-1，其中在样品S6中含量最低，在样品S1中含量最高；新绿原酸、迭香酸成分在样品S1中含量最低，在样品量最高；隐绿原酸含量在3.71~8.81 mg样品S1中含量最低，在样品S6中含量最高；京含量在1.66~2.35 mg·g-1，其中在样品最低，在样品S2中含量最高；芦丁含量在mg·g-1，其中在样品S2中含量最低，在样品量最高。
Journal of Pharmaceutical Analysis Chinese'()*+同图1（samo as Fig. 1）缺金毛耳草阴性样品（negative sample without Hedyotis Chrysoticha） E.缺地锦草阴性样品（negative sample without Euphorbia humifusa Herba 品（negative sample without Elsholtzia ciliate（Thunb.）Hyland） G.缺枫香树叶阴性样品（negative sample withoutH.缺樟树根阴性样品（negative sample without Cinnamomum camphora root） 阴性供试品色谱图（320 nm）Chromatograms of negative samplesChineseJournal of Pharmaceutical Analysis·2180·批样品HPLC特征图谱HPLC characteristic chromatograms of 10 batches of samplesChineseJournal of Pharmaceutical Analysis。
基因毒性杂质作用原理-中文版
遗传毒性致癌物发生致癌和致突变的作用，第一步一般认为都是和DNA发生反应。
从机理上理解基因毒性杂质的作用原理，不用死记硬背，就能轻松记住所有的基因毒性杂质。
根据Miller的理论：致癌物要么是亲电试剂，要么可以代谢成亲电试剂。
然后和DNA的亲核基团发生反应。
DNA的亲核活性基团主要有：•碱基上的氮•碱基上的氧•磷酸酯骨架先来看一下DNA的结构双螺旋的DNA主要含有四个碱基，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及磷酸酯的串联骨架。
这些嘧啶和嘌呤上面的氮氧都富有电子，如果遇见一些缺电子的试剂，很容易发生取代等反应。
事实上，DNA的反应种类除了只反应某一处位点外，还会有一些比较复杂的反应类型：•可以看到有的碱基上不仅含有一个亲核位点，如果一个致癌物有两处亲电位点，反应一处后，还会和碱基的另外一个位点反应，生成一些小环。
•双亲电基团的另外一个基团也有可能和两个不同的碱基链接，甚至可以和两个螺旋上的不同碱基链接。
•也会有可能另外一个基团和蛋白质反应，造成DNA-蛋白质的链接。
DNA的反应活性除了亲核性之外，主要受空间结构的影响。
Guanine中的N7位置位于DNA双螺旋的大沟槽处，空间较大，容易和亲电试剂接触，反应活性显然要比Adenine中处于小沟槽中的N3（红色数字）要高。
当然根据结构也能预知，Adenine的N1和Cytosine的N3（绿色数字）位置处于狭窄的分子空间内，又有氢键相连，所以基本上没有反应活性。
DNA反应并不都是反应在氧和氮上，比如粉红色的C8位置也能发生反应，不过该反应也是先和相邻的N7反应然后重排到C8。
纯粹的理论说明略显枯燥，下面会详细介绍每一类含有警示结构的致癌物。
酰化试剂酰基卤化物酰基卤化物由于卤原子电负性较大，吸引电子，导致羰基碳非常缺电子，一旦和DNA接触，会和腺嘌呤的羰基氧发生酯化反应。
二甲氨基甲酰氯和二乙氨基甲酰氯被IARC归为致癌物2A类。
异氰酸酯是具有多种商业应用的高活性化合物。
5 遗传毒性杂质
ICH M7
目前在第四阶段
FDA
2005年工作小 组成立 2008年指南
内容
一、简介
二、ICH M7
三、遗传毒性杂质的分类
四、限度控制
五、案例
六、总结
ICH M7
• 引言 • 指导原则的范围 • 总体原则
• 上市药品需要考虑的事项
• 原料药和制剂的杂质评估 • 风险评估因素（杂质分类） • 风险表征（控制限度） • 控制策略 • 文件 • 注意事项 词汇表 参考文献 附录
ICH M7对遗传毒性杂质的控制
• 遗传毒性杂质可能出现在起始物料、溶剂、中间
体、副产物和降解产物中，并可能引入到制剂中 • ICH M7提供了一个可用于遗传毒性杂质鉴别、分 类、定量分析和控制的可行性框架。 限制潜在的致癌风险 提供了安全性评估和质量风险控制的概念
对ICHQ3A和Q3B的补充
O
高于1.5g的TTC
• 遗传毒性杂质：致癌性与时间和剂量均有关系；
较短时间内可以承受高于1.5 g/天的剂量，不影 响致癌性。 • 含义：短时间+高浓度和长时间+低浓度得到同样 的效果 • Haber定律：浓度(C)时间(T)=常数(k)
阶段性的TTC限度
放宽限度-阶段性TTC数据
• 低于终身给药剂量的限度（Less-Than-Lifetime）：基 于TTC可接受的限度为1.5 g/天是计算患者终生服药的 基础上得出的理论值，按照70岁寿命计算： • 1.5 g/天*365天*70年（25,550天）=38.3mg
分析潜在的杂 质
必要时重复以 上工作
对杂质进行结 构评价
提交完整的控 制策略
遗传毒性杂质的控制原则
EMEA人用药品委员会(CHMP)《遗传毒性杂质限度指导原则》中文译稿
1EMEA人用药品委员会(CHMP)《遗传毒性杂质限度指导原则》原文：European Medicines Agency: Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities. CPMP/SWP/5199/02。
EMEA/CHMP/QWP/251344/2006。
London, 28 June 2006关键词：杂质；遗传毒性；毒理学担忧阈值(TTC)；构效关系(SAR)摘要遗传毒性杂质的毒理学评估和药物原料中此类杂质的可接受限度确定是难题，现有ICHQ3X指南中未充分说明。
常用遗传毒性杂质数据库差异很大，而数据库是决定(dictates)可接受限度评估所用方法的主要因素。
当运用已建立风险评估方法所需资料缺乏时，包括致癌性长期试验资料或提供遗传毒性阈值机制证据的资料等，建议采用毒理学担忧阈值(TTC)所定义的普遍适用方法。
对大部分药物(Pharmaceuticals)，认为TTC值为遗传毒性杂质摄入量1.5µg/天时相关的风险可接受(一生中额外的癌症风险<1/100000)。
根据该阈值，药物原料中允许水平可根据预计每日剂量计算得到。
短期暴露等特定情况下可能有理由提高限度。
1.1前言在原料药（Q3A，新药物原料中的杂质）和药物制剂（Q3B，新药物制剂中的杂质）的指导原则中描述了杂质限度确定的一般概念，将限度确定定义为确定在特定水平下单个杂质或给定杂质谱的生物学安全性的资料的获得和评价过程。
对于有遗传毒性潜力的杂质，确定可接受剂量水平通常被认为是特别重要的问题，现有指导原则尚未专门涵盖。
1.2适用范围本指导原则阐述了如何处理新药物原料中遗传毒性杂质的一般框架和实践方法。
若新申请的已有药物原料经合成路线、过程控制和杂质谱评估未提供合理保证，证明与EU已批准的含相同药物原料的药品相比，未引入新的或更高水平的遗传毒性杂质，本指导原则也适用于已有药物原料的新申请。
遗传毒性杂质在医药工业中的来源与控制路径
遗传毒性杂质在医药工业中的来源与控制路径摘要：制药企业生产出的药品如果存在遗传毒性杂质，使得药品带有可遗传的毒性，会对人类健康造成严重威胁。
近年来，药品中遗传毒性杂质问题已成为了药品监管机构重点关注的问题之一。
本文将简要概括遗传毒性杂质的属性和含义，详细分析遗传毒性杂质的具体来源，并在最后提出如何控制生产药品中遗传毒性杂质的具体途径。
关键词：遗传毒性杂质；医药工业；来源；控制路径在制药环节中，很多药品通过合成或者天然产物结构修饰制成。
相关制药企业为了在复杂的合成过程中尽可能提高生产效率，而使用大剂量的化学试剂。
这种化学试剂过量会使反应继续发生，进而发生副反应，产生副产物最后仍然储存在药品中售卖。
这样的药品中含有大量不明杂质，可能会影响人类的身体健康。
药品监管局了解到这一问题后，开始聚焦遗传毒性杂质在药品中的含量这一指标，这一问题也成了各位专家的研究重点。
一、遗传毒性杂质的属性和含义首先，我们要明确遗传毒性是指物理或化学的某些因素与生物体内的DNA等遗传物质相结合，进而发生作用并最终表现为毒性。
遗传物质进入人体后，会刺激和加快基因突变或者使人体细胞发生癌变，会对人体健康造成不利影响。
因此，遗传毒性杂质本身具有致突变性和致癌性两种基本属性，容易使得生物体发生基因突变或者发生致癌现象，这种突发性大多情况下是无法及时反应或者预测的。
二、遗传毒性杂质的来源遗传毒性杂质主要来源于药品生产过程中。
药品生产过程涉及到的原料或产物有很多，都从属于化学试剂。
例如反应物、催化剂、副产物等等。
根据研究，遗传毒性杂质的遗传毒性机制是嘧啶和嘌呤碱的N原子、O原子以及磷酸二甲酯骨架，在特殊情况下进入DNA找到碱基的亲核中心，破坏连接的键，进而使得整条DNA双链断裂。
遗传毒性杂质的常见来源包括试剂、副反应的生成物和有机溶剂三种方式。
（一）试剂含有遗传毒性杂质的试剂包括硼酸、芳香胺类、烷基卤化物、环氧乙烷、肼试剂、氮氧化物等。
环氧乙烷自身带有环，而DNA中心受到环的张力会与该物质发生亲核反应，进而产生大量遗传毒性杂质。
EMA_关于基因毒性杂质限度指南的问答(中文)
EMA 关于基因毒性杂质限度指南的问答2010-9-23背景:本问答文件的目的是对 2006 年出版的基因毒性杂质限度指南( EMEA/CHMP/QWP/251344/2006 )进行相关内容统一和说明。
问答Q1：该指引并不要求对已批准销售的产品进行基因毒性杂质再评估，除非有一个特定的“重要原因”(cause-for-concern )。
请问什么是“重要原因”？A1：如果原料药的生产过程基本上没有改变，就不需要对基因毒性杂质进行重新评价。
但是，如果新知识表明有新原因时，例如几年前发现的甲磺酸盐药物可能形成甲磺酸烷基的基因毒性杂质，这需要进行基因毒性杂质的再评估，包括EP 药典中收载的所有甲磺酸盐类产品，并出示“生产声明”。
Q2：该指引指出：即使按决策树程序其水平低于毒理学关注阈值 (threshold of toxicological concern,TTC) ，也要尽可能地减少已知或未知的诱变杂质( mutagenic impurity )。
如果已知其诱变杂质的水平低于 TTC (TTC 是一个非常保守的值)，为什么要还进一步减少呢？实际上这还涉及定量限在 1ppm 左右的分析方法，可以这样做但可能没结果，这是否有必要呢？A2：如果一个诱变杂质的水平低于毒理学关注阈值 (相当于临床剂量≤1.5微克 /天)，就没有必要这样做。
除非它具有一个高度关注的风险结构：如N - 亚硝基，黄曲霉毒素类和氧化偶氮物就需要这样做。
Q3 ：该指引规定：“当一个潜在的杂质包含“警示结构”(structural alerts )时，应考虑用细菌突变试验对其杂质进行的基因毒性分析”。
i )如果一个杂质能诱发“警示结构”，该杂质的致突变试验( Ames)结果为阴性时，是否就足以得出结论：该化合物不属于关注的遗传毒性杂质？是否还需要进一步的确认研究？ii )“警示结构”不存在就足以说明不属于关注杂质呢？iii )假设某杂质属于“警报结构”，但只要加以控制确保其杂质水平低于 TTC ，不进行常规检测是否可以接受？A3 回答：i)是的。
基因毒性杂质培训 PPT课件
对甲苯磺酸季戊酯（布洛芬）： 苯：溶剂石油醚可能含有苯
右旋布洛芬中可能含有的基因毒性杂质
右旋布洛芬中合成路线
甲苯中要控制苯！
布洛芬赖氨酸中可能含有的基因毒性杂质
布洛芬赖氨酸合成工艺
=
布洛芬赖氨酸水杨醛的限度问题
台湾2016年9月缺陷信及回复：
氟马西尼合成工艺
氟马西尼中N,N-二甲苯胺基因毒性
盐酸格拉司琼中可能含有的基因毒性杂质
Granisetron起始原料1-甲基吲唑-3-羧酸 中可能含有的基因毒性杂质
Granisetron起始原料氮杂壬胺可能含有的基因毒性杂质
盐酸格拉司琼中可能含有的基因毒性杂质
盐酸格拉司琼欧洲药品质量管理局(EDQM) 缺陷信
磷酸氟达拉滨中可能含有的基因毒性杂质
Fludarabine起始原料合成工艺
磷酸氟达拉滨合成工艺
氯苄
氯苄的毒性资料
The Carcinogenic Potency Database (CPDB)致癌物数据库公布的1547种致癌物质中有氯苄：
托拉塞米中可能含有的基因毒性杂质
托拉塞米起始原料合成工艺
O
O NH2 A Carbamates 氨基甲酸类
AA NN
AR Hydrazines and azo Compounds 肼和偶氮化合物
EWG
Michale-reactive Acceptors 迈克尔加成反应受体
O P
OR
O S
OR
Alkyl Esetrs of Phosphonates or Sulfonates 膦酸酯或者磺酸酯
D-（+）-樟脑磺酸乙酯
基因毒性杂质
由LD50推算PDE值建议
《原料药工厂中清洁验证指南》一文中的NOEL 的单位是mg/天，而不是上文公式中的 mg/kg/天 LD50计算NOEL的公式：NOEL=LD50×70/2000，公式中的70是欧洲人的评价体重 如果需要用LD50计算NOEL用于计算PDE，推荐公式应该是NOEL=LD50/2000 （见参考文献） 不推荐在基因毒物质研究中使用
4.药品杂质毒性判别方法 5.药品杂质研究限度策略 6.药品杂质风险评估的分析方法建立策略
1.药品杂质研究的法规依据
杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效，甚至对人体的健康有害的物质 产品质量重点关注杂质：工艺杂质、 降解杂质 安全性重点关注高毒性杂质：致癌、致突变类杂杂质 中国药典、美国药典、欧洲药典、日本药典等各国药典
在检索剂量数据前需要全面检索该物质是否有致癌致畸性，例如氯乙酸CPDB数据TD50显示阴性 盐酸盐的药物在重结晶过程中的接触醇类容易产生氯代烷烃，单一卤代物在M7中有36ug/day指导规则 关注环氧丙醇、环氧氯丙烷、3-氯-1,2-丙二醇三者之间的转化关系 毒性数据会被不断的更新，更多的研究数据会被不断的上传
已知杂质研究策略讨论 结构已知的杂质研究：起始物料及其已知杂质、中间体、试剂、反应副产物、降解产物
根据工艺路线梳理出产品待研究的杂质清单 进行毒性杂质评估分类：文献报道、软件预测 根据各国药典及ICH Q A\B\C规则分别建立有关物质和溶剂残留方法 建立满足专属性和灵敏度的方法（LOQ<30%限度浓度），收集多批次API中目标杂质含量 基于已有的有关物质方法和溶剂残留方法，增加供试品浓度或改变检测器 基于杂质检出情况制定杂质添加实验，考察工艺的杂质的去除能力 基于杂质分类、毒性评估、产品检出情况制定方法学验证策略及产品控制策略