总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。
随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。
以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。
1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。
实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。
2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。
实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。
3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。
实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。
4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。
实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。
5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。
实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。
6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。
实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药物和化妆品等领域。
下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。
DPPH自由基清除法是一种简单而直观的测定方法。
该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。
通过测量样品溶液吸光度的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。
二、FRAP法FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。
抗氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化损伤。
FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的抗氧化能力。
具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。
样品的抗氧化能力可以通过吸光度的变化来计算。
三、TBARS法TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。
脂质过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳定化合物。
TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。
该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。
吸光度越高，脂质过氧化程度越高。
综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。
每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。
在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。
总抗氧化能力(DPPH 法)试剂盒说明书
总抗氧化能力(DPPH法)试剂盒说明书分光光度法50T/48S 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
研究意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。
在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。
测定原理：DPPH为稳定的自由基，溶于甲醇、乙醇等极性溶剂中，在515nm处有最大吸收。
向DPPH 溶液中加入抗氧化剂时，会发生脱色反应，因此可用吸光度的变化并以Trolox作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。
自备实验用品：恒温水浴锅、低温离心机、分光光度计、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，使用前预冷。
试剂一：液体60mL×1瓶，避光保存。
样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。
血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。
(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：1、分光光度计预热30min，调节波长至515nm。
2、操作表（在EP 管中反应）空白管测定管提取液（μL）50样品（μL）50试剂一（μL）950 950充分混匀，室温避光反应20min，于1mL玻璃比色皿测定515nm吸光值，△A= A空白-A测定注意：空白管只需测定一次，若A测定小于0.2，需用提取液稀释后检测。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。
反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。
该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。
而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。
2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。
在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。
TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。
但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。
3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。
总抗氧化能力测定(FRAP法)讲解学习
总抗氧化能力测定(F R A P法)小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。
由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。
并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。
由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。
AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；3上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。
2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4o C），取上清液。
3.在反应管中加入100uL上清液，再加入 2.4mL工作液，37 o C条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，的标准液替代样品绘制标准曲4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO4线。
三、结果计算以1.0mmol/L的FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP值，计算结果。
[1]Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2]Katarzyna Szafrańska, Rafał Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvem ent of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stress[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.。
总抗氧化能力(Total antioxidant capacity ,T-AOC)试剂盒说明书
货号：QS1504 规格：50管/48样总抗氧化能力（Total antioxidant capacity ，T-AOC）试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。
在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。
测定原理：在酸性环境下，物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其总抗氧化能力。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、低温离心机、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，使用前预冷。
试剂一：液体50mL×1瓶，避光保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，避光保存。
样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。
血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。
(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：37℃。
第1页，共2页第2页，共2页总抗氧化能力计算：1.定义：样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值（△A ）所需的标准液离子浓度表示。
总抗氧化活性评估
3、提取物总抗氧化活性评估采用铁还原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power，FRAP）分析法。
取适量上述样品提取液（必要时稀释），加入 1.8ml TPTZ 工作液（由0.3moL/L 醋酸盐缓冲液25 ml、10 mmoL/L TPTZ 溶液 2.5 ml、20 mmol/L FeCl3溶液 2.5 ml 组成），混匀后37 ℃反应10 min，593 nm 测定吸光度，以 1.0 mmol/L FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示试剂的配方：1）TPTZ 工作液现用现配：由25ml 300 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、2.5ml 10mmol/L TPTZ溶液、2.5ml 20mmol/L FeCl3溶液混合而成。
A: 300 mmol/L醋酸盐缓冲液（PH3.5）取醋酸铵（分子量77）25g，加水25ml 溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5（电位滴定法），用水稀释至100（还是1000？你计算下）ml，即得。
B: TPTZ是一种化合物1,3,5- tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine (C18H12N6, TPTZ)的缩写2,4,6-三吡啶基三嗪（这个药品实验室估计没有，明天再找找，我买了，估计2-3天到）2）标准曲线的绘制：分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的FeSO4标准液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3ml标准系列，混匀，准确反应5min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零，绘制标准曲线。
样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。
3）样品的测定：量取0.1ml的样品溶液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3 ml 待测样品，混匀，准确反应5 min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零。
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。
反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。
该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。
而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。
2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。
在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。
TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。
但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。
3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。
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总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)
产品编号产品名称包装
S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次
产品简介：
总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，简称T-AOC Assay Kit，是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。
在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。
活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。
机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。
一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。
因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。
植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。
FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。
由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。
并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。
由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。
Antioxidant
Fe3+-TPTZ ——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)
提供了抗氧化物Trolox作为对照。
Trolox是一种维生素E的类似物，水溶性较好，抗氧化能力和维生素E相近。
本试剂盒方便快捷，加入待测样品后3-5分钟即可进行吸光度测定，通常10-20个样品可以在十多分钟内检测完毕。
本试剂盒可以检测100个样品。
包装清单：
产品编号产品名称包装
S0116-1 TPTZ稀释液 15ml
S0116-2 TPTZ溶液 1.5ml
S0116-3 检测缓冲液 1.5ml
S0116-4 FeSO4·7H2O 200mg
S0116-5 Trolox溶液 (10mM) 0.1ml
—说明书1份
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
其中S0116-2 TPTZ溶液，S0116-3 检测缓冲液和S0116-5 Trolox溶液 (10mM)需避光保存。
注意事项：
在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂会对本试剂盒的检测产生干扰，需尽量避免。
如果样品中含有外加的较高浓度的铁盐或亚铁盐，会干扰测定。
但血浆、血清、细胞或组织裂解液等样品中含有的微量的铁盐或亚铁盐不会干扰测定。
样品中不能添加DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的物质，也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂。
测定时需可以测定A593的酶标仪一台(测585-605nm也可以)或可以测定微量样品的分光光度计一台。
TPTZ对人体有刺激性，请注意适当防护。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. FRAP工作液的配制：
(1) 参考下表，根据待测定样品的数量(含标准曲线)配制适量的FRAP工作液：
1个检测5个检测10个检测20个检测50个检测
TPTZ稀释液 150微升 750微升 1500微升 3000微升 7500微升
TPTZ溶液15微升75微升150微升300微升750微升
充分混匀后再加入检测缓冲液
检测缓冲液15微升75微升150微升300微升750微升
FRAP工作液 180微升 900微升 1800微升 3600微升 9000微升
FRAP工作液配制后37℃孵育，并宜在1-2小时内使用完毕。
2. 待测样品的准备：
(1) 血清、血浆、唾液或尿液样品的准备：
血清、血浆、唾液或尿液样品每个样品需要5微升，都可以直接用于测定。
血清、血浆、唾液或尿液样品都可以使用新鲜样品进行测定，也可以-80℃冻存后再进行测定。
-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。
注意：血浆制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝。
根据文献报道，人血清或血浆中的总抗氧化能力为0.5-2mM，人唾液中的总抗氧化能力为0.3-1mM，人尿液中的总抗氧化能力为0.2-3mM。
(2) 细胞或组织样品的准备：
对于细胞样品，收集约100万个细胞(不必精确计数，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，匀浆或超声以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4℃约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。
对于组织样品，每20mg组织加入100微升冰冷的PBS或HBSS溶液，匀浆或超声以充分破碎组织并释放其中的抗氧化物，4℃约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。
以上所有操作均需在4℃或冰上操作。
制备好的细胞或组织样品的上清如果不立即用于测定，可以在-80℃冻存。
-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。
细胞或组织样品在测定总抗氧化能力时需同时测定蛋白浓度，最后测定获得的总抗氧化能力通常表示为每毫克或每克蛋白重量中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。
(3) 其它样品的准备：
植物或中草药抽提液都可以直接用于检测。
需注意样品本身的颜色不会干扰检测。
植物或中草药抽提液的抗氧化能力可以表示为每毫克或每克抽提物干重中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。
各种抗氧化物测定其抗氧化能力时，通常配制成0.15-1.5mM，然后进行测定。
抗氧化物的浓度可以以摩尔浓度表示时，测定获得的总抗氧化能力可以用相对总抗氧化能力进行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD值相同，则其相对总抗氧化能力为2，再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD值相同，则其相对总抗氧化能力为5。
3. 标准曲线测定的准备：
称取27.8 mg本试剂盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1 ml，此时浓度即为100 mM。
取适量100 mM FeSO4溶液稀释至
0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。
通常可以使用蒸馏水或样品配制溶液配制标准品。
对于血清、血浆、唾液或尿液样品
推荐直接用蒸馏水或PBS配制标准品；对于细胞或组织样品，推荐用用于细胞或组织匀浆的溶液配制标准品，其它样品参考前述方法进行。
FeSO4溶液宜新鲜配制使用。
100 mM FeSO4溶液容易氧化产生三价铁盐，使溶液的颜色从最初的淡绿色逐渐转变为浅黄色。
如果发现溶液的颜色已经呈现明显的黄色，应该弃用该溶液，并使用试剂盒提供的FeSO4·7H2O重新配制新鲜的FeSO4溶液。
4. 总抗氧化能力的测定：
(1)96孔板的每个检测孔中加入180微升FRAP工作液。
(2)空白对照孔中加入5微升蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5微升各种浓度的FeSO4标准溶液；样品检
测孔内加入5微升各种样品或0.15-1.5mM的Trolox作为阳性对照。
轻轻混匀。
(3)37℃孵育3-5分钟后测定A593。
如果测定A593有困难，也可以在585-605nm范围内进行测定。
(4)根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，需把样品适当稀释后
再进行测定。
(5)总抗氧化能力的表示方式：对于FRAP方法，总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示。
例如某血浆样品测定获
得的吸光度和1mM FeSO4标准溶液的吸光度相同，则该血浆样品的总抗氧化能力即为1mM；再如某血清样品测定获得的吸光度和0.65mM FeSO4标准溶液相同，则该血清样品的总抗氧化能力为0.65mM；再如某细胞匀浆液测定获得的吸光度和0.3mM FeSO4标准溶液相同，并且该匀浆液的蛋白浓度为0.15mg/ml，则该细胞样品的总抗氧化能力为
0.3mM/0.15mg/ml，即2mmol/g；再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的吸光度和1mM的亚铁盐测定获得的吸光度相
同，则其相对总抗氧化能力为5。