DNA连接试验
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
dna片段的连接,转化及酶切鉴定
DNA片段的连接、转化和酶切鉴定是基因工程中常用的实验
技术。
下面是这些步骤的详细描述：
1. DNA片段的连接（Ligation）：将两个或多个DNA片段连
接在一起。
这通常使用DNA连接酶（ligase）来催化连接反应，其中DNA连接酶通过形成磷酸二酯键将DNA片段连接起来。
2. DNA转化（Transformation）：将连接好的DNA片段转化
进入宿主细胞。
转化是通过加入特定的化学物质（例如钙离子和热激冷冻）或基因枪等方法，使细胞质膜对DNA片段通透，使其能够进入细胞内。
3. 酶切（Enzyme Digestion）：使用限制性内切酶（restriction enzyme）对转化后的DNA进行酶切，以确认连接是否成功。
限制性内切酶具有特异性，能够识别特定的DNA序列并在其
附近切割DNA链。
4. 鉴定（Identification）：通过凝胶电泳（gel electrophoresis）等方法对酶切后的DNA进行分离和鉴定。
凝胶电泳是一种基
于DNA分子的大小和电荷的分离方法，可以将DNA分子按
照大小分开，并可根据标准样品和分子量标记DNA片段等进
行鉴定。
通过上述步骤，可以实现DNA片段的连接、转化和酶切鉴定，从而用于基因工程研究和应用中。
同源重组连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解同源重组连接的原理和方法。
2. 掌握同源重组连接实验的操作步骤。
3. 通过实验验证同源重组连接的成功与否。
二、实验原理同源重组连接是指将含有相同序列的DNA片段通过酶切、连接等操作，使其在体外重组形成新的DNA分子。
该实验原理基于DNA分子中的同源序列可以互补配对，通过DNA连接酶的作用，将两个DNA分子连接起来。
三、实验材料1. 实验仪器：DNA测序仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机等。
2. 实验试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、琼脂糖、TAE缓冲液、PCR引物、dNTPs、DNA模板等。
3. 实验样本：待连接的DNA片段、载体DNA、质粒DNA等。
四、实验步骤1. DNA提取：分别提取待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA。
2. 酶切：使用限制性核酸内切酶分别对待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA 进行酶切，得到具有相同黏性末端的DNA片段。
3. 酶切产物纯化：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收所需的DNA片段。
4. DNA连接：将回收的DNA片段与载体DNA在DNA连接酶的作用下进行连接。
5. 连接产物转化：将连接产物转化至宿主细胞，如大肠杆菌。
6. 阳性克隆筛选：通过PCR或DNA测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
7. 验证同源重组连接：通过PCR、DNA测序或限制性酶切等方法验证同源重组连接的成功与否。
五、实验结果与分析1. 酶切产物电泳结果：酶切产物电泳结果显示，待连接的DNA片段、载体DNA和质粒DNA在相应位置上出现明亮条带，表明酶切成功。
2. 连接产物转化结果：转化实验结果显示，转化后的宿主细胞在含有抗生素的培养基上生长，表明连接产物已成功转化至宿主细胞。
3. 阳性克隆筛选结果：通过PCR或DNA测序等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆，表明同源重组连接实验成功。
4. 同源重组连接验证结果：通过PCR、DNA测序或限制性酶切等方法验证同源重组连接的成功与否，结果表明连接产物中存在预期的同源序列，验证了同源重组连接的成功。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.DNA片段的准备：首先，需要准备待连接的DNA片段。
这些片段可以通过PCR扩增、酶切、化学合成等方法获得。
通常情况下，需要使用DNA电泳等方法对所得片段进行纯化。
2.酶切：对于需要连接的DNA片段，通常需要进行酶切。
酶切是通过特定的限制性内切酶作用于DNA分子的特定位点将其切割为片段。
酶切的目的是使得两个相互连接的DNA片段具有互补的黏性末端，为连接反应提供条件。
3.连接反应的混合：将需要连接的DNA片段以及连接酶和相应的缓冲液混合。
连接酶通常是DNA连接酶，可以将DNA分子连接在一起。
4. 连接反应的条件：连接反应通常在适当的反应缓冲液中进行。
连接酶对于温度和pH值都有特定的要求，因此在连接反应中必须保持恰当的温度和缓冲液pH值。
例如，常用的DNA连接酶T4 DNA Ligase在适宜的pH值和温度下具有最佳的酶活性。
5.连接反应的时间：连接反应的时间取决于所使用的连接酶的速度以及连接反应的目的。
一般情况下，连接反应通常需要在4°C至37°C下进行数分钟至几小时。
6.连接反应的酶切：连接反应结束后，需要用限制性内切酶对连接的DNA分子进行酶切。
这一步是为了去除未连接的DNA分子以及连接酶，以提高连接反应的准确性。
7.DNA连接酶的去除：连接酶在连接反应结束后需要被去除，一般常用热灭活法或化学去除法。
热灭活法是将连接反应体系加热至70°C一段时间（如10分钟），高温可使连接酶失活。
化学去除法是通过柱等手段，利用一些物质能够与连接酶结合并使其失活的性质，达到去除目的。
8.电泳鉴定：连接反应后的DNA片段可以通过电泳进行鉴定。
通过与大小标准品进行比较，可以确定连接反应是否成功。
连接反应成功后，DNA片段的大小会发生改变，从而可以通过电泳图谱来观察。
DNA连接反应是分子生物学中重要的技术，可以实现基因克隆、构建重组融合表达载体等应用。
连接反应的成功与否对后续实验结果的可靠性至关重要，因此在每一步操作中需仔细操作，确保反应条件的正确性，以及对连接酶的适当去除等。
实验十六DNA的连接与转化
实验十六DNA的连接与转化DNA的连接与转化是基因工程领域中常用的技术手段之一，通常用于将外源DNA导入到细胞中，以实现特定的需求。
本实验的研究目的是了解DNA连接和转化的基本原理，以及实验过程中的操作技巧和可能的问题。
一、实验原理1. DNA的连接DNA的连接是指将两条DNA分子连接起来形成一条较长的DNA分子。
DNA连接的方法主要有三种：（1）限制性内切酶连接方法，（2）TA Clone技术连接方法，（3）DNA接头连接方法。
（1）限制性内切酶连接方法：限制性内切酶能够识别并切割DNA分子的特定序列，因此，如果两条DNA分子的末端含有相同的限制性内切酶切割位点，在加入连接酶（如DNA连酶）的条件下，这两条DNA分子可以连成一条较长的DNA分子。
（2）TA Clone技术连接方法：TA Clone技术是通过向PCR反应体系中添加polymerase 链特异性的核苷酸，使其在末端添加一定数量的A或T碱基，然后将PCR产物直接连接至非脱氧末端载体上，从而实现DNA连接。
DNA的转化是将外源DNA导入到细胞内部的过程，进而使细胞表达出外源DNA所编码的蛋白质，从而达到特定目的。
在实验室中，常用的DNA转化方法有两种：（1）化学转化法，（2）电转发法。
（1）化学转化法：这种方法是在化学方法的帮助下，使细胞发生化学的通道，从而使外源DNA进入细胞。
化学转化法的缺点是效率较低，很难实现高效转化。
（2）电转发法：电转发法是将DNA与细胞一起转换，在低电压下应用瞬间高压电场使细胞壁产生通道，使DNA穿过细胞壁进入细胞质。
瞬间高压电场使这些通道持续时间较小，一旦DNA穿过细胞壁进入细胞质，并且在某些情况下，该细胞将接受DNA并将其整合进其基因组。
二、实验方法（1）准备连接反应首先，根据需要连接的DNA分子确定使用的连接方法和所需的酶，例如，如果需要使用限制性内切酶连接方法，则需要购买相应的酶，同时设计酶切位点。
实验6 DNA连接
样品代号
I f T
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
用量（μl） 6.0 10.0 2.0 2.0 20
（三）DNA连接样品的电泳检测
琼脂糖凝胶的制备：制备0.8%琼脂糖凝胶（0.32g/40ml）。 （注：全班制备5块胶，第5块备用）
脂糖
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
（二）DNA片段的连接
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中
↓ 保温1-连接样品检测：
λ/EcoT14 I 样品 10μl（M2）+ 6X的loading buffer 2μl DNA连接样品：10 μl + 6X的loading buffer 2μl
(2)
3、恒压电泳: 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30-40 分钟
4、观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。
实验目的
1、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA并利用DNA连接酶 连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿 主细胞进行表达提供了有效的实验材料。
第一个DNA重组分子
1972年Paul Berg等人利用限制性内切酶EcoRI和 连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工 程的开始。
一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-
基因的连接实验报告
一、实验目的1. 熟悉基因克隆实验的基本原理和方法；2. 掌握DNA连接技术的操作步骤；3. 学习如何检测连接产物的存在。
二、实验原理基因克隆是将目的基因片段插入到载体DNA中，构建成重组DNA分子，并在宿主细胞中进行复制和表达。
DNA连接技术是基因克隆实验中关键的一步，其原理是利用DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）将目的基因和载体DNA连接起来。
三、实验材料1. 目的基因片段：PCR产物或基因合成片段；2. 载体DNA：质粒或噬菌体；3. DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）；4. 连接缓冲液；5. 琼脂糖凝胶电泳试剂；6. DNA分子量标准；7. DNA纯化试剂盒；8. DNA测序仪；9. 实验器材：PCR仪、离心机、凝胶成像系统、微量移液器、电泳槽等。
四、实验步骤1. 准备反应体系：将目的基因片段和载体DNA分别进行PCR扩增或提取，纯化后按一定比例混合，加入DNA连接酶和连接缓冲液，混匀。
2. 反应条件：将反应体系置于16℃条件下，反应时间为2小时。
3. 反应终止：将反应体系置于70℃水浴中5分钟，使DNA连接酶失活。
4. 琼脂糖凝胶电泳：将连接产物与DNA分子量标准在同一条件下进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接产物是否存在。
5. DNA纯化：将电泳检测到的目的基因片段进行纯化。
6. DNA测序：将纯化后的目的基因片段进行测序，验证连接产物的正确性。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果：若连接产物存在，则在琼脂糖凝胶电泳中可见目的基因片段的条带。
2. DNA测序结果：将测序结果与目的基因序列进行比对，若序列一致，则说明连接成功。
六、实验讨论1. 实验过程中，反应体系的配置要准确，避免因浓度过高或过低导致连接效率降低。
2. DNA连接酶的活性对连接效率有重要影响，选择合适的酶和反应条件可以提高连接效率。
3. 实验过程中，注意防止DNA污染，确保连接产物的纯度。
4. 若连接产物电泳条带不明显，可能是因为连接效率低、DNA浓度低或电泳条件不合适等因素。
DNA 连接注意事项
DNA连接实验原理、试剂、步骤和注意事项点击： 116 作者：admin 来源：未知日期：2010-06-14DNA分子的体外连接就是在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源DNA和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。
因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。
利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。
如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA 已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。
粘性末端连接：实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。
如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。
通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。
生物实验：dna连接与转化.pptx
制备感受态细胞
▪ 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合.
▪ ＤＮＡ分子转化分以下几步: ▪ １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ▪ ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受
体菌，另一条降解； ▪ ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成
双链； ▪ ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，
定，折衷方法是１２℃过夜。
3. DNA的平未端和粘性末端
▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。
▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图。
实验十二 DNA的连接与转化
1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
一．实验目的及背景
▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。
▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
转录翻译。
2.重组子的筛选
▪ 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则 上要注意：
▪ １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株；
▪ ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。
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DNA连接试验当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体，并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。
此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。
DNA连接实验原理：ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。
因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。
利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。
如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA 可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。
粘性末端连接：实验试剂：用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。
如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。
通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。
）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇500μl/ml BSA（可用可不用）T4DNA连接酶%5mM ATP实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴５分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10μl。
2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
3、１２℃下过夜连接反应。
4、反应结束后于－２０℃保存。
5、再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。
如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。
可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。
注意事项：1、连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。
二者连接效率不同。
粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3、碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。
这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。
5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。
若连接成功，则说明有效。
平端DNA连接：Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。
有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。
优点：1、没有连不上的，只有切不开的。
平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用。
这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。
2、有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。
缺点：1、连接效率比粘性末端低：连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。
2、可能产生双向插入：由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。
这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。
一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。
3、可能多拷贝插入：平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。
一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。
平端连接要求的条件：1、低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
2、不存在亚精胺一类的多胺。
3、极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
4、高浓度的平端实验试剂：凝聚剂：在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman 和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。
在连接反应中，这些物质具有两作用：1、它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行2、它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。
这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体聚乙二醇（PEG8000）：1、用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。
在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。
除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。
2、连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
3、浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。
4、PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。
氯化六氨合高钴：1、氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。
当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。
氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
2、在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。
连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。
3、与ＰＥＧ8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。
实验步骤：(以20ul 酶切完后的体系为例）1、如果要补平或切平,先将样品置于70度水浴10min,将体系放大到50ul，其中按照说明书加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。
2、常温反应10min后将反应物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反应5min。
3、凝胶回收处理的载体或片断。
4、CIAP处理。
5、苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。
6、连接反应。
注意事项：1、插入片断和载体片断的比例要高。
2、连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。
3、载体片断要做去磷酸化处理。
4、也可以用15％的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。
5、反应体系10UL，不要太大。
6、载体片断不要加多了，一般酶切跑賋并割胶纯化并去磷酸化后加0。
5微升就可以了。
7、去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。
8、插入片断和载体片断要酶切良好。