DNA连接酶 (1)
2基因工程的酶学基础
GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
T4 DNA 连接酶 #EL0011 Thermo scientific
T4 DNA Ligase ——Thermo scientific #EL0011产品信息特点快速–室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。
•该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。
•配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。
应用克隆酶切产生的DNA片段。
•克隆PCR产物。
•连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。
•定点诱变。
•扩增片段长度多态性(AFLP)。
•连接酶介导的RNA 检测(3)。
•双链DNA，RNA 或DNA/RNA 复合体中缺口的修复。
•线性DNA自身环化。
说明T4� DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5’ -磷酸基团和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。
酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA 的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性(1, 2)。
T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。
浓度1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl*一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。
来源含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。
分子量55.3 kDa，单体。
活性单位定义1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [32PPi]转换为Norit 可吸收形式所需的酶量(Weiss单位**(4)。
酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3�µM [32PP i].** 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程原理题库-名词解释
基因工程原理题库-名称解释1.基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
2.假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。
3.重叠基因: 是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。
4.结构基因：指受调控的编码特定生物合成和代谢过程中的酶/蛋白质的基因。
5.调节基因(regulator gene): 是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异DNA序列。
6.基因家族：真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。
7.基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。
8.基因组：该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
9.基因工程：是指在分子水平上，根据分子生物学和遗传学原理，在体外将一个生物体中有用的目的DNA(或基因)核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。
使后者获得所需的新遗传性状或表达所需产物，最终实现该技术的商业价值。
10.操纵子：是原核生物中一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
11.mRNA (messenger RNA)：由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息并指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
12.启动子：在DNA 转录起始时RNA聚合酶识别并与其结合的一段DNA 片段，一般不编码蛋白，具有与RNA 聚合酶结合位点，并引导转录的起始。
13.增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。
它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
分子生物学名词解释
1.翻译(translation)：以mRNA为模板，氨酰-tRNA为原料直接供体，在多种蛋白质因子和酶的参与下，在核糖体上将mRNA分子上的核苷酸顺序表达为有特定氨基酸顺序的蛋白质的过程。
2.密码子(codon)：mRNA中碱基顺序与蛋白质中氨基酸顺序的对应关系是通过密码实现的，mRNA中每三个相邻的碱基决定一个氨基酸，这三个相邻的碱基称为一个密码子。
3.密码的简并性(degeneracy)：—个氨基酸具有两个以上密码子的现象。
4.同义密码子(synonym codon)：为同—种氨基酸编码的各个密码子，称为同义密码了。
5.变偶假说(wobble hypothesis)：指反密码子的前两个碱基(3’-端)按照标准与密码子的前两个碱基(5’-端)配对，而反密码子中的第三个碱基则有某种程度的变动，使其有可能与几种不同的碱基配对。
6.移码突变(frame-shift mutation)：在mRNA中，若插入或删去一个核苷酸，就会使读码发错误，称为移码，由于移码而造成的突变、称移码突变。
7.同功受体(isoacceptor)：转运同一种氨基酸的几种tRNA称为同功受体。
8.反密码子(anticodon)：指tRNA反密码子环中的三个核苷酸的序列，在蛋白质合成过程中通过碱基配对，识别并结合到mRNA的特殊密码上。
9．多核糖体(polysome)：mRNA同时与若干个核糖体结合形成的念珠状结构，称为多核糖体。
1．中心法则(central dogma)：生物体遗传信息流动途径。
最初由Crick(1958)提出，经后人的不断补充和修改，现包括反转录和RNA复制等内容。
2．半保留复制(简称复制)（semiconservative replication)：亲代双链DNA以每条链为模板，按碱基配对原则各合成一条互补链，这样一条亲代DNA双螺旋，形成两条完全相同的子代DNA螺旋，子代DNA分子中都有一条合成的“新”链和一条来自亲代的旧链，称为半保留复制。
生物化学名词解释DNA
➢中心法则：DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物体的表型。
DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则（DNA处于生命活动的中心）。
➢反中心法则：在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质。
➢复制：以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程，使亲代DNA遗传信息准确传给子代DNA。
➢转录：以DNA某段碱基顺序（基因）为模板，合成互补的RNA分子的过程，信息从DNA传到RNA。
➢逆转录：以RNA为模板，通过逆转录酶催化合成DNA的过程，遗传信息的传递方向与转录过程相反。
➢翻译：以mRNA为模板，指导合成蛋白质的过程。
➢基因的表达：DNA分子中基因的遗传信息通过转录和翻译，合成有蛋白质的过程。
➢半保留复制（semiconservative replication）：DNA复制时，每一条DNA链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每个分子都含有一条新链和一条旧链。
➢起点（origin，ori）：复制起始部位的一段核酸序列，控制复制的起始。
➢终点（terminus）：终止DNA复制的一段核酸序列。
➢复制子（replicon）：基因组中能独立进行复制的单位（复制起点到终点的核酸片段）。
原核生物只有一个复制子；真核生物含多个复制子，多个起点和终点，形成多个“复制眼”或“复制泡”。
➢复制叉（replication fork）：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。
➢DNA双链复制时，一条链是连续合成的（前导链或领头链，leading strand），另一条链是不连续合成的（后随链或滞后链，lagging strand）。
➢DNA的半不连续复制（semidiscontinuous replication）：前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式。
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（二）具平末端DNA片段之间的连接
（三）DNA片段末端修饰后进行连接
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（一）具互补黏性末端片段之间的连接
（二）具平末端DNA片段之间的连接
（三）DNA片段末端修饰后进行连接
1、DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 2、黏性末端修饰成平末端后进行连接 3、DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接 4、DNA片段加连杆或衔接头后连接
DNA连接酶
• 1974年Lehman报道了DNA连接酶的作用机制即催化 DNA链的相邻3’羟基和5’磷酸基团发生缩合反应，形 成磷酸二酯键。 • DNA连接酶分为ATP依赖型和NAD+依赖型。
• 常用的DNA连接酶： T4 DNA 连接酶 E.coli DNA 连接酶 Tsc DNA 连接酶
E.coli 、T4和Tsc DNA连接酶
DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 特点：给平末端DNA片段3’-OH加上同聚物。
黏性末端修饰成平末端后进行连接
特点：先修饰成平末端，后连接。
DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
特点：先使一种DNA片段的5’端由磷酸基（P）转变为（-OH）
DNA片段加连杆或衔接头后连接
E.Coli DNA 连接酶
催化连接底物 DNA 反应需辅因子 NAD T4DNA连接酶 DNA、RNA ATP
TSC DNA 连接酶
DNA NAD
用途
黏性பைடு நூலகம்端的连接
黏性末端 黏性末端 平末端的连接及 平末端的连接及切 切口的连接 口的连接 4~15
过夜
连接温度
连接时间
4~15
过夜
45~65
较短
二、DNA片段的连接方法 • 由于待连接的DNA片段具不同形式的末 端，因此须采用不同的连接方法。 • （一）具互补黏性末端片段之间的连接