M3型乙酰胆碱受体对心脏成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达及机制要点
抗毒蕈碱受体3(M3R)抗体、抗α-胞衬蛋白抗体和抗SSA抗体、抗SSB抗体在原发性干燥综合征诊断中的价值
ｌ４ ｏ ３ ６ ０吉 林 省 临 江 市 医 院 １０ ２ ３ ０ １吉 林 省 人 民 医 院 摘 要 目的 ： 了解 抗 Ｍ Ｒ 抗 体 、 ３ 抗 一
组 ｜单独～ 种抗体 的敏 感性 有所提 高 ｝ Ｉ
胞＋－ 白抗 体 、 Ｓ Ａ抗 体 、 Ｓ Ｂ抗 体 Ｊ 蛋 抗 Ｓ 抗 Ｓ
检 测在 原发 性干 燥综 合征 （ Ｓ ） 断 中 ＰＳ 诊
的价值 。方 法： 测 ８ 检 ８例 Ｐ Ｓ 患 者 ，４ Ｓ ３
试 剂 和测 定 方 法 ： Ｍ３ 抗 Ｒ抗 体 试 剂
盒 ｆ 中国科 学 院广州生 物 医药健康 研究 ｆ ｊ 院提供 ， 采用免疫 印记法检 测。抗 ｏ一胞 ｒ ． 衬蛋 白抗 体试 剂 盒 由德 国 Ｂ Ｌ公 司提 供 采用 酶联 免 疫 法 （ ＬＳ 检 测。抗 Ｓ Ａ Ｅ ＩＡ） Ｓ
抗 体 、 Ｓ Ｂ抗 体 试 剂 盒 由 德 国 欧 蒙 公 抗 Ｓ 司提 供 采 用 免 疫 斑 点 法 。每 种 检 测 都 严
例 其他 风湿病 患者及 ３ ０名健 康对照血 清
中抗 Ｍ Ｒ抗 体 、 Ｏ 一胞 衬 蛋 白抗 体 、 ３ 抗 ｒ ． 抗 体 Ｓ Ａ抗 体 、 Ｓ Ｂ抗 体 ， Ｓ 抗 Ｓ 比较 四 种 抗 体
有统计学 意义 （ Ｐ＜０ ０ ） 特 异性没有 统 ．５ ， 计学意义 （ ００ ） Ｐ＞ ．５ 。结 果见 表 ３ 。
讨 论 ２０ ０ １年 Ｂ ｃ ａ ａｍ ｎ等 首 次 报 道 用 人 工 合 成 的 Ｍ３的 ２ ５肽 及 鼠眶 外 泪 腺 泡 细 胞 膜 提 取 物 为 抗 原 ， Ｅ ＩＡ 方 法 在 有 于 用 ＬＳ
关键词
抗体
抗 Ｍ３ Ｒ抗 体
抗 Ｓ Ａ抗 体 Ｓ抗Biblioteka 仅一胞 衬 蛋 白 原 发
人体及动物生理学-第五章肌细胞收缩、心肌、平滑肌生理
★三联管triad：
骨骼肌的T管与其两侧的终池
2.肌原纤维及其肌丝的分子组成
1）粗肌丝thick filament 肌球蛋白(肌凝蛋白,myosin),属收缩蛋白
杆状部—朝向M线成主干 头部—横桥cross-bridge :
可与肌动蛋白可逆性结合, 具有ATP酶活性 2）细肌丝thin filament (构成主干)
AP在运动神经纤维上的传导 N-M接头处兴奋的传递
AP在骨骼肌cell上的传导（局部电流） 骨骼肌的兴奋收缩耦联
骨骼肌的肌丝滑行收缩
(一)神经—骨骼 肌接头处兴奋的 传递
neuromuscular transmission
1.神经肌接头(neuromuscular junction) 的结构：
⑴接头前膜prejunctional membrane: ①突触囊泡synaptic vesicle,内含ACh; ②电压门控Ca2+通道；
速度(Vmax)。
图B:张力－速度曲线
既产生张力，又 出现缩短，且每 一收缩开始后， 张力不再增加， 故为等张收缩
等长收缩
P0—— 产生最大张力 而不出现缩短 W=0
Vmax—— 后负荷为零时， 产生最大缩短速 度 W=0
曲线最弯处—— W最大
*肌肉收缩的缩短速度:取决于横桥周 期的长短； *肌肉收缩的收缩张力：取决于每一瞬 间与肌动蛋白结合的横桥的数目。
(注：肌肉收缩或AP频率与刺激频率有关)
1)运动单位及其总和
① motor unit:一个脊髓前角运动神经元及 其轴突分支所支配的全部肌纤维。
②motor unit summation:大小原则
★ 3、ACh的分解： ACh在刺激终板膜产生终板电位的同时，
乙酰胆碱对心肌和平滑肌的生理作用机制
第31卷第2期 唐山师范学院学报 2009年3月 Vol. 31 No. 2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2009 ────────── 收稿日期：2008-12-23作者简介：郑素玲（1962-），女，河北唐山人，唐山师范学院生物系副教授，研究方向为动物生理。
-75-乙酰胆碱对心肌和平滑肌的生理作用机制郑素玲1，王淑元2，王亚亚1（1.唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000；2.唐山市第三十八中学，河北 唐山 063000）摘 要：乙酰胆碱（acetylcholine. Ach ）对心肌和胃肠道平滑肌的生理效应差异显著，Ach 引起心肌产生负性的变时、变力、变传导反应，却使胃肠平滑肌兴奋收缩；心肌和胃肠道平滑肌分布着多种Ach 受体，心肌的主要功能受体为M 2，胃肠平滑肌的主要功能受体为M 3。
关键词：乙酰胆碱：毒蕈碱：M 受体：G 蛋白 中图分类号： R 962文献标识码：A文章编号：1009-9115(2009)02-0075-02Physiological Mechanism of Acetylcholine on Myocardial and Smooth MuscleZHENG Su-ling 1, WANG Shu-yuan 2, WANG Ya-ya 1(1. Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan Hebei 063000, China;2. No.38 Middle School of Tangshan, Tangshan Hebei 063000, China)Abstract: Significantly different physiological effects of acetylcholine on cardiac and gastrointestinal smooth muscle were found. Acetylcholine caused negative inotropic, chronotropic, dromotropic response in myocardial acetylcholine, while casused excitation and contraction in gastrointestinal smooth muscle. A variety of M-receptors distributed in myocardial and gastrointestinal smooth muscle. The major functional receptor was M 2 receptor in myocardium and M 3 receptor in gastrointestinal smooth muscle.Key words: acetylcholine; Muscarine; M-receptor; G-protein1921年Otto Loewi 发表了经典的双心实验，第一个清楚地证明了迷走神经释放的化学物质对突触传递的化学介导作用[1]。
乙酰胆碱对心肌和平滑肌的生理作用机制
ｓ ｏｈｍｕｃｅＴ ｅ ｊｒｕ ｃｉｎｌｅｅｔｒ ａ ｃｐｏ ｏａｄｕ ｎ ｃｐｏ ａｔ ｉｔ ｔ ａ ｓ ｏｈｍｕｃｅ ｍｏｔ ｓｌ ｈ ｏ ｎｔ ａ ｒｃｐｏ ｓ ｒ ｅｔｒｎ ｃ ｒｉｍ ａｄＭ３ｅｅｔｒｎｇｓ ｏｎｅ ｉ ｌｍｏ ｔ ｓｌ ． ｍａ ｆ ｏ ｗ Ｍ２ｅ ｉｍｙ ｒ ｉ ｒ ｓｎ ．
ＺＨＥ Ｇ ｕ １ ｇ Ｗ ＡＮＧ ｈ ．ｕ ｎ ， ＡＮ Ｇ Ｙ ． ａ Ｎ Ｓ ．ｉ ’ ｎ Ｓ ｕ ｙ ａ Ｗ ａｙ
，
（ ． ｅ ａｔ ｎ ｏ ｉ ｃ ｎ ｅ Ｔ ｎ ｓ ａ ｅ ｃ ｅｓ ｏｌ ｅ Ｔ ｎ ｓ ａ ｅ ｅ ０ ３ ０ ， ｈｎ ； １Ｄ ｐｒ ｍｅ ｔ ｆ ｆ Ｓ ｉ ｃ ， ａ ｇｈ ｎ ａ ｈ ｒ Ｃ ｌ ｇ ， ａ ｇ ｈ ｎＨ ｂ ｉ ６ ０ ０ Ｃ ｉ Ｌ ｅ ｅ Ｔ ｅ ａ
这也可能是其与通道紧密联系的某些未知的调节蛋白发生作用的结果71m2受体被认为是通过gs蛋白抑制腺苷酸环化酶使camp生成减少导致蛋白激酶的活性下降从而使心肌细胞膜上ca2传导下降由于心肌细胞的收缩对细胞外液的ca2浓度具有依赖性故ca2内流的减少使心脏收缩力i绛低sl
第 ３ 卷第 ２期 １
１３ ． ． ｌ Ｎｏ ２
关键词： 乙酰胆碱 ：毒蕈碱 ：Ｍ 受体 ：Ｇ蛋 白
中图分类号：Ｒ ６ ９２ 文献标识码：Ａ 文章编号： １０ －１５２ ０）２０ ７ ．２ ０ ９９ （０ ９０．０ ５０ ｌ
Ｐｈ ｓｏｏ ｉａ ｅ ｈａ ｉｍ ｆＡｃ ｔ ｌｈ ｌ ｅｏ ｙ ｃ ｒ ｉｌ ｎ Ｓ ｏ ｔ ｕ ｃｅ ｙ ｉｌｇｃ ｌ Ｍ ｃ ｎｓ ｏ ｅｙｃ ｏｉ ｎ Ｍ ｏ ａ ｄ ａ ｄ ｍ ｏｈ Ｍ ｓ ｌ ｎ ａ
细 胞 ，如 心 脏 、 胃 肠平 滑 肌 、瞳 孔 括 约肌 、消 化腺 等 。 目前 Ｍ 受 体 家族 已较 明确 地 按 药 理 分型 为 ＭＩ ，Ｍ２ ，Ｍ３ 。Ｍ４ ４ 等
乙酰胆碱对平滑肌细胞离子通道的作用及其信号转导机制
目外医学呼吸系境分册２００２年第２２卷第２期乙酰胆碱对平滑肌细胞离子通道的作用及其信号转导机制第一军医大学南方医院呼吸内科（广州５１０５１５）程仕虎综述罗雅玲审校忍ｓ６Ａ摘要乙酰胆碱作用于气管乎滑肌细胞上的毒簟碱受体引起离子通道的改变，通过第二信使的调节引起生理作用。
本文总结了近几年来有关Ａｃｈ对ＡＭＳＣ的Ｋ＋、Ｃａｚ＋、ａ一通道的作用，以及第二信使的调节过程。
关■词乙酰胆碱；离子通道；信号转导；平滑肌；第－－信使乙酰胆碱（ａｃｅｔｙｌｃｈｄｉｎｅ，Ａｃｈ）对气道平滑肌细胞（ａｉｒｗａｙｍⅪｏｔｈｍⅢｄｅｃｅｌｔ，ＡＳＭＣ）的作用是引起收缩，而对于离子通道的作用就不全是收缩作用。
钙通道、非选择性阳离子通道、氯通道对于艇ｍ贮的收缩或再次收缩起促进作用，钾通道的不同亚型的激活则抑制艇弧心的过度收缩，保护平滑肌细胞。
１Ａｅｈ对ＡＳＭＣ细胞离子通道的作用１．１Ｋ＋通道ＡＳＭＣ上主要有钙激活的Ｋ＋通道（Ｋｃａ），ＡＴＰ敏感的Ｋ＋通道（ＫＡＴｅ）和电压依赖的钾通道（Ｋｖ），不同的Ｋ＋通道亚型起着不同的作用。
１．１．１ＫｃａＭｕｒａｋｉ等【１１使用细胞贴附式膜片钳技术，在通过Ｂ七叶皂甙渗透的删Ｃ上记录的Ｋｃａ通道的活动。
提示：单个Ｋｃａ的活动是被Ａｃｈ和Ｐ物质以及作为第二信使的三磷酸肌醇所调控，经过细胞内的Ｃａｚ＋的释放而起作用。
ｗ“ｅ等…２用同样的方法在不同的平滑肌上刺激毒簟碱受体影响Ｋｃａ得出类似的结论，可能这个Ｋｃａ代表一个保护平滑肌细胞免受过度兴奋的机制。
Ｋｏｔｌｉｋｏｆｆ等川３用外面向外膜片钳模式在豚鼠ＡｓＭＣ上研究毒簟碱的激动剂对Ｋｃａ的作用时发现毒蕈碱受体的刺激对Ｋｃａ的传导也有一个直接的作用，通过Ｃａ２＋的运动妨碍它的间接激活，这种直接的效应已经通过膜片钳技术揭示出来了，细胞内Ｃａ２＋效应完全消失了，这种效应更象是保持去极化。
１．２ＫＡＴＰＳ｝ｌｄｄ∞【４Ｊ以分离大鼠的肺动脉环为材料，在兴奋和抑制的两个不同的信号转导路径，测量对激动剂的反应，结果产生不同的ｃＡＭＰ的数量。
药物化学第 10 章 拟胆碱和抗胆碱药物
复能 H2O
RO R'O
O P
OH
+
EH （活性）
老化 H2O
-O R'O
O P
E
老化
-O -O
O P
E
（无活性）
（无活性）
碘解磷定 (Pralidoxime Iodide)
. IN+ CH NOH CH3
µâ½âÁ׶¨
为有机磷农药解毒剂，能与有机磷酸酯类直接作用，结合成 无毒的化合物由尿中排出。但它仅对形成不久的磷酰化胆碱 酯酶有复能作用，对老化的磷酰化胆碱酯酶复能效果差。
抑制钙离子通道
缺乏特异性配基
孤儿受体
缺乏特异性配基
释放乙酰胆碱
治疗早老性痴呆症药物 治疗高血压
的开发
松驰骨骼肌
第一节 拟胆碱药（ Cholinergic Agents ）
拟胆碱药：具有与乙酰胆碱相似作用的药物
直接作用于胆碱受体的拟胆碱药
间接作用药（乙酰胆碱酯酶抑制剂）
1. 完全拟胆碱药
卡巴胆碱
（ Carbachol Chloride ）又名 氯化氨甲酰胆碱
， M 和 N 胆碱 受体作用均很强
，对平滑肌作用
强，临床用于降
低平滑肌张力，
治疗青光眼。
O H2N O
N+(CH3)3 . Cl-
卡巴胆碱
2. 毒蕈碱样作用拟胆碱药
匹鲁卡品：只有 M 样 作用而无 N 样作用
是 M1 受体的部分激动 剂和弱的 M2 受体拮抗 剂
缓解或消除青光眼的 各种症状。
H2O AChE
H2NCH2CH2OH serine decarboxylase
Me3N+ CH2CH2OH + AcOH Ch
5传出神经系统药
2．手术后腹气胀和尿渚留： 此药能兴奋 胃肠道平滑肌及膀胱逼尿肌，促进排气和排 尿。
3.阵发性室上性心动过速 通过其拟胆碱 作用减慢心率。
兴奋作用； (3)促进运动神经末梢释放Ach。
2 ．兴奋平滑肌 对胃肠道和膀胱平滑肌的 兴奋作用较强 。
对心血管、腺体、眼和支气管平滑肌的 作用较弱 。
[临床应用] 1．重症肌无力： 是一种自身免疫性神 经肌肉传递功能障碍的慢性疾病，其主要症 状是骨骼肌出现进行性肌无力，表现为眼睑 下垂，肢体无力，咀嚼和吞咽困难，严重者 可致呼吸困难。
(3) 调节痉挛 ： 用M受体激动药毛果芸香 碱时，环状肌上M受体兴奋，睫状肌的环形 纤维向瞳孔中心方向收缩，悬韧带松弛，晶 状体变凸，曲光度增加，从而使远距离物体 不能成像在视网膜上，故视远物时模糊不清， 只能视近物，称为调节痉挛 。 2．腺体： 本品吸收后，通过激动腺体的M 受体，使腺体分泌增加，以汗腺和唾液腺分 泌增加最为明显。
2．β肾上腺素受体（ β-R ），可分为3种亚型。 β1 -R ：主要分布于心脏、肾小球旁系细胞。 β2 -R ：主要分布于平滑肌、骨骼肌血管、肝等。
β3 -R ：主要分布在脂肪细胞。
（三）多巴胺受体 主要分布于肾、肠系膜、内脏血管平滑肌 。
（四）传出神经系统受体功能及其 分子机制
（ 1 ）M-R：属于G蛋白耦联R。MR 兴奋后与G蛋白耦联，激活磷酯酶C， 增加第二信使，即1,4,5-三磷酸肌醇 （IP3 ）、二酰基甘油（DAG），从 而产生效应。
受体：能与药物特异性结合，能传 递 信息和产生药理效应的细胞蛋白 组分。
药物对离体肠肌运动的影响
药物对离体肠肌运动的影响X X X（浙江中医药大学XXX（专业）XX（班级）XX（几组）XX（学号））摘要目的：观察NaOH、HCl、乙酰胆碱、肾上腺素、25℃的台氏液以及氧气对离体家兔肠肌运动的影响。
方法：采用微机生物信号采集处理系统和离体家兔肠肌标本制备方法，观察并记录到不同理化因素对离体家兔肠肌刺激之后其肠肌收缩情况，在每次刺激出现明显现象之后，要用换液冲洗。
结果：得到了NaOH、HCl、乙酰胆碱、肾上腺素、25℃的台氏液以及氧气这几个因素对离体家兔肠肌分别刺激之后其肠肌的收缩张力曲线。
结论：一定浓度的NaOH和乙酰胆碱促进肠肌的运动，一定浓度的HCl和肾上腺素能抑制肠肌的运动，温度降低先促进肠肌的运动，但马上又抑制肠肌的运动，缺氧能抑制肠肌的运动，但是在一定时间范围内复氧又能使肠肌运动水平恢复正常甚至高于正常关键词：离体肠肌；HCl; NaOH; 乙酰胆碱；肾上腺素；台氏液；缺氧；复氧。
1.材料和方法1.1 实验动物：家兔（由浙江中医药大学动物实验中心提供）1.2 实验器械：实验仪器麦氏浴槽、超级恒温器、张力换能器、微机生物信号采集处理系统、空气泵、固定器、铁支架、家兔手术器械。
1.3 药品和试剂：台氏液、一定浓度的乙酰胆碱、一定浓度的肾上腺素、一定浓度的NaOH、一定浓度的HCl。
1.4实验系统连接和参数设置把台式液加在恒温器中加热并保持到37℃左右，然后在麦氏浴槽中加入一定量的37℃左右的台式液。
通气管接95%O2+5%CO2混合气体。
用换能器输出线接微机生物信号处理系统第一通道，然后在电脑上进入RM6240系统，选择“实验”菜单中的“不同药物对家兔离体肠肌运动的影响”。
1.5离体家兔肠肌制备：取家兔1只，用木槌击其头部，立即剖开腹腔，找到十二指肠，剪取十二指肠空肠约20cm，置于台氏液中，沿肠壁除去肠系膜，用注射器吸取台氏液将肠内容物冲洗干净，然后穿线结扎2cm左右肠肌两端。
1.6标本固定：肠肌一端连线系于浴槽固定钩上，然后放入38℃麦氏浴槽中。
M、N、α、β受体详解
前言：学习医学的学生们经常弄混这些问题，所以我给大家提够一个详细的资料，希望大家自己以后注意点！1. M受体的分布:主要分布于胆碱能神经节后纤维所支配的效应器，如心脏、胃肠平滑肌、膀胱逼尿肌、瞳孔括约肌和各种腺体。
M受体家族可分为5种亚型，较为公认的是M1、M2、M3三种亚型。
2.N受体的分布：N受体根据分布不同，分为NM（nicotinic muscle, 或称N2受体）受体和NN（nicotinic neur, 或称N1受体）受体。
NM受体分布于神经肌肉接头（骨骼肌细胞膜），NN受体分布于神经节。
N受体位于神经节与神经肌肉接头的胆碱受体对烟碱较为敏感，故将之称为烟碱受体或者N 受体。
N受体胆碱亚型根据其分布部位不同可分为：神经肌肉接头N受体，即NM受体（nicotinic muscle）受体（又称N2受体）及神经节N受体（又称N1受体）。
神经N受体与中枢N受体又称NN受体（nicotinic neuronal）受体M受体是毒蕈碱型受体（muscarinicreceptor）的简称,广泛存在于副交感神经节后纤维支配的效应器细胞上。
当乙酰胆碱与这类受体结合后，可产生一系列副交感神经末梢兴奋地效应，包括心脏活动的抑制 (血压下降、心率下降) ，支气管平滑肌、胃肠道平滑肌、膀胱逼尿肌和瞳孔括约肌的收缩，以及消化腺分泌增加等。
这类受体也能与毒覃碱结合，产生类似的效应。
近年发现M 受体有五种亚型，M1受体主要分布于交感节后神经和胃壁细胞，受体激动引起兴奋和胃酸分泌；M2受体主要分布于心肌、平滑肌，激动引起心脏收缩力和心率降低；M3受体主要分布于腺体和血管平滑肌，引起平滑肌松弛和腺体分泌。
M4 和M5尚未找到与之相对应的药理学分型。
M1、M2、M3这三种受体均有各自的选择性激动剂和拮抗剂，阿托品对这三种M受体均可阻断。
α受体又称“α型肾上腺素能受体”。
能与交感神经节后纤维释放的递质、去甲肾上腺素和肾上腺素结合的受体之一。
乙酰胆碱信号转导途径
毒蕈碱样乙酰胆碱受体介导的信号转导途径
• 毒蕈碱样乙酰胆碱受体(muscarinic acety-lcholine receptors,MAChRs，简称M受体)在中枢神经系统参与运动 控制、体温调节、心血管调节和记忆等过程，在周围神经 系统介导平滑肌收缩、腺体分泌，以及心率、心肌收缩力 的调节。M1组受体主要通过Gq/11(对百日咳毒素、霍乱毒 素不敏感的G蛋白)激活蛋白激酶C,使膜结合的磷酯酰肌醇 4,5-二磷酸(PIP2)分解为肌醇1,3,4-三磷酸(IP3)和甘油二酯 (DG);也可通过Gs激活腺苷酸环化酶，引起平滑肌收缩，腺 体分泌等效应。M2组受体与Gi/Go(对百日咳毒素不敏感、 霍乱毒素敏感的G蛋白)偶联，抑制腺苷酸环化酶，使 cAMP水平下降，蛋白激酶A(PKA)活性降低，产生抑制性效 应，心脏收缩力降低就是通过此途径产生的。
乙酰胆碱受体种类
乙酰胆碱受体可分为毒蕈碱型和烟碱型两类。毒蕈碱型乙 酰胆碱受体属于G蛋白偶联受体，烟碱型乙酰胆碱受体(nAChＲ) 是配体门控离子通道半胱氨酸家族的典型成员，其中包括甘氨 酸，γ-氨基丁酸(GABA-A和GABA-C)，和五羟色胺(5-HT3)受体。 nAChＲ可分为神经型和肌肉型两类。神经型乙酰胆碱受体 包含α（α2-α10）和β（β2-β5）两种亚基，其中α亚基含邻位半 胱氨酸，β亚基不含临位半胱氨酸。肌肉型nAChＲs的亚基组成 略有不同，，δ，γ和ε。 nAChR又可分为中枢型和外周型。在中枢神经系统中分布最 多的是α4β2和α7两种受体亚型，其中α4β2几乎在整个神经系统 都有分布而α7亚型只在大脑皮层，下丘脑和海马及一些脑干核 团中出现。
研究进展
• 尽管乙酰胆碱信号转导途径的研究已经积累了大量的 数据，但从认识AChR激动后所发挥的作用到作用机制的探 讨以及最终确定精确的治疗各种疾病的靶位并开发新的毒 蕈碱和烟碱类化合物还有大量的工作要完成。除此以外， 同样重要的是了解不同亚型的AChR在信号转导中所扮演的 角色。这些工作对于相关疾病的病理研究以及药物的研发 是极其重要的。
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ｐ．３８、ｏ【．ＳＭＡ、Ｒａｃｌ和ｐ－ｐ３８一抗，洗膜后加入辣根过 氧化酶标记的二抗，１３－ａｃｔｉｎ为内参；增强型化学发光 试剂（ＥＣＬ）发光法检测蛋白表达，以Ｇｅｌｐｒ０３２软件分 析蛋白。 ５．Ｒａｃｌ活性测定：Ｒａｃｌ活性检测采用ＧＳＴ Ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ试剂盒进行检测，细胞处理后用试剂盒中提 供的裂解缓冲液进行裂解。等量的细胞裂解液与
ＧＳＴ—ＣＲＩＢ
４℃孵育９０ ｍｉｎ。重悬液用Ｒａｃｌ单克隆抗
体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。 ６．统计学方法：数据采用均数±标准差（元±ｓ）表
示，应用Ｇｒａｐｈｐａｄ
Ｐｒｉｓｍ
ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８）是介导炎性反应 的重要信号转导通路，Ｄｉｃｋｓｔｅｉｎ等旧。研究结果显示ＭＩ 后梗死周围ｐ３８信号被激活，氯沙坦通过阻断ｐ３８信 号通路明显改善ＭＩ后心室重构的发生。小Ｇ蛋白 Ｒａｃｌ是一具有三磷酸鸟苷（ＧＴＰ）水解酶活性的单体
１０～ｍｏＬ／Ｌ ６，２
比１．７１４ ４－０．１０３；Ｐ＜０．０５）；与Ａｃｈ干预组比较，给予
ｐ３８特异性抑制剂ＳＢ２０３５８０（５斗ｍｏＬ／Ｌ）预处理３０
３０
ｍｉｎ）明显拮抗Ａｃｈ（１．０×１０～ｍｏＬ／Ｌ）介导Ⅱ一ＳＭＡ
表达上调作用（２．５３４±０．２４１比１．４３２±０．０９３。Ｐ＜
１．材料：抗ｐ３８、磷酸化ｐ３８（ｐ－ｐ３８）、Ｒａｃｌ和 仅一ＳＭＡ抗体（Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
０．０５）；表明Ｍ３Ｒ促进ｏ【一ＳＭＡ的表达上调。 ２．ｐ３８参与Ｍ３Ｒ对仅一ＳＭＡ的表达调节：与对照组 比较，Ａｃｈ（１．０×１０～ｍｏＶＬ，２ ｈ）对ｐ３８的表达无明 显影响（１．３７±０．２２比１．０３±０．１９；Ｐ＞０．０５），但显 著促进ｐ－ｐ３８的表达（１．７１４±０．１０３比１．０６１±
万方数据
虫堡塞坠处型盘盍！Ｑ！！生！旦星！！鲞筮！塑堡！ｉ！』垦！Ｐ！些坚，垒！耻塾！！！！：！堂：！！：塑！：！
・１９５１・
心室重构是心脏对心肌梗死（ＭＩ）后血流动力学 改变的一种代偿性反应过程，伴有心肌纤维化的发生， 心脏成纤维细胞活化是心肌纤维化最主要的始动因 素，心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞是其中一个 重要机制，ｄ．平滑肌肌动蛋白（０【一ＳＭＡ）为成纤维细胞 向肌成纤维细胞表型转化的重要客观指标…。肌成 纤维细胞具有更强的增殖、迁移及合成细胞外基质能 力，通过分泌大量的生长因子和细胞因子作用于心肌 组织中的各种靶细胞，从而进一步推动心室重构的发 展，并最终导致心力衰竭。Ｍ３型乙酰胆碱（Ａｃｈ）受体 （Ｍ３Ｒ）是毒蕈碱Ａｃｈ受体的一个亚型，研究结果显示 慢性阻塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）患者机体内Ｍ３Ｒ参与呼 吸道收缩，腺体分泌和呼吸道重构，促进呼吸道ｄ－ＳＭＡ 的表达旧Ｊ，但Ｍ３Ｒ是否参与ＭＩ后心室重构的发生尚
ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ０【一ＳＭＡ．ｐ３８ ｍｉｔｏ— ｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅｓ（ｐ３８），ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐ３８（Ｐ—ｐ３８）ａｎｄ
二喹啉甲酸（ＢＣＡ）蛋白定量试剂盒（Ｔｈｅｒｍｏ公司）；
Ｒａｃｌ活性检测谷胱甘肽巯基转移酶沉淀实验（ＧＳＴ Ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ）试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ公司）。 ２．实验分组：采用随机数字表法，对细胞进行分 组：对照组（Ｃ组）不做任何处理，不同浓度Ｍ３Ｒ激动 剂Ａｃｈ干预组［１．０×１０一ｍｏＬ／Ｌ，２ ｈ（Ｍ５组）、１．０×
未清楚。
３．心脏成纤维细胞分离培养：按照文献［５］方法 分离培养心脏成纤维细胞，实验采用第３代细胞，经无 血清培养２４ ｈ后，进行干预。
４．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法测定ｐ一３８、ｐ－ｐ３８、Ｒａｃｌ和
仅一ＳＭＡ：提取各组蛋白样品，ＢＣＡ蛋白定量试剂盒进行
蛋白定量；经过电泳、转膜、５％脱脂奶粉封闭；加入
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００２２，Ｃｈｉｎａ （ＤｕＸＬ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｊｉｎｇ Ｗｕ，Ｅｍａｉｆ：ｗｕ２００６ｊｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍ３
ｗａｓ ｘ
ｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １（ＲａｃＩ）．Ｒａｅｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｘ
ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＧＳＴ Ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ ａｓｓａｙｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ａｃｅｔｙｃｈｏｌｉｎｅ（１．０ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ａｎｄ ｔｈｅ
１０一，１．０
１０～，１．０×１０～ｍｏｌ／Ｌ，２ ｈ）ｐｒｏｍｏｔｅｄ ０【一ＳＭＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｏｆ
（Ｊｉａｏ
ＺＹ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｗｅｎ
Ｂ，凡ＧＷ，Ｚｈａｏ ＷＺ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，ｔｈｅ
４５００５２，Ｃｈｉｎａ（Ｗｕ Ｊ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００５２，Ｃｈｉｎａ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｖ，Ｕｎｉｏｎ
ｏｎ
ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ
ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（ｏｒ．一ＳＭＡ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｍ３Ｒ） ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ
Ｒａｓ—ｒｅｌａｔｅｄ Ｃ３ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘ— Ｍ３Ｒ ａｇｏｎｉｓｔ
・１９５０・
主垡塞坠处型苤查！！！！生！旦筮！！鲞箜！塑￡！也』垦翌！！监：△！鲤！！！！！！：ｙ！！：！！：№：！
・胸一心夕卜科・
Ｍ３型乙酰胆碱受体对心脏成纤维细胞 ｏＬ一平滑肌肌动蛋白的表达及机制
焦周阳 吴静 刘超
文冰付国伟
杜心灵赵文增
作者单位：４５００５２郑州大学第一附属医院心血管外科（焦周阳、刘超、文冰、付国伟、赵 文增），儿科（吴静）；４３００２２武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科
（杜心灵） 通信作者：吴静，Ｅｍａｉｌ：ｗｕ２００６ｊｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．０８．０２０
【摘要】
目的
探讨Ｍ３型乙酰胆碱受体（Ｍ３Ｒ）对心脏成纤维细胞０【一平滑肌肌动蛋白
（０【一ＳＭＡ）的表达影响及其机制。方法体外分离培养大鼠心脏成纤维细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法测定 ０【－ＳＭＡ、ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８）、磷酸化ｐ３８（ｐ－ｐ３８）和Ｒａｓ相关ｃ３肉毒素底物１（Ｒａｃｌ）的 表达；谷胱甘肽巯基转移酶沉淀实验（ＧＳＴ Ｐｕｌｌ．ｄｏｗｎ）法检测Ｒａｃｌ的活性。结果
１０～、１．０
ｘ
乙酰胆碱（１．０
ｘ
１０～、１．０
ｘ
１０
ｍｏＬ／Ｌ，２
ｈ）呈浓度依赖性促进仅一ＳＭＡ的表达上调（Ｐ＜０．０５），Ｍ３Ｒ特异
性阻断剂４一二苯乙酰氧基一Ｎ一甲基一哌啶（４一ＤＡＭＰ）抑制乙酰胆碱（Ａｅｈ）介导的ｏｔ—ＳＭＡ表达上调 （１．４３２±０．０９３比２．５３４±０．２４１，Ｐ＜０．０５）；Ｍ３Ｒ促进ｐ－ｐ３８表达上调（１７１％，Ｐ＜０．０５），ｐ３８特异 性抑制剂ＳＢ２０３５８０抑制Ｍ３Ｒ介导的ｏｔ—ＳＭＡ表达上调（１．６１４±０．１２８比２．８７３±０．１９３，Ｐ＜０．０５）； Ｍ３Ｒ活化Ｒａｃｌ（１８２％，Ｐ＜０．０５），Ｒａｃｌ特异性抑制剂ＮＳＣ２３７６６抑制Ｍ３Ｒ介导的ｐ－ｐ３８表达上调 （１．３０１±０．１５４比１．８２１±０．１１３，Ｐ＜０．０５）。结论Ｍ３Ｒ通过激活Ｒａｃｌ一ｐ３８信号通路促进心脏成 纤维细胞０【一ＳＭＡ的表达。
【关键词】
Ｍ３型乙酰胆碱受体；
ｄ．平滑肌肌动蛋白；ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶；
Ｒａｓ相
关Ｃ３肉毒素底物１ 基金项目：国家自然科学基金（８１３００６８５）
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆⅣ【３ ｍｕｓｅａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ａｅ ｏｎ
ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ—ａｃｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉ．
材料与方法
浓度依赖性促进仅一ＳＭＡ的表达，分别给予Ａｃｈ
１０～、１．０×１０～、１．０×１０。５
１．０×
ｍｏ］／Ｌ后０１．ＳＭＡ表达为：
１．９３４±０．１３２、２．５３４±０．２４１、３．０９８±０．３９８，与对照 组（１．０２１±０．０８９）比较明显上升（Ｐ＜０．０５）；Ｍ３Ｒ特 异性阻断剂４－ＤＡＭＰ（１．０×１０～ｍｏＬ／Ｌ预处理
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
Ｊｉａｏ Ｚｈｏｕｙａｎｇ，Ｗｕ ｒｉｎｇ，Ｌｉｕ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ｃｈｎｏ，耽ｎ
Ｂｉｎｇ，Ｆｕ Ｇｕｏｗｅｉ，
Ｄｕ Ｘｉｎｌｉｎｇ，Ｚｈａｏ Ｗｅｎｚｅｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，ｆｋ
Ｆｉｒｓｔ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
１．８２１±０．１１３．Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｈｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ Ｍ３Ｒ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｆｔ．一ＳＭＡ ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｖｉａ Ｒａｃｌ—ｐ３８ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｍ３ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｅ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ；ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃ— ｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ：Ｒａｓ—ｒｅｌａｔｅｄ Ｃ３ ｂｏｔｕｌｉｎｕｒｅ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １ Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（８１３００６８５）