皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建
东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化
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毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用[发明专利]
![毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2980e57f2f3f5727a5e9856a561252d380eb20bb.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711340835.1(22)申请日 2017.12.14(71)申请人 华中科技大学地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号(72)发明人 闫云君 焦梁成 周清华 宿智新 乔阳歌 杨凯欣 (74)专利代理机构 华中科技大学专利中心42201代理人 许恒恒 李智(51)Int.Cl.C12N 15/81(2006.01)C12N 15/66(2006.01)(54)发明名称毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用(57)摘要本发明公开了毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与运用，属于微生物基因工程领域。
本发明毕赤酵母基因敲除的模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒以及两端的lox71和lox66特异性重组酶识别位点和博来霉素抗性基因表达盒；本发明毕赤酵母基因抗性基因回收载体包括利用毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒、利用GAP启动子组成型表达的cre基因表达盒和HygB抗性基因表达盒。
本发明极大地提高了毕赤酵母基因的敲除效率。
本发明提供了基因敲除后抗生素标记回收的方法，为多基因的高效敲除提供了极大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。
权利要求书3页 说明书10页序列表5页 附图4页CN 108004264 A 2018.05.08C N 108004264A1.一种毕赤酵母基因敲除的模板载体pAOXZ-mazf，其特征在于，该模板载体包括毕赤酵母甲醇型启动子AOX1调控的mazf基因表达盒和博来霉素抗性基因表达盒；所述mazf表达盒的5’端含有用于插入待敲除基因下游同源片段的酶切位点A，该酶切位点的5’端含有Cre特异性重组系统识别的lox66位点；所述mazf表达盒的3’端含有用于插入待敲除基因上游同源片段的酶切位点B，该酶切位点的3’端含有Cre特异性重组系统识别的lox71位点；所述博来霉素抗性基因表达盒位于所述lox66位点的5’端与所述lox71位点的3’端之间；所述酶切位点A和酶切位点B为不同的酶切位点，且酶切位点A和酶切位点B在所述模板载体上唯一存在。
皮蝇素A基因的克隆与序列分析
畜牧 兽 医杂 志
第２ ６卷
第６ 期
； 验｛ 试
皮 蝇 素 Ａ 基 因 的 克 隆 与 序 列 分 析
王艳 华 殷 ， 宏 罗 建 勋 蒋 锡 仕 。张德 林 ， ， ，
｝ 研究ｉ
。， 、 ．１ ． ．、‘ 医研究所 家 畜疫 病病 原生物 学 国家 重点 实验 室 ； １中
克隆载 体 Ｐ Ｅ Ｇ Ｍ— ＨＡ， 转化 大肠 杆 菌 Ｊ ０ ， Ｍ１ ９ 筛选 阳性克 隆 ， 进行 测序 与分析 。结 果表 明， 增的 扩
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甘肃省 动物 寄生虫 病重点 实验室 ， 甘肃 兰州 ７ ０ ４ ；． ３ ０ ６ ２ 西南 民族 大学 ）
摘 要 ： 首先提 取 采 自甘 肃玛 曲的皮 蝇一 期 幼 虫的 总 Ｒ ＮＡ， 成 ｃ ＮＡ， 据 设计 的特 异 引物 ， 合 Ｄ 根 利
用 Ｐ Ｒ 技 术 扩 增 出 Ｈｙ ｏ ｅｍ ｎＡ（ＨＡ） 因 片段 ， 此 片 段 与 Ｐ Ｍ — Ｔ Ｅ ｓ Ｃ ｐ ｄ ｒ ｉ 基 将 ＧＥ ａｙ载 体 连 接 ， 建 构
因序 列核甘 酸 同源性为 ９ ． ， 导氨基 酸 同源性达 ９ ． 。该基 因的成功 克 隆为其进 一步表 达 ６６ 推 ７８
打 下 了 坚 实 的基 础 。
关 键词 ： 皮蝇 ；Ｈｙ ｏ ｅｍｉ 基 因；克 隆 ； 列分析 ｐ ｄ ｒ ｎＡ 序 中图分 类号 ：８ ３ ３ ￥ １ ． 文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ： ｏ ４６ Ｏ （ｏ ７ Ｏ 一 ０ １Ｏ １ ０ —７ ４ ２ ０ ） ６ｏ Ｏ 一３
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的开题报告
IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的
开题报告
一、研究背景及意义
癌症、自炎症和感染等都会引发炎症反应，而炎症反应的过度也会导致一系列的疾病。
因此，控制炎症反应就成为相关疾病治疗的关键。
白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）作为人体的天然抗炎因子，具有多种抗炎和抗癌作用，而且没有明显的副作用，被广泛应用于临床治疗。
因此，对其进行研究有利于新型治疗药物的开发。
在本研究中，旨在将IL-1Ra与人血清白蛋白（HSA）融合，并在毕赤酵母中高效表达，以便更好地应用于各种疾病的治疗。
二、研究内容及方法
1.基因克隆：采用PCR方法以人源IL-1Ra和HSA为模板，通过引物设计扩增出IL1Ra-HSA融合基因，并进行双酶切后，将其连接到表达载体pPICZαA中。
2.毕赤酵母转化：将连接成功的重组质粒转化到毕赤酵母中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，筛选出高效表达的毕赤酵母菌株。
3.表达条件优化：通过对毕赤酵母菌株的不同发酵条件的比较，寻找最适合的表达条件，从而提高表达效率。
4.纯化和鉴定：采用亲和层析等方法对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，测定其生物活性和纯度。
三、预期成果及意义
1.成功将IL-1Ra与HSA融合，并通过PCR克隆到毕赤酵母中。
2.筛选出高效表达的毕赤酵母菌株，并通过表达条件优化提高其表达效率。
3.成功对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，并测定其生物活性和纯度。
4.为进一步研究IL-1Ra在临床应用中的新型治疗策略提供了基础研究支持。
人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建
人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建索剑飞;雷雪芹;徐廷生;赵绍杰;韦光辉【期刊名称】《河南科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(031)002【摘要】从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank 公布的序列一致.Hind III和BamH I双酶切pUC57-INS 后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功.这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础.【总页数】4页(P77-80)【作者】索剑飞;雷雪芹;徐廷生;赵绍杰;韦光辉【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学第二附属医院,河南,洛阳,471003;河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471003【正文语种】中文【中图分类】Q782;Q819【相关文献】1.人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄2.人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用 [J], 孙玉英;奚永志;王丽英;崔建武;刘楠;梁飞3.人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 李文涛;周闯;赵永福;马秀现;张水军4.狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建[J], 李江涛;殷相平;柳纪省;李宝玉;李学瑞;杨彬;兰喜;胡永浩5.PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建 [J], 李俊;王金宝;袁小远;崔尚金;李曦;符芳;周艳君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达及其应用[发明专利]
专利名称：牛皮蝇素A（HA）在毕赤酵母系统中的表达及其应用
专利类型：发明专利
发明人：孙怡,徐梅倩,何国声,张大兵,梁婉琪,朱顺海,曹杰,严凤,黄燕
申请号：CN200410067653.8
申请日：20041029
公开号：CN1664097A
公开日：
20050907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了牛皮蝇素A(HA)在毕赤酵母系统中的表达及其应用，本发明中酵母表达载体为pPIC9k－HA，表达载体转化的能表达牛皮蝇素A(HA)的毕赤酵母菌株为GS115/pPIC9k－HA。
毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k－HA生产牛皮蝇素A(HA)的方法为：先进行细胞培养与蛋白诱导分泌；再进行表达产物的纯化。
本发明中用毕赤酵母表达牛皮蝇素A蛋白，并用FPLC阴离子交换层析的方法分离纯化HA，这是一种低廉且产量高的表达HA的方法，且毕赤酵母可快速利用培养基中的碳源，稳定复制基因组中的DNA，采用高密度连续培养，蛋白产量高，它除含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能等优点外，同时也具有原核表达系统方便、简单和价廉等优点。
所得产物应用于牛皮蝇蛆病免疫诊断和免疫预防。
申请人：中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所
地址：200232 上海市徐汇区石龙路345弄3号
国籍：CN
代理机构：上海东亚专利商标代理有限公司
代理人：杜林雪
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一种强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其构建方法与应用
一、概述乳铁蛋白是一种存在于哺乳动物乳汁中的重要蛋白质，具有丰富的营养价值和生物活性。
其在免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病毒等方面具有重要作用，因此受到了广泛的关注。
而毕赤酵母是一种常见的真菌微生物，可以被用于多种重要蛋白的表达和生产。
构建一种强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母具有重要的研究意义和应用价值。
二、毕赤酵母的特点1. 毕赤酵母的生物学特性毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种酵母，通过改良的形态和工程学技术，可以高效表达和分泌异源蛋白，其优点包括a. 生长速度快b. 表达异源蛋白能力强c. 分泌蛋白质的能力优秀2. 毕赤酵母在蛋白表达中的应用毕赤酵母在蛋白表达中应用广泛，主要包括医药、工业、生物学等领域。
通过毕赤酵母表达系统，可以实现对多种重要蛋白的高效表达和大规模生产。
三、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母构建方法1. 选择适合的毕赤酵母表达载体通过对不同毕赤酵母表达载体的筛选和比较，选取适合乳铁蛋白表达的载体。
2. 乳铁蛋白基因的克隆和插入通过PCR扩增、酶切、连接等分子生物学技术，得到乳铁蛋白基因的重组表达载体。
3. 转化和筛选将表达载体转化至毕赤酵母菌株中，进行筛选得到高效表达乳铁蛋白的毕赤酵母菌株。
4. 条件优化与表达通过调节培养基、温度、pH值等条件，优化乳铁蛋白的表达条件，提高其表达量和纯度。
四、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母的研究进展1. 表达量和纯度的提高通过使用不同的表达载体、优化表达条件等手段，可以显著提高乳铁蛋白的表达量和纯度，满足不同应用的需求。
2. 抗性因子的引入引入抗性因子可以提高毕赤酵母对特定抗生素的抗性，从而提高其在生产中的稳定性和可操作性。
3. 结构与功能分析通过结构生物学等技术手段对乳铁蛋白在毕赤酵母中的结构和功能进行深入研究，为其应用提供理论基础。
五、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母在食品、医药等领域的应用1. 食品领域强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母可以用于生产高营养价值的乳制品，如乳粉、奶酪等，提高其抗菌、抗氧化等功能。
美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达陈定虎;王锡锋;李莉;周广和【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2003(011)002【摘要】从美洲商陆(Phytolacca americana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachiapastoris)菌株GS115细胞.在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.【总页数】4页(P183-186)【作者】陈定虎;王锡锋;李莉;周广和【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】S4【相关文献】1.乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达 [J], 马忠辉;付洁;高新;杨焕民;宋海峰2.重组人神经生长因子真核表达载体构建及其在毕赤酵母中的表达与纯化 [J], 黄志立;蒋伟;周烨;沈丽;王妍3.毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较 [J], 周倩;王锡锋;李莉;周广和;高必达4.美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究 [J], 向莉;胡亚梅;张杰文5.哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK真核表达载体构建及在毕赤酵母中的表达 [J], 何超军;邱杨玉;毛芝娟;陈吉刚;吴志新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建
α文章编号:10083464(2003)01003704巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建韦宇拓,甘凤琼,苏华波,赵颖怡,汪嵘,黄日波(广西大学生物技术实验中心,广西南宁530005)摘要:巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pP I C I NU 是利用来源于克鲁维酵母(K luy vero m y ces m arx ianus )的菊粉酶基因信号肽DNA 序列(ISP )构建的。
表达实验结果表明,带有分泌表达载体pP I C I NU 的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌,具有与带有表达载体pP I C 9K (带有Α因子信号肽)的Β-1,3-1,4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。
关键词:巴斯德毕赤酵母;克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽;分泌表达;Α因子信号肽中图分类号:Q 782 文献标识码:ACon struction of a novel secreti ng expression vectors for P ich ia p astorisW E I Yu tuo ,GAN Feng qi ong ,SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi ,W AN G Rong ,HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter ,Guangx i U n iversity ,N ann ing 530005,Ch ina )Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r ,pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP )from K luy vero m y ces s m a rx ianu ,of P ich ia p astoris w as con structed .T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the beta1,31,4glucanase of recom b inan t P .p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P .p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying Αfacto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ;signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ;secreting ex 2p ressi on ;Α-facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中发现在克鲁维酵母(K luy vero m y ces m a rx ianus )中,大部分菊粉酶能被分泌到胞外,将其先导肽用在酿酒酵母中能促进多种外源蛋白分泌到胞外,分泌效率高于常用的Α因子信号肽[1]。
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牛皮 蝇蛆 病 是 由皮 蝇 科 、 蝇 属 的 牛 皮 蝇 和 蚊 皮 皮 蝇等 的幼虫 寄生 于牛 的背 部 皮下 组 织 而 引起 的一
进 行 扩 增 ， 应 体 系 是 ： 板 ｌ Ｌ， 游 引 物 反 模 上 １ ８ Ｌ， 游 引 物 １ ８ Ｌ， Ｃ ２ ． Ｌ， ＮＴＰ ． 下 ． Ｍｇ １２ ５ ｄ ０ ８ Ｌ， ０ ｕ ｆｒ ． Ｌ， 纯灭 菌水 ２ Ｌ， ａ ． １ ×ｂ ｆ ８ ｅ３ 超 ８ Ｔｑ
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关键 词 ： 蝇 素 Ａ； 隆 ； 皮 克 毕赤 酵母 表 达载 体
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Ｉ Ｓ ￣ ￣ ３ ０ ６ ２ 西 南 民 族 大 学 ， ｔ － Ｈ ７ ０ ４ ；． 四川 成都 ６ ０ ４ ） １ ０ １
Ｘ ａ Ｉ、 ｈ ｂ Ｘ ｏ Ｉ、 ａ Ｔ Ｄ Ｓ ｃ Ｉ、 ４ ＮＡ 连 接 酶 、 转 录试 反
剂 盒 、Ｃ Ｐ Ｒ试 剂盒 均 购 自 Ｐ ｏ ｇ ｒ ｍｅ ａ公 司 ； Ａ 片 段 ＤＮ 玻 璃奶 回收试 剂 盒 、 粒 快 速 提 取 试 剂 盒 购 自博 大 质 泰克公 司 ； ＮＡ ｒ ｅ Ｄ Ｍａｋ ｒ购 自宝 生 物 工 程 （ 连 ） 大 有
原进 行诊 断和 防 治 。 另外 ， 学 药 物 治疗 由于药 物 化 残 留等问题 亦具 有很 大 的局 限性 。为 巩 固牛皮 蝇 病 得 到控制 的成果 ， 组基 因 蛋 白就 显示 了它 的优势 。 重 皮蝇 素 Ａ（ ｐ ｄ ｒ ｎＡ， Ｈｙ ｏ ｅｍｉ ＨＡ） 皮 蝇 一期 幼虫 在 是 宿主 体 内移 行 阶段 分泌 的一 种 丝 氨 酸 蛋 白酶 ， 有 具 免疫 抑制 功 能 。 因此 ， ＨＡ 可 作 为 诊 断 或 免 疫 用 抗 原［ 。本研究 首 先 利 用 反 转 录一 合 酶 链 式 反 应 技 １ ］ 聚 术成 功克 隆皮蝇 ＨＡ 基 因 ， 将 ＨＡ 基 因 插 入表 达 再 载体 ｐ Ｉ Ｚ Ｐ Ｃ ａ中 ， 建 含 ＨＡ 基 因 的毕 赤 酵 母 真 核 构 １ １ ４ Ｐ Ｒ 引物 ． ． Ｃ Ｈｙ ｏ ｅｍｉ 基 因上游 引 物 ： ｐ ｄ ｒ ｎＡ
摘 要 ： 取 采 自甘 肃玛 曲皮 蝇 一期 幼 虫的 总 Ｒ 提 ＮＡ， 成 ｃ ＮＡ， 据设 计 的特 异 引物 ， 用 Ｐ Ｒ技 术 合 Ｄ 根 利 Ｃ
扩 增 出皮 蝇 素 Ａ（ ｐ ｄ ｒ ｎＡ ， Ｈｙ ｏ ｅｍｉ ＨＡ） 因 片 段 ， Ｘ ｏ Ｉ 、 ｂ 基 用 ｈ Ｘ ａ Ｉ消 化 ， 消 化 后 的 目的 基 因 ＨＡ 纯化 并 将
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动物 医学进 展 ，０ ７ ２ （ ） １ —８ ２ ０ ，８ ９ ：５１
Ｐｒ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｃ ｎｅ ｏｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄｉｉ
皮 蝇 素ห้องสมุดไป่ตู้Ａ 基 因 的 克 隆 及 其毕 赤 酵 母 表 达 载 体 的构 建
１ １ １ 虫 体样 品 甘 肃 玛 曲县 牦 牛 食 道 的纹 皮 蝇 ．．
一
期幼 虫 。
１１２ 菌 种 和 载 体 ．．
种 外寄生 虫病 ， 病 的主 要 特 征 是 引起 感 染 牛 的 产 本 奶 量和产 肉量 下 降 ， 肉质 下 降 ， 皮 穿 孔 等 ， 养 牛 牛 给 业 带来 了 巨大 的经 济损 失 。
限公 司 ； 琼脂 糖 购 自经科 公 司 ； 酵母 提 取物 和胰 蛋 白
近年 随着对 牛 皮 蝇蛆 病 的 控 制 ， 得 天 然 虫 体 胨 购 自 Ｕｎｐ ｔ ＴＤ Ｅ ｇａ ｄ公 司 。其他 常规试 剂 获 ｉａｈＬ ｎ ｌｎ 抗 原越来 越 困难 ， 很 大 程 度 上 限 制 了 依 赖 虫 体 抗 均 由国 内生产 。 在
１ ２ 方 法 ．
１２ １ 牛 皮 蝇 一 期 幼 虫 总 Ｒ ． ． ＮＡ 的 提 取 作按 试 剂盒 说 明书 进行 。
使 用 总
Ｒ ＮＡ 提 取试 剂 盒 ， 取 皮 蝇 一 期 幼 虫 总 ＲＮＡ。操 提
表达 系统 ， 为通 过毕 赤酵 母 细胞 表 达 ＨＡ 蛋 白奠定 了基础 ， 牛皮 蝇 蛆 病 免疫 诊 断 和 预 防提 供 科 学 依 为
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ＡＣ Ｔ ＧＡＣ Ｇ ３ ； 游 引 物 ：５－ 一 下 ＇ ＧＡＡ Ｃ ＡＧ ＴＣ Ｇ
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物工 程 （ 大连 ） 限 公 司合 成 。 有