方法学验证中各项指标的深度剖析——上海药检所

质量标准中制订有关物质的原则
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采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定， 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定， 如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。 如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
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采用强破坏试验破坏出杂质。 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧 氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟 氟沙星所有品种， 定了：取供试品溶液，置紫外灯下（ 定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照 小时以上， 射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与 主峰的分离度应符合规定。 主峰的分离度应符合规定。
青蒿琥酯 峰面积 10369600 10146525 10382388 10344541 10360386 10432888 0.96％ 百分比 99.26% 98.89% 98.58% 98.45% 98.33% 98.16%
杂质-2 峰面积 57511 55786 58098 59521 59172 59185 百分比 0.55% 0.54% 0.55% 0.57% 0.56% 0.56%
最小峰面积的设定
其设定，不是绝对值，而是相对值。 ● 其设定，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC ● 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用 法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。 法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。 普通样品测定时，通常为 普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓 （ 度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰 ）。如规定杂质限度为 度的 ）。如规定杂质限度为 ， 面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500 ，那么，最小峰面积可考虑设定为 面积为 左右。新药稳定性考核时，可设定到 的最小峰面积。 左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。 的最小峰面积 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见， ● 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见， 此点应予以重视。 此点应予以重视。
四、专属性
有关物质为主，其他检测项目（含量） 有关物质为主，其他检测项目（含量） 基本上均参照有关物质。 基本上均参照有关物质。 有关物质的验证，采用中间体和降解产 有关物质的验证， 确认结构后人工合成） 物（确认结构后人工合成）来验证与主成分 的分离。 的分离。
系统适用性试验的配制方法： 系统适用性试验的配制方法： 在100％浓度的主成分溶液中加 ％ 浓度的杂质对照品， 入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品 浓度的杂质对照品 中有可能存在的状态。 中有可能存在的状态。 介绍配制方法 —— 先配制杂质贮 备液，再用供试品溶液（ 备液，再用供试品溶液（或浓的对照 品溶液）来稀释，简便、易行！ 品溶液）来稀释，简便、易行！
160
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柺 愊 曐 帩 帪 娫 柺 愊 %
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120
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91708 5. 923 0. 86
m AU
110
110
59185 14. 626 0. 56
100
45002 22. 729 0. 42
100
90
90
80
10432888 8. 410 98. 16
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介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质， 要看主峰里是否有杂质，如何判 检测器的局限性， 断？但需注意DAD检测器的局限性， 但需注意 检测器的局限性 介绍“土办法”！ 介绍“土办法” 结果：目前从来没有推翻现行色 结果：目前从来没有推翻现行色 谱条件的。意义在哪里。如何应用， 谱条件的。意义在哪里。如何应用， 拿到只是“走形式” 拿到只是“走形式”？
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柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响， 显著，如有柱温箱， 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
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溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂； 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
● 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否 相同，即所谓重量校正因子的问题。（ 。（f=A杂质 被 杂质/A被 相同，即所谓重量校正因子的问题。（ 杂质 测成分） 测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。 ）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 ），这样可更加严格控制杂质的限度 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 ），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 应必须加入重量校正因子（ ），否则将得 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得 ）， 到错误的判断。 到错误的判断。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定 不能单从主成分入手！ 不能单从主成分入手！ 还要注意所有组分的百分比变化， 还要注意所有组分的百分比变化， 绝对值变化！ 绝对值变化！
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2:210 nm ,8 nm 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩昗 弨 梟 塼 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩昗 弨 梟 塼 0 2 - R e p 4
积分参数的设定
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积分参数的设定是非常重要的。 积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、 组成。 峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 采用自身对照法时， 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 设定得太小， 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰， 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。 又将反映不出杂质情况。
三、准确度试验 用回收率来衡量
作法： 间选择3点或 作法：在80%~120%间选择 点或 点， 间选择 点或5点 原因是由外标一点法决定的。 原因是由外标一点法决定的。 已知杂质、且有杂质对照品的，可采 已知杂质、且有杂质对照品的， 用加入法，即加样回收率来评价。 用加入法，即加样回收率来评价。 一般情况下，只要空白辅料无干扰， 一般情况下，只要空白辅料无干扰， 回收率均是良好的！ 回收率均是良好的！
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl μ 供试品溶液 对照溶液 最低检出量 5mg/ml 50μg/ml μ 1μg/ml μ 20μl 100μg μ μ 20μl μ 20μl μ 1μg μ 20ng 100%（5000 倍） （ 1% 0.02%
强力破坏试验
取原料适量，加水溶解后， 小时。 ● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置 小时。 ℃放置24小时 取原料适量， 过氧化氢溶液溶解后， ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 过氧化氢溶液溶解后 90℃放置24小时。 ℃放置 小时 小时。 取原料适量， 氢氧化钠溶液溶解后， ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 氢氧化钠溶液溶解后 在90℃放置 小时。 小时。 ℃放置24小时 取原料适量， 盐酸溶液溶解后， ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 盐酸溶液溶解后 90℃放置24小时。 ℃放置 小时 小时。 取原料适量，依据各自品种的熔点不同， ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 取原料适量，置紫外灯下照射48小时 小时。 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射 小时。
杂质-3 峰面积 5032 22331 31717 33898 38065 450002 百分比 0.05% 0.22% 0.30% 0.32% 0.36% 0.42%
新杂质
均未 检出
m AU
流速、 流速、柱温与溶剂的选择
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在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。 且使主成分峰不拖尾即可。
测定结果： 测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 ）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 ）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常 、H、O、 ）为什么没有不成线性的？通常C、 、 、 N结构，紫外监测器决定。 结构， 结构 紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时， 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会 出现不成线性。 出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 ）都成线性、为何还要做？ 原理知晓。 原理知晓。
专属性试验验证图谱
配制相同浓度， 存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大， 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。 峰覆盖。 强破坏试验的目的： 强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质， 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。 条件下是否能够分离、测定。
唑 来 磷 酸 结 构 式
引申使用： 引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 ） 相互妙用。 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定 ）缓释制剂溶出度测定， 为中间浓度。举例说明。 为中间浓度。举例说明。 3）回收率试验为何做 ）回收率试验为何做80%~120%即可？亦 即可？ 即可 及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的 理解。 理解。 4）国内只注重相关系数，不注重截距。 ）国内只注重相关系数，不注重截距。
四、检测限
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纯属“纸上谈兵” 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”，
实际测定中根本用不上。 实际测定中根本用不上。