仪器分析第三章高效液相色谱分析
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仪器分析第三章高效液相色谱分析ppt课件
2019/12/20
2019/12/20
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
分析HPLC 目的
制备HPLC 目的
样品组成信息
纯品回收
通常研究大部分或全部样 通常只对一种或几种样品
§3-8 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
2019/12/20
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2019/12/20
§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
u
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5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
分析HPLC 目的
制备HPLC 目的
样品组成信息
纯品回收
通常研究大部分或全部样 通常只对一种或几种样品
§3-8 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
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• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
u
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5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
《仪器分析》高效液相色谱法
《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。
此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次，需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。
最后，还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
仪器分析(第3章高效液相色谱分析)教材
仪器分析教程
三、应用范围
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。 。
式中C m是与k (容量因子）函数。 d m固定相的粒度。 D m试样分子在流动相中的 扩散系数。u流动相线速度 .
仪器分析教程
ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内 的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动 相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相 扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就 越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。 2 Cs m d p H sm u (3 4) Dm
(第五讲）
仪器分析教程
内容提要
1 高效液相色谱法的特点 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 4 液相色谱法的固定相 5 液相色谱法流动相 6 高效液相色谱仪 7 高效液相色谱分离类型的选择 8 高效液相色谱法应用实例 9 液相制备色谱 10 毛细管电泳
仪器分析教程
因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不 需要气化，不受试样挥发性的限制。
仪器分析教程
§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 • 与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相不同. 影响的因素：柱内展宽和柱外展宽。 一、柱内展宽 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp λ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直 径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱， 填充很均匀， λ变得很小，所以He值比较小。
三、应用范围
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。 。
式中C m是与k (容量因子）函数。 d m固定相的粒度。 D m试样分子在流动相中的 扩散系数。u流动相线速度 .
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ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内 的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动 相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相 扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就 越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。 2 Cs m d p H sm u (3 4) Dm
(第五讲）
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内容提要
1 高效液相色谱法的特点 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 4 液相色谱法的固定相 5 液相色谱法流动相 6 高效液相色谱仪 7 高效液相色谱分离类型的选择 8 高效液相色谱法应用实例 9 液相制备色谱 10 毛细管电泳
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因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不 需要气化，不受试样挥发性的限制。
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§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 • 与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相不同. 影响的因素：柱内展宽和柱外展宽。 一、柱内展宽 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp λ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直 径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱， 填充很均匀， λ变得很小，所以He值比较小。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量 因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆 满的选择性分离。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
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2021/2/10
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2、液-固吸附色谱
基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；
2021/2/10
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3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱）
原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离
制备方法： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅碳键型： ≡Si—C c. 硅氮键型： ≡Si—N d. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
2021/2/10
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化学键合固定相的特点
（1）表面无液坑，比一般液体固定相传质快； （2）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和寿命 （3）可键合不同官能团，选择性好 （4）有利于梯度版
4
2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而 这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子 量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。
• 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同 组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。 应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质 等生物大分子。
2021/2/10
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5、空间排阻色谱
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；
原理：按分子大小分离。 小分子可以进入到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。
子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离
分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化
四丁基铵
分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷
磺酸钠；
反相离子对色谱：
固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱)
流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
2021/2/10
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4、 离子交换色谱
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正相色谱与反相色谱比较
正相色谱——固定液极性 > 流动相极性 ➢ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 ✓ 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性 ➢ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 ✓ 适于分离非极性组分
反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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§3-2 高效液相色谱法理论基础
1. 速率理论 P69
由• 于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：
H = A + B + Cu u
=
2l
dp
+
Cd Dm u
+
Cm dP2 Dm
+
CSmdP2 Dm
+
Cs df2 Ds
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
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§3-4 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。
现采用10μm以下的小颗粒
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面 附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅 胶。表面积小，柱容量低；需要高 灵敏度的检测器。
现在5~10 μm全多孔型担体使用广泛
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化学键合固定相
定义：用化学反应的方法通过化学键把有机物分子结合到 担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相）
u
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• 速率方程： H=A+B/u+Cu
• （1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，
• （2）影响柱效的主要因素是传质项。
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2、提高柱效的途径：
• 提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择 薄壳形担体）
• 选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流 动相粘度;
• 减小粒度是最有效的途径.
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§3-3 高效液相色谱法 主要类型及分离原理
1、液液分配色谱法 2、液固吸附色谱法 3、离子交换色谱法 4、离子对色谱 5、空间排阻色谱法
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1、液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 分离机制：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之，流动相 的极性大于固定液的极性（反相色谱）。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用; 目前应用最广的固定相:化学键合固定相
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
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§3-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色
谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、 高灵敏度检测器。
分离机制：分配 + 吸附
采用化学键和固定相的液相色谱称为化学键和相色谱。 （化学键和相色谱类型及应用见表3-2）
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分 钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小 时。 高效：化学键和固定相, >30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）