徒手切片技术
1石蜡制片 2电镜 3徒手切片法
切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。
9.脱蜡、染色、脱水透明和封片：粘片后要经过脱蜡、 染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。
脱蜡、染色和脱水透明的过程仍采用等
级法逐渐进行。最后加拿大树胶封片，然后
贴标签镜检及保存。
以上是石蜡制片的一般步骤；为了获得
良好的制片效果，需要制片者的大量实践并 在实践中不断摸索、积累经验方可。
（五）干燥
是制片关键一步。目的是去除样品中的游离水或已取代游离水的 脱水剂，使样品中不含有液态物质 。临界点干燥法是目前公认的较好
方法。
（六）粘样 将干燥好的样品用导电胶将样品粘在样品台上，并做
好标记。常用的有银粉导电胶、石墨粉导电胶、双面胶带、
普通胶水等。 （七）镀膜（喷涂） 是把粘贴到样品台上的样品和样品台表面同时喷涂上 一层金属膜，使样品具有良好的导电性，以便下一步观察。
是逐级进行，可减少材料收缩。
5.浸蜡：逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。常用
的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有 材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入 到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代， 以便切片。 6.包埋：将浸蜡后的材料包埋在石蜡中。此步骤要 迅速，且不要使石蜡块中有气泡。注意将样品编号
切片刀准备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻
璃刀。前者价格昂贵、质地坚硬、经久耐用；后者制作方
便、价格低廉、但刀刃较脆、不耐用、不能切硬质材料。 制刀用玻璃为硬质玻璃，含硅量72-75%以上。
切片：是用超薄切片机切出50nm后左右的超薄切片，
以供观察。 展片与捞片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需
（一）取样 要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、 低温、防损伤。一般要求体积0.5-1.0mm2。 （二）固定
技能训练五徒手切片技术
技能训练五
徒手切片技术及 植物各种细胞的组织结构观察，常常 都是要对临时所见到的植物进行即时 的观察，为了能很好的观察其结构特 征，又不需要太多的复杂的仪器，必 须要对它们进行做徒手切片做成临时 装片进行观察。通过本次训练着重要 解决这些问题。
器材和用具
显微镜、双面刀片、载玻片、 盖玻片、解剖器、滴瓶、药芹等。
训练内容和方法：
讲解和反复练习徒手切片技术
训练内容
基本组织细胞的观察，用芹菜叶 和叶柄做徒手切片做临时装片进行 观察，观察其薄壁组织（同时培养 动手能力） 。
训练内容
3.输导组织细胞的观察，观察 南瓜茎纵、横切永久装片（或做芹 菜叶柄纵切片）进行观察。
作业
1.试述做好徒手切片的关键技术 和注意要点。 2. 绘基本组织和厚角组织细胞 图。
徒手切片技术
徒手切片法（临时装片） 徒手切片法（临时装片）
1、准备工作： 、准备工作： 刀具：安全第一! 刀具：安全第一 切片维持物：胡萝卜片、 切片维持物：胡萝卜片、土豆片
– 规格：2cm×1cm×0.3cm胡萝卜片 规格： × × 胡萝卜片培养皿：清水 培养皿：
– 将欲切材料断面和刀口附近刀面蘸上水 – 切面，刀面保持润湿，以减小摩擦阻力 切面，刀面保持润湿，
5、夹竹桃叶的横切面 、 叶的表皮细胞壁厚， 叶的表皮细胞壁厚，角 质层发达， 质层发达，栅 栏组织层数往往较多， 栏组织层数往往较多， 海绵组织和细胞间隙却 不发达
6、鸭跖草叶横切面（后含物） 、鸭跖草叶横切面（后含物）
7、花柱横切 、
2、选材 选材： 选材
叶片： 叶片：长、宽约1cm 宽约 叶柄： － 叶柄：1－2cm长的小段 长的小段
徒手切片法——实验步骤 实验步骤 徒手切片法
3、切片 、 （1）夹取： ）夹取：
样品不宜太厚， 样品不宜太厚，否则难以夹取
（2）持刀： ）持刀：
– 左手的大拇指、食指和中指：拿住材料 左手的大拇指 食指和中指： 的大拇指、 要求：材料突出在指尖上面， 要求：材料突出在指尖上面，以免误伤 – 右手拿刀片 ，平放在左手食指上，刀口向内 右手拿刀片 平放在左手食指上，刀口向内
徒手切片法——实验步骤 实验步骤 徒手切片法
（3）运刀： ）运刀：
• 刀法要领：从刀片刀口下方起，斜向后拉切， 刀法要领：从刀片刀口下方起，斜向后拉切 由左前方向右后方一次切下 • 用力诀窍：臂力，非腕力， 用力诀窍：臂力，非腕力， • 忌：用力太猛；反复拉锯式切割 用力太猛； • 宜：常用水湿润切面
徒手切片法——实验步骤 实验步骤 徒手切片法
徒手切片法
徒手切片法用光学显微镜观察的样品必须是透明的，因此，无论是临时装片还是永久制片的玻片标本，制作前都必须先将材料切成薄片。
徒手切片法简称手切片法，即以手持刀片将材料切成能在显微镜下观察其内部结构的薄片的方法。
是植物形态解剖学实验及研究中最简单和最常用的切片方法，也是最重要的基本技能之一。
这种切片方法简便易行，节省时间；而且所需工具简单，只要有一把锋利的剃刀或双面刀片就可以操作。
还有一个独特的优点，就是可以看到组织细胞内的自然结构和天然颜色。
其缺点是不易做到将整个切面切得薄而完整，往往厚薄不一；过软过硬的材料比较难切。
徒手切片一般处理的是新鲜材料，有时也可将材料预先固定好。
一般材料的徒手切片的方法如下：1.材料的准备：一般选择正常、软硬适中的植物器官或组织为材料，直接切成长约2〜3厘米的小段，削平切面。
所取的新鲜材料应及时放入水中，以免萎蔫。
取材的大小，一般直径不超过5mm,长度以15-25mm为宜。
过于柔软或微小的材料，难以直接执握手切，可夹入坚固而易切的夹持物中切。
常用的夹持物有去除木质部的胡萝卜根、土豆块茎、接骨木的髓部等。
切前先将夹持物切成长方小体,上端削平。
对于较薄的叶状体材料,可将夹持物纵切一缝,材料夹于其中即可；如不是叶状体,即将材料夹于其中,或在缝里挖一个和材料形状相似、大小相同的凹陷,把材料夹在凹陷里。
然后用手握住夹持物,采用上述方法将夹持物和其中的材料一齐切成薄片,除去夹持物的薄片,便得到材料的薄片。
坚硬的材料要经软化处理后再切。
软化的方法：对于比较硬的材料，切成小块煮沸3〜4 h,再浸入软化剂（50%酒精：甘油 =1 : 1）中数天至更长些时间，而后再切。
对于已干或含有矿物质，更为坚硬的材料,要先在15%氢氟酸的水溶液中浸渍数周,充分浸洗后,再置入甘油里软化后再切。
2.执握刀片和材料的方法：左手大拇指和食指的第一关节指弯夹住材料，使之固定不动。
为防止刀伤，拇指应略低于食指，并使材料上端超出手指2〜3毫米，不可高出过多，否则切片时材料容易弯折，也不容易切薄。
42.3徒手切片法制作植物临时装片
一、材料准备
2
二、徒手切片
用左手大拇指、食指和中指捏住材料，拇指略低于中指，使材 料突出于手指之上，以免刀口损伤手指。右手平稳地拿住刀片，将 刀片平放在左手的食指第一指节的皮肤上，与材料切面平行，然后 以均匀的力量，自左前方向右后方拉，注意要用臂力而不是腕力。
切片时要湿润材料和刀面，使之滑润，且动作要快，一刀切下， 切忌中途停顿或前后作“拉锯”式切割。
一、材料准备
徒手切片一般运用于软硬适度的植物根、茎、叶等材料。 先准备一个盛有清水的培养皿，准备好毛笔，滴管和刀片等用 具和待切的材料。将待切的材料截成2-3cm长的小段便于手持，削 平切面。 若为质地较软而薄的材料，可将其夹在支持物中一同切片。支 持物通常为萝卜、胡萝卜、马铃薯等。先将支持物切成高3~5cm、 长、宽0.5cm的立方体小块，将其中部纵切形成一缝，然后将修整 好的材料夹在其中。
连续多切几片，转移至盛有清水的培养皿中，然后用毛笔将较 薄切片挑取至滴有清水的载玻片上，制成临时装片进行观察。
3
二、徒手切片
左手拿材料，右手切片挥臂来自续切片将切片放入盛水的培养皿
4
徒手切片技术
植物病理徒手制片技术徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。
限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。
(一)整体封藏法对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。
常用方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辨不清。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。
刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原体蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。
浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。
如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。
(二)徒手切片法欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
徒手切片的制作
操作过程
为了成功切片,应掌握正确的用刀方法. 一般用左手的大拇指,食指和中指3个手指拿住材料, 使材料略突出在指尖之上,避免切片时割伤手指;用 右手平稳地拿住刀片,把刀口放在经解剖刀削平的材 料平面中间,轻轻地压住它,以均匀的动作,从刀片 刀口下方起,斜着向后拉切.切时用臂力而不是腕力, 且不必太用力,否则就不易切薄.在切的过程中,决 不能以刀片直接挤压材料,或以刀片来回拉割材料, 并且要始终保持材料与刀片在水平状态,否则会由于 切面偏斜而影响观察.
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临时制片种类很多,包括涂片,压片等等
作徒手切片不需要复杂的设备,只需要一把锋利的 剃刀或双面刀片就可以进行,方法简单,而且易于 保持细胞的生活状态.徒手切片法所作的切片通常 不经染色或经简易染色后,封藏于水中即可观察. 用剃刀切片,材料不能太大,一般以表面不超过35mm为宜.切片最要紧的是平而薄,无需很完整, 比如茎的横切面,无需切片整圆形,只需一角就够 了.所有切片前的准备工作,如截取材料,削平切 面,都应使用解剖刀或用过的刀片,不可用剃刀, 以保持剃刀的锋利.
将切下的薄片放在载玻片上时,要先在玻片 中央加一滴水,把材料放到水滴中,然后用 镊子夹住盖玻片,将盖片的一侧先接触到载 玻片中央的水滴,然后用镊子顶,重新放置.
徒手制作的切片可以直接在光镜下观察,也 可以经过简易的组织化学染色,以使结构看 得更清楚,同时可观察到细胞各部分的化学 成分. 常用的染料有:0.1%亚甲基蓝,0.5%～1% 中性红或1%番红水溶液等. 染色的方法是将切片放在载玻片上后,用吸 水纸吸去多余的水分,滴上一滴染料,经过 1～2min后,用水冲洗一下,盖上盖玻片,在 显微镜下观察.
徒手切片方法(精品)
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主主要要用用在在组组织织化生药药鉴鉴定定、、石石蜡蜡切切片片选选材材等等。
方方法法要茎的的横横切要领切面面，，无领切切片片最最要要紧紧是是平平而而薄薄，，无无需需切切成成完完整整的的。
例例如如茎无须须切切成成整整圆圆形形，，只只需需一一角角就就足足够够了了。
步步骤材料料，，使骤①①一一般般用用左左手手的的大大拇拇指指、、食食指指和和中中指指这这三三个个手手指指拿拿住住材使材材料料突突出出在在指指尖尖上上面面，，使使刀刀片片不不会会割割伤伤它它们们。
用用右右手手拿拿刀刀片片。
两两只只手手应应该该可可以以自自由由活活动动，，不不1 / 5要要使使它它们们靠靠紧紧身身体体，，或或压压在在桌桌子子上上。
②②刀刀片片刀刀口口放放在在切切面面上上，，从从刀刀片片刀刀口口下下方方起起，，斜斜向向后后拉拉切切，，切切时时要要用用臂臂力力，，不不用用腕腕力力。
不不必必太太用用力力，，否否则则就就不不易易切切薄薄。
③③连连续续切切几几片片后后，，取取下下切切片片，，转转移移到到载载玻玻片片上上的的一一滴滴水水中中，，放放在在低低倍倍显显微微镜镜下下检检查查。
假假如如切切片片充充分分透透明明，，细细胞胞重重叠叠不不明明显显，，就就可可使使用用。
否否则则得得重重切切。
④④过过于于柔柔嫩嫩的的植植物物器器官官，，如如叶叶片片，，难难以以直直接接拿拿住住，，可可以以用用坚坚固固而而易易切切的的材材料料夹夹后后再再切切，，如如胡胡萝萝卜卜片片。
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植物病理徒手制片技术
徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。
限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。
(一)整体封藏法
对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。
常用方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辨不清。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。
刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原体蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。
浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。
如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。
(二)徒手切片法
欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌
子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。
切片时先选取材料并作适当的修整，以左手的食指和姆指捏住材料，中指顶住材料下端，使材料上端突出于手指以上2—3毫米。
右手握稳刀，从左向右后方斜向切割。
注意刀口必须以材料面垂直。
否则所得切面不正。
同时双手不应紧靠身体，而是要活动自如。
用臂力均匀地沿刀口后部起拉向前方，连续切割4—5片后，用毛笔蘸水轻轻沿刀口取下，放入盛有水的浅玻皿中，在此过程中左手握着的材料不要放下，否则再切时难按原位置拿材料，此外，在切片过程中，必须常用毛笔蘸水湿润材料，以免材料干涸不便切割。
对于过于柔软或较薄的材料，可以夹在“夹持物”中，进行切片更为方便。
新鲜胡鲜卜和马铃薯块都可作“夹持物”用。
实验室中通常将通草、接骨木或向日葵的茎髓，剪成适当大小，浸于70%酒精中备用。
切割一定数量的薄片后，用移置环在浅玻皿中选取合用的材料薄片，放在载玻片的水滴中，镜检合格者即酒精灯上将水烘干并摆正材料，然后加一滴乳酚油或其浮载剂；放在展片台上略加热，镜检如无气泡，即可小心加盖片，用吸水纸吸除多余的浮载剂，最后贴好标签，平放于切片板上，待干燥适宜时封固。
徒手切片的缺点是对于微小或过大，柔软、多汁、肉质及坚硬的材料不易切取，也难制成连续切片，此外切片的厚薄也难一致。
切片机切片即可克服这些缺点。
附：常用浮载剂及封固剂
1 水作浮载剂：最常用，但易于干燥，仅适于暂时性检查，不易封固保存，且易形成气泡(检查材料以酒精、5%明胶、水或稀肥皂水稍浸，洗净后再以水浮载可除去气泡)。
2 乳酚油：也较常用，成分及配比如下：
苯酚结晶(加热熔化)20ml 乳酸20ml
甘油40ml 蒸馏水20ml
乳酚油不易干燥，标本可存放几天以上，为使标本易于辩别，常在其中加染料
苯胺蓝(棉蓝)，用量是0.05—0.1%(也有的加0.2—0.5%的锥虫蓝等)，因其是酸性染料，可染真菌原生质而不染细胞壁，故对分隔难辨的真菌孢子等可由此染色而看清。
此法一般只用观察菌态，不适于测量孢子的大小(因为乳酚油的折射率近于孢子和菌丝体，1.43左右)。
另一方面，此法制片，封固比较困难(因为乳酚油易于和封固剂起化学作用而分解)，可用达马树脂(和乳酚油不起化学作用)和等量蜂蜡混配做封固剂，蜂蜡放于玻璃皿中在水槽上熔化(温度勿过高)，达马树脂在铁罐中熔化(温勿过度)，然后将蜂蜡倒入熔化的达马树脂中搅和而成(加少量的贴金胶水，可增进与玻璃的附着力)，封固时以“L”形铜棒等在煤气灯上烧热后，蘸少许封固剂在盖玻片周围封固，此封固剂干燥快，经久不坏。
但由于其致癌作用而逐渐被淘汰而改用甘油乳酸液。
3 甘油乳酸液：也可加苯胺蓝等染料，其成分如下：
乳酸 500ml 甘油 1000ml 蒸馏水 500ml
4水合氯醛碘液：成分配比如下：
水合氯醛 100g 碘化钾 5g
碘 1.5g 水 100ml
碘与碘化钾研和，加水溶解。
然后与水合氯醛混合，此浮载剂较好，能使真菌组织透明，并染上颜色，能弥补乳酚油的不足，一一看清细胞壁和其它结构，此法制片只可保存几天，不宜久存，为保存，可除去碘液再用乳酚油浮载后封存。
5甘油：此浮载剂适于保存藻类、水霉菌等柔软标本将标本放在一滴10%的甘油中，加盖玻片，水分蒸发后，随时补加甘油至水分蒸发净，制成的标本玻片平放可经久不坏，(擦去多余甘油，用香脂油或其它封固剂封固，可永久保存)。
6甘油明胶：成分及配方如下：
明胶 5g 甘油 35ml 水 30ml
明胶在水中浸透，加热至35℃溶化，加甘油搅和，用纱布过滤后使用。
徒手切片及其它标本，都可用此剂浮载制片，标本染色(或不染)后，先用甘油脱水(干燥标本可不脱水)，挑取小团甘油明胶放在载片上，微加热，待其熔化而气泡消失后，将标本取出吸除去多余甘油后移入熔化的甘油明胶中，加盖玻片轻轻下压，擦去盖玻片周围的多余甘油明胶。
平放十几天，干后长期保存，用香脂或其它
固剂封固后长久保存。
此浮载剂对于干燥标本易出气泡，用醋酸甘油先予处理可防此弊，成分配比如下：
醋酸钾(2%水溶液) 300ml 甘油 120ml酒精 180ml
标本放在载玻片上加小滴醋酸甘油，微加热以除气泡，并蒸去大部分油剂，趁热加入小团甘油明胶，熔化后加盖玻片，其后步骤同上。