第四章 分子荧光分析
分子荧光分析法实验讲义
5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样
架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测
3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”
图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。
若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开
关，开启电脑。预热仪器20分钟。
2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0,
4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
分子荧光分析法
分子荧光分析法1. X射线荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
分子荧光分析
发生荧光的物质仍为M*分子，品种并没有改 变，所以荧光分子的平均寿命也没有改变，至于 solu温度升高荧光强度之所以增强，可能是由于 温度升高时该络合物较不稳定，较多地分解为M 和Q分子的缘故。这一点可以作为这一类型熄灭 不同于碰撞熄灭的标志。 如果络合物MQ的形成是由于强大的力，则络 合物MQ将具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光 谱也将发生改变。
It I0
二．影响发光强度的因素
Φf=
S*
kf kf kc kx
kx
T
kc
kf
kc´
kp
S
讨论
1. kf主要取决于分子结构，受环境影响较小。 ε ε
max
可作为kf的定性度量 ε
∨
max大，A大，kf大
例如 π →π * n→π *
ε
具有多重共轭双键的分子发射的荧光较强
2. kc受环境影响最为强烈(无辐射去活速率常数） T升高，分子碰撞的几率增加，kc变大 3. kx为内交联的速率常数
表1 在不同汞射线照射下数种主要溶剂的拉曼光波长
solvent λ
ex(nm)
248
水 乙醇 环己烷 四氯化碳 氯仿 271 267 267 -
313
350 344 344 320 346
365
416 409 408 375 410
405
469 459 458 418 461
436
511 500 499 450 502
D － + H→ DH（半醌）
2DH → D + DH2 （无色染料）
发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金
属离子，I－，Br－，CNS－，S2O32－等易于
给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素
分子荧光分析法
（fluorescence efficiency）。荧光效率
也称荧光量子产率，用f 表示。
kF 发射的荧光量子数 Φf 吸收的光量子数 kF kVR kIC kISC kEC kP
可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化
常数降低的因素均可增加荧光量子产
萘的荧光光谱。
pH值：溶液的酸度（pH值）对荧光
物质的影响可以分两个方面：
1．若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，
溶液pH值改变，物质分子和其离子
间的平衡也随之发生变化，而不同
形体具有其各自特定的荧光光谱和
荧光效率。例如苯胺
NH3+
OHH+
NH2
OHH+
NH-
PH<2
PH7~12
PH>13
无荧光（离子形式） 蓝色荧光（分子形式） 无荧光（离子形式）
的～* 跃迁。其共轭程度愈大，
荧光效率也愈大，且最大激发和发 射波长都向长波长方向移动，如苯、
萘、蒽三种物质。苯来自萘蒽维生素A
ex
205nm 278nm
0.11
286nm 321nm
0.29
356nm 404nm
0.36
327nm 510nm
em
刚性平面结构：当荧光分子共轭程度
荧光效率越大。
温度 温度对被测溶液的荧光强度有明 显的影响。当温度升高时，介质粘度
减小，分子运动加快，分子间碰撞几
率增加，从而使分子无辐射跃迁增加， 荧光效率降低。故降低温度有利于提
高荧光效率及荧光强度。
由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容 易引起溶液温度升高，加之分析过程中室温可 能发生变化，从而导致荧光强度改变。另外， 有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射 试样不应长时间受光照射，只在测定荧光强度 时才打开光闸，其余时间应关闭。在较高档的
《分子荧光分析法》PPT课件
16
复习： 荧光的产生
hv
基态分子
激发态
回到基态，如何回去？
17
分子的吸收情况 S2
T1 S1
S0
l2
l1
18
S2
S0 l2
振动弛豫：在同一电子能级〔激发态〕… T1
S1 特点：无辐射；速率快 〔10-14～10-12 s内完成〕
O Mg N
8-羟基喹啉镁
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➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸 盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
• 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
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➢无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高
b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
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➢无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性构造和共平面效应
-O
O -O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
N O-
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光分析法教学课件
应用领域与优势
应用领域
分子荧光分析法广泛应用于生物、医学、环境等领域，如生物体内的物质检测、医学诊断、环境污染物监测等。
优势
分子荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、非破坏性等特点，能够实现快速、准确地检测物质，尤其适用于痕量 物质的检测。此外，荧光分析技术还可以与其他技术联用，如色谱分离技术、质谱技术等，进一步提高检测的准 确性和可靠性。
发展历程与现状
发展历程
分子荧光分析法自20世纪初诞生以来，经历了多个发展阶段 ，包括荧光物质的发现、荧光分析技术的建立、荧光探针的 应用等。
现状
目前，分子荧光分析法已经成为一种广泛应用于生物、医学 、环境等领域的高灵敏度、高选择性的分析方法。随着技断提高。
将荧光分析法应用于生物、医学、环境等领域， 拓展其应用范围。
创新技术
不断探索新的荧光分析技术，提高检测效率和准 确性。
加强交叉融合
与化学、物理、生物等领域进行交叉融合，推动 荧光分析法的创新发展。
THANKS 感谢观看
微型化
将荧光分析法应用于微流控芯 片和纳米材料中，实现微型化
、便携式检测。
荧光分析法面临的挑战与机遇
挑战
荧光分析法的干扰因素较多，如光散 射、背景荧光等，需要克服这些干扰 以提高检测准确性。
机遇
随着新材料、新技术的不断涌现，荧 光分析法将有更多的应用领域和潜在 市场。
荧光分析法的未来发展方向
拓展应用领域
分子荧光分析法教学课件
• 分子荧光分析法概述 • 荧光分析法的基本原理 • 荧光分析法的分类 • 荧光分析法的实验技术
• 荧光分析法的应用实例 • 荧光分析法的未来展望
01 分子荧光分析法概述
定义与原理
分子荧光分析法
分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
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新型纳米荧光材料－量子点( quantum dots, QDs )
Goldman, et. al. Anal. Chem. 2004, 76, 684-688.
第二节 荧光分光光度计
第三节 分子荧光分析法的应用
Fluorescence
基于硅纳米球的DNA分析技术
Zhao, et al. JACS, 2003, 125,11474
“分子信标”的检测原理
loop
stem
应用：实时定量荧光PCR
探针与DNA杂交时产生荧光 -----变性过程：产生非特异性荧光 -----退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 -----延伸过程：不产生荧光
a.
吸电子取代基,会使荧光减弱,如硝基苯无荧光。
4)化学环境对荧光的影响
温度：温度越低，φ F越大
5)溶剂
6) pH值的影响
4、荧光的猝灭
荧光物质的分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用， 引起其荧光强度降低，消失或荧光强度与浓度不呈线 性关系的现象
原因： 猝灭剂分子与荧光物质发生化学反应 溶解氧的存在 : 氧化荧光物质 自猝灭 : 高浓度时发生(自碰撞失活)
1）荧光发射光谱的形状与激发波长无关
2） Stokes位移 3）镜像规则
3、 荧光效率与荧光分子结构的关系
荧光效率 (荧光量子产率) 发射的光子数 φF= = 吸收的光子数
kf kf + Σ k
≤ 1
kf ：辐射跃迁的速率常数 Σ k：各种非辐射跃迁过程的速率常数之和
φ F越大，化合物的荧光越强。 有分析应用价值的荧光化合物 , 其荧光量子产率通常在 0.1～1 之间
第四章ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子荧光分析
第一节 基本原理
1、激发光谱曲线和荧光光谱曲线
固定测量波长为荧光最大发射波长，然后 改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光） 强度与激发光波长的关系，即得激发光谱 曲线
固定激发光波长为其最大激发波长，然后 测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强 度，即得荧光或磷光光谱曲线
2、荧光发射光谱的特性
从分子结构来说,绝大多数能发荧光的物质为 含有低能的π→π* 跃迁能级的芳香环或杂 环化合物
1)共轭效应
π电子的共轭程度越大，就越容易被激发,分 子的荧光效率越大,而且其最大荧光波长也会 相应地“红移”——向长波长方向移动
2)刚性结构和共平面效应
3)取代基的影响
给电子取代基, 产生n-π共轭效应, 加强荧光。