臭氧灭菌效果的验证
洁净室臭氧消毒的验证
洁净室臭氧消毒的验证【摘要】目的:通过臭氧消毒方法验证建立洁净室安全有效的臭氧消毒方法。
方法:对洁净室进行消毒前后浮游菌、沉降菌、表面微生物检测,臭氧发生器产能以及洁净室消毒过程中以及消毒后臭氧浓度的测定以及生物指示剂检测的方法来研究臭氧消毒的效果,从而建立臭氧消毒方法。
结论:臭氧能够对洁净室进行消毒,而且方法安全简便,值得推广。
【关键词】臭氧消毒;验证在制药厂,一般来说,洁净区面积较大,多有中央空调净化系统完成对各洁净区的净化消毒。
传统的消毒方法是用甲醛、环氧乙烷、过氧乙酸等化学试剂熏蒸,臭氧消毒因具有高效性、环保性、广谱性、彻底性、经济性、操作简单、运行时间短的特点得到广泛应用。
臭氧(又名三子氧),分子式O3,分子量:48,是氧的同素异形体,由三个氧原子构成,臭氧在常温常压下分子结构不稳定。
臭氧是一种广谱杀菌剂,具有强烈的杀菌消毒作用。
臭氧它与微生物细胞中多种成分产生反应,从而产生不可逆转的变化而灭亡。
臭氧消毒是利用HV AC系统的循环风作为臭氧的载体,即将臭氧发生器生产的臭氧由HV AC系统中的净化风机产生的压力风源,扩散至整个洁净区域,并使空气中的臭氧浓度均匀,即可达到灭菌目的。
按照卫生部消毒技术规范的要求,臭氧对空气中的微生物有明显的杀灭作用,采用20mg/m3浓度的臭氧,作用30min,对自然菌的杀灭率达到90%以上。
臭氧对物品表面上污染的微生物有杀灭作用,但作用缓慢,一般要求60mg/m3,相对湿度≥70%,作用60min～120min才能达到消毒效果。
2003版验证指南指出:对于环境消毒效果验证的内容有:消毒条件,方法,所用介质,清洁剂,灭菌剂及浓度,消毒设备,消毒时间以及最后的环境监测。
对于臭氧消毒验证的要点为:1.臭氧发生器的需确认和校准的技术指标主要有臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器根据洁净室(区)体积和系统的风管体积(或风量)、臭氧杀菌效率选用相应的臭氧发生器。
臭氧设备选择方法:利用HV AC系统集中投加时,臭氧发生器选用按以下方法计算:首先计算实际臭氧消毒体积,实行体积由三部分组成V=V1+V2+V3,V1洁净区空间体积,V2空气净化系统体积,V3循环时空气损失体积,实际计算过程中V3等於循环系统总风量的1.1%。
洁净工作区臭氧消毒效果验证方案
在日常使用过程中，洁净区的空气中会有微生物存在。
为保证洁净区空气中微生物数量得到有效控制，特进行洁净区臭氧消毒效果的验证活动。
验证在规定的臭氧浓度条件下保持特定时间后，臭氧消毒对洁净区空气中微生物的消杀效果，以及臭氧在启动空气循环系统条件下达到0.15ppm 的安全阈值所需时间。
本公司十万级洁净车间和万级洁净工作区臭氧消毒效果的验证。
4.1 验证委员会4.2 验证小组4.3 验证涉及部门5.1 编制依据5.1.1 2003 年版《药品生产验证指南》 5.1.2 卫生部《消毒技术规范》5.1.3 《GB 28232-2020 臭氧消毒器卫生要求》 5.2 验证过程中偏差处理在方案实施过程中，若出现不符合测试标准的数据，应立即调查原因进行分析，并采取偏差处理措 施。
在偏差处理措施实施完成后，应确认偏差是否对本次验证结果产生影响，如果偏差影响到本次验证 结果，则判定本次验证失败，并对本系统重新实施验证方案。
如果在实施纠偏措施后，数据已符合测试 标准，不影响验证结果，则继续实施本方案，直至本次验证实施结束。
5.3 验证方案修改申请及批准书验证过程中严格按照验证方案执行。
若在实施过程中，发现验证方案存在缺陷，立即停止验证，验 证小组成员对验证方案进行修改，并填写《验证方案修改申请及批准表》（附件 4），由验证委员会成员 批准后，重新启动验证。
若验证方案无需修改，不需要填写《验证方案修改申请及批准表》。
6.1 验证所需文件、资料确认6.3 验证所需仪器仪表确认7.1 方案7.1.1 臭氧消毒浓度要求： 万级达到消毒浓度 15ppm ，十万级达到消毒浓度 10ppm 。
7.1.2 根据臭氧发生器说明书载明 WJ-K-E4 臭氧发生器臭氧发生量为 40g/h ，根据如下公式及房间体积 计算达到消毒浓度时间：V ∗ （1 ∗ 2.14 ∗ n ）t = 6040∗ 1000公式解释：V: 房间的体积（m 3） t: 达到消毒浓度的时间(min)n: 消毒浓度要求（ppm ）消杀效果。
臭氧消毒效果验证与方案
臭氧消毒效果验证与方案目的：本文旨在对XXXXXX大容量注射剂车间洁净区臭氧消毒效果进行再验证，以确认其卫生程度符合工艺要求。
范围：大容量注射剂车间洁净区臭氧消毒效果。
责任：验证领导小组、验证项目小组。
方案：本次验证分为两项：1、使用臭氧测试试管测定臭氧浓度；2、通过微生物挑战试验证明设定条件下臭氧消毒对微生物的杀灭效果。
验证依据：药品生产质量管理规范（2010年修订）、药品生产验证指南（2003年版）、中国药典2010年版。
验证小组人员及职责：组长：生产管理部部长、工程部部长、生产部长助理、工艺员组员：车间主管、QA主管、QA、QC、操作工风险评估：采用FMEA(失效模式与影响分析)工具，对大容量注射剂车间洁净区臭氧消毒效果验证涉及的工艺设备及管道、物料、控制系统、关键设施、环境控制和人员操作等环节进行风险评估，并针对风险的级别采取相应措施。
责任：审定验证方案及报告、指导验证实施、培训验证小组成员。
影响大容量注射剂车间洁净区臭氧消毒验证效果的工艺参数风险评估表如下：编号要素子要素可能的风险点风险可能导致结果风险分析分数风险水平风险控制活动S 空调系统未能在最难清洁位置取样取样失败 3 中设计合理的臭氧消毒流程，特别注意空调系统阀门的控制P 臭氧浓度浓度设置较低，或无根据控制不当，消毒失败 4 高根据卫生部《臭氧消毒技术规范》设定合理的浓度D 指示剂检验人员不会使用指示剂合格标准的确定不合理 4 中检验人员接受指示剂使用培训臭氧发生器发生速度达不到洁净区消毒需求量设备臭氧发生器时间设置不合理臭氧发生器运行中出现故障 1 2 3 中配置可靠的臭氧发生器设备，进行定期维护保养操作人员人员未按操作规程进行操作操作人员不能正确使用臭氧发生器 2 2 中对操作人员进行培训和考核，确保其能正确使用臭氧发生器人员未全部离场消毒时臭氧浓度高，导致人员中毒消毒时臭氧泄露，达不到消毒效果，且泄露至一般区，导致人员不适 3 3 3 首先进行消毒前确认，确保所有人员已经离场，然后进行臭氧消毒环境洁净区各功能房间及对环境洁净区密闭一般区的门，未能及时关闭臭氧浓度无法保证，不能达到消毒效果达不到消毒要求 3 2 中消毒前确认所有洁净区房间对一般区的门均已关闭，确保臭氧浓度能够达到消毒要求质量风险评估表：编号要素子要素可能的风险点风险可能导致结果风险分析分数风险水平风险控制活动空调系统浓度未能在最难清洁位置取样取样失败 5 高设计合理的臭氧消毒流程，特别注意空调系统阀门的控制臭氧浓度浓度设置较低，或无根据检验结果不认可 4 中根据卫生部《臭氧消毒技术规范》设定合理的浓度指示剂检验人员不会使用指示剂合格标准的确定不合理3 中检验人员接受指示剂使用培训试验微生物挑战试验取样设计不合理，人员直接进行取样高浓度臭氧对取样人员身体造成伤害 4 中设计合理的取样方案，确保取样安全臭氧发生器臭氧来不及发挥消毒效果即被排风排掉 4 高对臭氧发生器进行定期维护保养，确保其正常工作消毒前确认，所消毒区域无人员滞留，确认合格，方可进行臭氧消毒取样失败，或数据与实际不符 3 3 中消毒前确认所有人员已经离场，确保数据准确参考权威部门颁布的合格标准，设计试验方案浓度设定达不到消毒要求 2 中参考权威部门颁布的合格标准，设计合理的试验方案注：对于明显有问题的段落已经被删除。
洁净区臭氧灭菌验证及方案)
洁净区臭氧灭菌验证及方案一、简述臭氧有很高的能量，很不稳定，在常温，常压下，臭氧结构易变，很快自行分解为氧和单个氧原子。
后者具有极强的氧化作用，臭氧的半衰期为22~25min。
生成臭氧的原料主要是空气和电能。
臭氧杀菌机制：（1）作用于细胞膜，导致细胞膜的通透性增加，细胞内物质外流，使细胞失去活动；（2）使细胞活动必需的酶失去活性；（3）破坏细胞内的遗传物质或使其失去功能。
臭氧杀灭病毒是通过直接破坏核糖核酸或脱氧核酸完成的。
而杀灭细菌、霉菌类微生物则是臭氧首先作用与细胞膜，使细胞膜的构成收到损伤，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，臭氧继续渗透破坏膜内组织，直到死亡。
不同洁净室可根据其体积，选用适当的臭氧发生器，将主机设置在HV AC系统的送、回风主管道中或净化空调箱的中效过滤器后端的合适位置，电源控制系统置于机房内。
消毒时，关闭新风进口（或关闭约90%的新风进口阀门）和回风对外排放阀门，是整个被消毒的洁净室空气通过净化系统风道形成内循环状态。
每天开机1~1.5h进行空气灭菌；替代化学药剂熏蒸消毒及设备表面灭菌需开机2~2.5h。
10万级别的洁净区，臭氧投加浓度为10MG/M3。
臭氧衰减率为0.375。
按空间的大小投加量计算：臭氧发生器产量=体积*10/0.375按这计算出来的臭氧发生器产量，基本的能达到10万级别洁净区的洁净标准。
二、目的制剂的生产过程主要在洁净区完成，洁净区用臭氧灭菌的效果直接影响到产品的质量，为确认臭氧灭菌的可靠性,用臭氧灭菌取代甲醛熏蒸灭菌，减少对员工身体健康的损害，特制订本验证方案进行验证。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行,若因特殊原因确需变更时,应填写验证方案变更申请及批准书,报验证小组批准。
三、工艺原理图将臭氧气体引到送风主管道中，利用HV AC系统中净化风机产生的压力风源，扩散至所控制的整个洁净区域。
四、验证计划(1)、洁净区空气消毒方法原理：1.1 是采用臭氧发生器产生臭氧后，通过HVAC 系统机组的正压送风段和送风管送入洁净区，再通过回风管回到机组，组成一个闭合的空气循环系统，控制消毒过程中的循环时间或密闭时间，从而使一定浓度的臭氧气体在规定的时间内，杀灭洁净区内的微生物。
臭氧灭菌柜验证方案
1. 引言臭氧灭菌柜是一种常见的消毒设备，用于对实验室器具、环境和物品进行灭菌操作。
为了保证臭氧灭菌柜的有效性和安全性，需要进行验证。
本文档将介绍臭氧灭菌柜验证方案的目的、验证方法、验证参数和验证记录。
2. 验证目的臭氧灭菌柜验证的目的是确保臭氧灭菌柜在使用过程中能够达到预期的灭菌效果，并满足相关的法规和标准要求。
验证的结果可以用来评估臭氧灭菌柜的性能，并对其进行调整和改进。
3. 验证方法3.1 初始验证初始验证是对新安装的臭氧灭菌柜进行的验证。
验证步骤如下： 1. 清洁臭氧灭菌柜，确保没有残留的污物和化学物质。
2. 将臭氧灭菌柜内放置适当数量的生物指示器（BI），并将其置于不同位置。
3. 打开臭氧灭菌柜的臭氧发生器，设置合适的臭氧浓度和作用时间。
4. 开始臭氧灭菌过程，等待灭菌完成。
5. 完成臭氧灭菌过程后，将生物指示器取出，送往实验室进行培养。
6. 根据生物指示器的培养结果，评估灭菌效果。
3.2 定期验证定期验证是对已投入使用的臭氧灭菌柜进行的验证。
验证频率根据使用情况和相关要求确定。
验证步骤如下： 1. 清洁臭氧灭菌柜，确保干净。
2. 选择适当数量的生物指示器，将其放置于臭氧灭菌柜的不同位置。
3. 打开臭氧发生器，设置合适的臭氧浓度和作用时间。
4. 启动臭氧灭菌过程，等待灭菌完成。
5. 取出生物指示器，送往实验室培养。
6. 根据生物指示器的培养结果，评估灭菌效果。
4. 验证参数在臭氧灭菌柜的验证过程中，需要注意以下参数： - 臭氧浓度：验证前需要确定臭氧灭菌柜的臭氧生成器能够产生预定的臭氧浓度。
- 作用时间：验证前需要确定臭氧灭菌柜的臭氧发生器能够提供预定的作用时间，确保灭菌效果充分。
- 温度：验证过程中需要测量臭氧灭菌柜的温度，确保温度在预定范围内，以保证臭氧发生器的正常工作。
5. 验证记录对臭氧灭菌柜的验证过程和结果需要进行详细记录，以便跟踪和审计。
验证记录包括以下内容： - 臭氧灭菌柜的标识信息和使用情况。
臭氧灭菌验证规程
1.0目的验证臭氧在在一定时间内达到的浓度；验证臭氧的空气灭菌、包装材料灭菌效果。
2.0适用范围适用于公司所用臭氧发生器进行臭氧空气灭菌和包装材料灭菌的过程。
3.0职责与权限3.1检验室负责公司进行臭氧灭菌的验证及评定。
3.2生产部、仓库进行臭氧灭菌具体实施与管理。
4.0运行程序4.1仪器试剂：4.1.1选用菌种；枯草杆菌黑色变种芽抱菌片(ATCC9327),含菌量：5×10δ^5×106cfu∕Λ4.12营养琼脂培养基4.1.3O.1mo1∕1硫代硫酸钠标准溶液4.1.420%碘化钾溶液4.1.50.5%淀粉指示剂4.1.61+1盐酸4.1.7恒温培养箱4.2臭氧浓度的测定：4.2.1打开臭氧发生器，运行稳定后，将出气管口置于500m1碘量瓶中(碘量瓶中加入250m1蒸储水，20%碘化钾溶液20InI)液面下，通气15min后，取下碘量瓶，盖好瓶塞。
4.2.2打开瓶塞，吸取1+1盐酸溶液5m1沿瓶壁缓缓加入加入碘量瓶中，盖上瓶塞，摇匀后，置于暗处放置5mino4.2.3取出碘量瓶，加入2m10.5%淀粉指示剂，用0.1mo1∕1硫代硫酸钠标准溶液滴定至蓝色消失，即为终点。
同时做空白试验。
4.2.4结果计算：臭氧含量口(mg∕h)=2H”竺T式中：C-0.1mo1∕1硫代硫酸钠标准溶液浓度，mo1/1V-0.1mo1∕1硫代硫酸钠标准溶液消耗量，m1;V。
一空白试验0.1mo1∕1硫代硫酸钠标准溶液消耗量，m1;T一取样时臭氧通入的时间，h；0.048—臭氧的单位摩尔质量，mg/mo14.2.5结果判定：臭氧浓度应大于额定浓度(IO1ng/h)。
4.3消毒效果的验证；4.3.1枯草杆菌黑色变种芽泡菌片(ATCC9327)2片于平皿内，置于灭菌空间或包材内，开启臭氧灭菌器4h后，关闭臭氧发生器，30min内取出平皿；同时做空白对照。
4. 3.2灭菌效果验证：将平皿直接倒入15m1营养琼脂培养基内，37℃培养48h后观察结果。
臭氧杀菌效果试验
究
臭 氧 杀 菌 效 果 试 验
宋春 青
（ 天 津市 西青 区畜牧 兽 医站 ，天津 ３ ０ ０ ３ ８ ３）
摘 要： 本 实验就 臭氧在水及 空气中对 大肠杆菌 、 葡萄球 菌和 白色念珠 茵杀灭效果进行研 究。结果表明 ， 无论是在水 中或在 空气 中的杀菌效果在 ５ ￣ ２ ０ ｍｉ ｎ内均达 ９ ｏ ％以上 ， 杀菌效果可 靠， 有利 用推广价值。
２ 试 验 方 法
２ ． １ 制备 培养基 按培养基制作规定 进行 。 ２ ． ２ 繁殖茼种 将 大肠杆菌 、金黄色葡 萄球 菌和 白色念珠
菌菌种分别接种营养肉汤 、 血液 肉汤培养基 ３ ７ ℃ ２ ４ ～ ７ ２ ｈ培
表 １
２ ４ ｈ（ 或７ ２ ｈ ）培养 。 同 时制 备 菌 液 空 白对 照 平 板 ２个
菌器 、 灭 菌锥形 瓶 （ ３ ０ ０ ｍ Ｌ ） 、 灭 菌
试管（ １ ０ ｍ Ｌ ） 、 灭 菌 培养 皿 （ ９ ｃ ｍ） 、 灭 菌 移液 器接 嘴 （ １ ０ ０ ｍ Ｌ 、 １ ０ ０ ０ ｍＬ ） 、 微 量移 液 器 （ １ ０ — １ ０ ０ ｍ Ｌ 、 １ ０ ０ ～ １ ０ ０ ０ ｍ Ｌ ） 接种 环 、 酒 精灯 、 超 净工作 台、 恒温数控 培养箱 （ ３ ７ ℃） 、 臭氧 发生器 ： 型 号， Ｆ Ｑ 一 ３ ０ １ ；额 定 电压 ２ ０ ０ Ｖ ／ ５ ０ Ｈ ｚ ；功 率 ， ７ ｗ；臭 氧 量 ， ２ ０ ０ ～ ３ ０ ０ ｍｇ ／ ｈ 、 臭氧检测仪 ： 型号 ， Ｌ Ｉ ＭＩ Ｃ Ｅ Ｎ Ｏ Ｚ Ｏ Ｎ Ｅ ＭＥ Ｔ Ｅ Ｒ １ ． ２ 试 １ ． ３ 菌 剂 群 营养琼脂培养基 、 血液琼 脂培养基 、 营养 肉汤 大肠埃 希氏菌 ， Ｃ ＭＣ Ｃ ４ ４ １ ０ ２ — ３ ａ ８ ；金 黄色葡 培养基 、 血液 肉汤培养基 、 灭菌生理盐水 。 萄球菌 ， Ｃ Ｍ Ｃ Ｃ ２ ６ ０ ０ ３ — ５ ａ １ ０ ； 白色念珠 菌 ， Ｃ Ｍ Ｃ Ｃ ９ ８ ８ ０ ０ １ — ２ ａ ２ ； 菌种 由天一科技有 限公司提供。
洁净室臭氧灭菌消毒效果验证方案
文件制修订记录使用，整个洁净区的消毒为臭氧消毒方式。
臭氧灭菌的流程:关闭新风进风口和回风对外排放阀门,使整个被消毒的洁净区空间通过洁净系统风道形成循环状态,保持消毒空间相对密闭,预防臭氧泄漏,以确保臭氧在空间分布均匀,使洁净区的臭氧浓度达到10ppm,从而达到对洁净区空气、物体、设备、墙壁等的灭菌,同时还能对过滤系统、循环系统进行灭菌.1.验证目的通过对在一定的时间洁净室（区）内臭氧浓度的测试，验证在预定的消毒程序时间内洁净区各洁净间臭氧浓度是否达到标准规定；通过微生物挑战性试验，确定在预定的消毒程序时间内臭氧对洁净室（区）的消毒效果2.验证范围本验证方案适用于臭氧灭菌消毒的整个过程。
3.人员和职责验证小组人员：1.2.1、验证小组组长：负责验证方案起草，组织实施验证的全过程，验证结束写出验证报告。
1.2.2、验证小组组员：分别负责本方案中具体工作。
1.2.3、实验室、实验员：QC理化室及必须的检测仪器为本项目验证实验室4.验证内容4.1设计确认确认本系统使用的关键设备臭氧发生器的技术指标及臭氧消毒系统设计要求，包括规格、尺寸、材质、电流电压，臭氧产量、灭菌空气体积、灭菌消毒杀菌等是否符合要求，文件系统技术资料是否齐全(操作指南、使用手册、制造和设计标准等)。
设备技术指标及设备要求确认表设备关键性仪表及消耗性备品登记表4.2安装确认目的：评价臭氧发生器的安装是否符合设计规范及工艺要求。
方法：检查电气部分、辅助设施配套情况、机器安装情况、机器安装区域等。
标准：a、电气部分：电源控制系统和臭氧发生器一体式装置；电源380V/50HZ，连接方式正确，触点牢固，有良好接地。
b、辅助设施配套情况：冷却水：进口管道4′PVR管，阀门控制进水量；出水管道4′PVR管，直接排出，出口通畅。
压缩空气进气系统包括：捷豹EV51空气压缩机、油水过滤装置、吸附干燥制氧装置、精密过滤器、减压装置等。
捷豹EV51空气压缩机具有：安全可靠的结构设计；运转平稳、噪音低；自动压力开关及自动卸载系统等功能。
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目录
1. 概述 (4)
2. 验证目的 (4)
3. 验证范围 (4)
4. 验证内容 (4)
4.1. 验证所需文件 (4)
4.2. 可接受标准 (4)
4.3. 准备工作 (4)
4.4. 试验步骤 (4)
5.验证结果与评定 (5)
6. 再验证周期 (5)
7. 验证进度安排 (5)
8. 附表 (6)
1.概述：
臭氧是一种广谱高效灭菌剂，具有强烈杀菌消毒作用。
在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死。
多余的氧原子则会自行重新结合成为氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，为无污染消毒剂。
我公司现采用GJF—F40臭氧发生器对各生产车间洁净室（区）进行消毒。
2.验证目的：
通过对在一定的时间洁净室（区）内臭氧浓度的测试，验证在规定的时间内洁净区各洁净间内臭氧浓度是否达到标准规定；通过微生物挑战性试验，确定在一定时间内臭氧对洁净室（区）的灭菌效果。
3.验证范围：
验证臭氧在洁净室（区）内各洁净间在一定时间内所达到的浓度；验证臭氧的灭菌
效果。
4.验证内容：
4.1.验证所需文件：
臭氧消毒灭菌操作规程（SOP SC0055）
进出万级洁净区更衣规程（SOP SC0012）
洁净区沉降菌检测规程（SOP ZL0006）
容器设备微生物污染检测规程（SOP ZL0008）
4.2.可接受标准：
4.2.1. 臭氧发生器开启60分钟时洁净室（区）内各洁净间臭氧浓度不小于
11ppm。
4.2.2.臭氧发生器开启60分钟时洁净室（区）内微生物全部杀死。
4.3.准备工作：
生物指示剂：金黄色葡萄球菌（6538株）（菌液浓度1×107个/ml）、配制营养琼脂培养基、灭菌平皿、纯化水、20%碘化钾溶液、1.000mol/L硫酸溶液、硫代硫酸钠滴定液（0.0010mol/L）、淀粉指示剂、锥形瓶、采样器、滴定管。
4.4. 试验步骤：
4.4.1.臭氧浓度的验证：
4.4.1.1. 开启净化空调机组和臭氧发生器60分钟后，分别在百级层流罩、万级及十万级洁净间远离送风口处测定臭氧浓度，记录于表1。
4.4.1.2.测试方法：
4.4.1.2.1. 向锥形瓶中加纯化水100ml，再加入20%KI溶液20ml，然后再加入纯化水250ml，盖塞后混匀。
4.4.1.2.2. 开启采样器，置换排气，再准确采取2L臭氧化气，充分混匀。
4.4.1.2.3.取下瓶塞，加入1.000mol/L的H2SO4溶液5ml，混匀后放置。
4.4.1.2.4.放置10min后加0.5%淀粉指示剂1ml，混匀。
4.4.1.2.
5.待反应至浅黄色时，用硫代硫酸钠滴定液（0.0010mol/L）滴定
至无色。
4.4.1.2.6.计算：
臭氧浓度（mg/L）= M×V×48.00×1000 2×2×1000
式中：M为Na2S2O3克分子浓度；
V为Na2S2O3消耗ml数。
4.4.2. 微生物挑战性试验：
4.4.2.1. 吸取菌液0.5ml于平皿内，分别摆放在百级层流罩、万级、十万级洁净间远离送风口处的地（台）面上，打开平皿盖，同时关闭空调的新风阀，开启臭氧发生器60分钟。
4.4.2.2.在灭菌停机后30分钟取出平皿，倒入15ml培养基，于30~35℃
培养48
小时，观察结果并记录于附表2。
4.4.2.3.微生物挑战性试验的同时做空皿对照（不经过臭氧灭菌，其余同上）。
5. 验证结果与评定：
验证小组负责根据验证情况，作出评定，写出验证报告。
6. 再验证周期：
验证小组拟定再验证周期报验证委员会审批。
7. 验证进度安排：
生化车间于2000年6月15日至2000年6月19日连续验证三次。
输液车间于2000年7月15日至2000年7月19日连续验证三次。
粉针车间于2000年8月15日至2000年8月19日连续验证三次。
8. 附表：
表1：臭氧浓度分布记录。
表2：臭氧灭活微生物挑战性试验结果记录。
表1.
臭氧浓度分布记录
表2.
臭氧灭菌微生物挑战性试验结果记录。