聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA
质粒的提取与纯化
碱裂解法小量制备质粒DNA
基本原理
人们使用碱与 SDS 裂解法从 E.coli 中分离制备质粒 DNA已有 20 多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高 pH 值的强阴离子洗 涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体 DNA 和蛋白质变性，将 质粒 DNA 释放到上清中。尽管碱性溶液使碱基配对完全破 坏，闭环的质粒 DNA 双链仍不会彼此分离，这因为它们在 拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太 过，当pH值恢复到中性时，DN双链就会再次形成。在裂解 过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包裹。当 用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀 下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。
细菌的制备
挑取转化细菌的单菌落 (或用0.1～1.0m1单菌落的培 养物) 接种到30m1含适当抗生素的培养基(LB、YT 或Terrific培养液)中。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培 养物的体积大 4倍；试管不宜盖得过紧；应在剧烈振摇下温 育。
在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚 期(OD600约为0.6)。
液转移到微量离心管，室温放置30min。
加500
μl 1.6M NaCl（含13%PEG8000），混匀，4℃， 12000rpm离心5min。
弃上清，将沉淀溶于400
μl TE(pH8.0)，用酚、酚：氯仿、
氯仿各抽提一次。
将水相移入一干净指形管中，加100 μl 10M NH4Ac， 混匀，加2倍体积无水乙醇（约1ml），室温10min， 4℃，12000rpm离心10min。（-20 ℃放置30min以 上沉淀效果更佳，如果暂时不用，可将质粒长时间 保存于乙醇中，暂时不离心。） 弃上清，加200 μl 70%乙醇，旋转洗涤， 12000rpm 离心 2min。 用400 μl TE(pH8.0)溶解沉淀。定量后-20 ℃保存。
核酸提取的原理及方法
核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。
今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。
1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。
2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2、miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。
他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA实验
聚⼄⼆醇沉淀法纯化质粒DNA实验关键词：聚⼄⼆醇沉淀纯化质粒DNA 科进 Kirgen 爱思进 Axygen 康宁 corning 耐思 NEST ⽩鲨易 biosharp实验⽅法原理这种⽅法最早由 Richaed Treisman ( 英国，伦敦，ICRF) 参照 Lis 的⼯作⽽设计。
Lis 是最早⽤聚⼄⼆醇（PEG ) 分离不同⼤⼩ DNA 的⼈。
Treisman 法被⼴泛⽤于碱裂解法制备的质粒 DNA 的纯化。
实验材料粗制质粒试剂、试剂盒氯仿⼄醇异丙醇 LiCl PEG-MgCI2 酚氯仿⼄酸钠 TE仪器、耗材Sorvall SS-34 或与其相当的转头冰⽔浴实验步骤⼀、材料1. 缓冲液和溶液(1) 氯仿(2) ⼄醇(3) 异丙醇(4) LiCl ( 5 mol/L)(5) PEG-MgCI2 溶液(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）(7) ⼄酸钠（3 mol/L, pH 5.2 )(8) TE ( pH 8.0 )(9) TE ( pH 8.0）含 20 µg/ml RNase A2. 核酸和寡核苷酸粗制质粒3. 离⼼机和转头Sorvall SS-34 或与其相当的转头4. 专⽤设备冰⽔浴⼆、⽅法1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷却⾄ 0。
2. 加⼊ 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl，混匀，于 4 离⼼ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。
3. 转移上清⾄ 30 ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离⼼回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min )10 min。
4. ⼩⼼倒去上清，倒置管⼝，使液体流⼲。
室温下⽤ 70% ⼄醇洗沉淀和管壁。
⼩⼼将⼄醇倒去，⽤真空抽吸器将管壁上残留的⼄醇抽⼲。
在纸⼱上倒置数分钟，使⽆可见⼄醇残留。
细菌质粒提取原理及步骤(精)
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA 的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。
然而，较长一代的载体(如pB R322 由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA 的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1 大质粒(大于15kb 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒提取
４、加入３50 μl Solution Ⅲ，上下颠倒10次, 离心 12,000rpm 10min; ５.取上清（不可吸到絮状沉淀）臵于对应编号并带有 收集管的离心柱，离心10，000×g 1min，弃液（可 重复一次，提高DNA量，即集中管液倒回离心柱）； ６.加 500ul HB（深度清洗）离心10，000g 1min，弃 液（可重复一次）； 7.加Wash Buffer（确保已加入无水乙醇） 700ul 离心 10，000g 1min，弃液（可重复一次）； 8.空柱离心12，000g 2min； 9. 加Elution Buffer 50ul ,下接标记好的Ep管，盖上离心 柱的盖子 60℃温育10min,离心13，000g 2min
质粒大于15kb在细胞裂解操作时容易受损， 故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。通常 将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，再用溶菌酶和 EDTA（乙二胺四乙酸）进行处理，破坏细胞 壁。然后加入SDS （十二烷基磺酸钠）等去污 剂裂解球形体。
小质粒(小于15KB)的处理可用较剧烈的方法
对小质粒的操作可以用许多无需特殊处理的裂 解方法。典型的方法是让细菌溶解物悬于去污 剂中，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理 能破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA变性。闭环质粒DNA链则处于拓扑缠绕状 态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA链迅速得到准确配臵，重新形成完全的天 然超螺旋分子。
通过不连续或者预先形成的氯化铯梯度离心， 可在离心管中获得含有不同浓度ＣｓＣｌ的溶 液分层，样品位于中层（三级梯度法）或者底 层（两级梯度法）。在随后的离心梯度形成过 程中，ＤＮＡ找到其等密度点，从而使离心时 间大大缩短。
因为不连续梯度法不能达到真正的平衡，使其 闭环质粒ＤＮＡ与染色体ＤＮＡ直接的分辨率 不如自身形成的梯度那么高。一般说来，与二 级梯度法相比，三级梯度法能在较短的时间内 给出更好的结果。
基因工程--核酸操作的基本技术
3.1 碱抽提法提取DNA
? 碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一 种用的最广泛的制备质粒 DNA的方法，是当今 分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法 是基于染色体 DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。在 pH值达到12.6的碱性 条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性，质粒 DNA的大部分氢键也断裂， 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全 分离。当以 pH4.8 的NaAc高盐缓冲液调节其 Ph 至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构 型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性
? 心5min，弃上清，加入 70％乙醇沉淀。
? 7）离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。
? 8）加入50μl TE并加入1μl RNase放入37℃水浴 1h。
? 9）0.7%琼脂糖电泳检测其含量。
3.1.2 碱抽提法抽提DNA过程 中应注意的问题
? （1） 染色体DNA、蛋白质与 RNA是否去除干 净，是否获得一定得率的质粒 DNA。
? （６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分 子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚 或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分 子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水 合状态而变性。经过离心，变性蛋白质 的密度比水的密度大，因而与水相分离， 沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中 的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比 重更大，保留在最下层。
变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定 存在。而高盐的３mol/L NaAc有利于变
性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以 及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。
? （４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水 合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇 会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失 水而易于聚合。一般实验中，是加２倍 体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙 醇的最终含量占６７％左右。
质粒 的提取纯化及验证
一细菌的收获和裂解1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L.盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。
4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA.6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合，于室温放置2分钟。