转基因植物检测与鉴定
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
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Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转基因植物的筛选与鉴定
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
转基因植物的检测方法及其原理
转基因植物的检测方法及其原理说到转基因植物的检测方法，哎呀，别看它名字高大上，其实要搞清楚这些植物到底“基因里”藏了什么东西，可真不是一件容易的事儿！你想想，现在的科技这么发达，想查一个小小的基因变动，得靠一堆复杂的工具和技巧。
咱们生活中吃的很多食物，都可能是转基因的，然而那些转基因植物到底长啥样，它们和普通植物有啥区别，很多人其实还摸不着头脑。
今天咱们就来聊聊，转基因植物是怎么被“抓包”的。
首先得说，转基因植物其实就是经过基因工程改造过的植物，某些基因被“调皮地”加进去，目的是为了让这些植物有点特别的功能，比如抗虫、抗病，或者是让它们在干旱的环境下也能生长得好。
就像给植物做了个“基因升级版”，有点像人类做整容手术一样。
但这可不是随便改改就行的，它得在植物的DNA里留下“痕迹”，就像在你手机里安装了一个APP一样，有了它，植物就能干些别人做不到的事。
可问题是，转基因植物和普通植物怎么看上去差不多，不仔细看，还真分不出来。
就像是同一个班级里的两个人，外貌差不多，可其中一个却可能偷偷带了个高科技的手机。
所以呀，怎么知道一个植物是不是转基因的，得靠一堆高端的检测技术了。
现在，最常用的检测方法就是PCR（聚合酶链式反应）技术。
听着是不是挺复杂？其实也不难理解。
就像你拍照的时候，不管是景色还是人像，照片总是会有一定的“特征”对吧？PCR技术就相当于是放大镜，它能够把植物基因里的某些特征“放大”，让你看得清清楚楚。
科学家用PCR方法，把基因里那点儿“特殊”的转基因成分从大海捞针一样给找出来。
一旦找到了那些特定的基因序列，那就能证明，这个植物不单纯，里面有转基因。
但这个方法也有个小缺点。
它需要比较高精度的设备，检测过程比较费时，得小心翼翼地操作。
想象一下，就像你去餐厅吃饭，老板端上来的每道菜都需要经过精细的制作一样，检测转基因植物也得经历一番“精雕细琢”。
如果在操作过程中，稍有不慎，那结果可能就大不如前了。
除了PCR，还有一种叫做ELISA（酶联免疫吸附测定）的技术。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
转基因植物的筛选与鉴定
2017年24期Technology Innovation and Application方法创新转基因植物的筛选与鉴定王迪(聊城大学东昌学院，山东聊城252000)摘要：随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T i代种 子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
关键词：拟南芥;转基因植物；筛选中图分类号:Q943 文献标志码:A文章编号:2095-2945(2017)24-0087-021文献综述1.1转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方 法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物 的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如 今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种 技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已 发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉 管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法 有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要 求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们 要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国 家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济 效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨 大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵 染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了转基因植物的 筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的 理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技 术、植物组织培养技术等等。
转基因植物的筛选与检测
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• Western 印迹是将蛋白质从 SDS-PAGE胶 中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化 蛋白质进行免疫学测定的方法。 • 特点：
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一、筛选的方法与原理
• 通过特定基因在转化体内的表达，利用特 定的试剂，选择出来转化细胞。
• 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等
表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”
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二、检测的方法与原理
• 利用特定基因在转化体内的表达，对其表 达产物进行检测。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易观察， 不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺 序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段， 甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息， 便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于 大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性， 是早期检测的一种较好方法。
• 注意： • 此过程最重要的是保持各DNA片段的转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化膜和 滤纸等。
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Western
• • • • • • 1.制胶及上样 2.电泳 3.转膜 4.封闭 5.抗体孵育 6.曝光显影
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Southern杂交
• • • • • • • 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 转移 DNA 印迹 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）
膜
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简述转基因动植物的检测鉴定方法
简述转基因动植物的检测鉴定方法
一、转基因检测鉴定方法
1、理化检测法
（1）流式细胞术：利用流式细胞术技术，检测转基因植物DNA 核酸的含量，即采用荧光染料标记的 DNA 膜，以流速技术，测定和对比转基因动植物与其他植物的 DNA 含量。
（2）蛋白质印迹：利用蛋白质印迹法，它可以对植物蛋白质分子进行快速和准确的检测，包括转基因植物中特异性抗性蛋白。
2、分子生物学技术
（1）PCR 技术：通过荧光定量 PCR 技术，可实现对单个核酸分子的高灵敏度检测，其是转基因植物检测的常用技术。
（2） Southern 胺基酸印迹：利用 Southern 胺基酸印迹法，检测基因的等位基因进行检测和分析，如同位素标记 PCR，可以有效鉴定和分析转基因植物种群中不同基因的表达量及突变情况。
3、其他技术
（1）生物分子识别：通过生物分子识别，可以有效地检测出转基因植物特有的 DNA 序列，从而对转基因植物进行鉴定。
（2）生物免疫技术：利用生物免疫技术，可以以免疫试剂盒的形式，对转基因植物进行快速检测，从而达到鉴定的目的。
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转基因植物的检测与鉴定
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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5、杂交
1）杂交体系： 探针浓度：控制在0.5ng/ml或更低 杂交反应温度：低于Tm值15-25℃ 杂交时间：
2）预杂交及洗膜
杂交的特异性是影响杂交效果的重要因素，非特异性杂交的去除主 要是通过杂交前的预杂交和杂交后的洗膜完成。
预杂交：是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性 位点。
常用封闭剂包括变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA等；另一类是高分子化合物，如Denhardts
操作：将印迹后的固相膜放在含封闭剂的预杂交液中置于不浓度的溶 液中漂洗，以除去游离的及非特异性位点上结 合的探针。
分子杂交涉及三大内容：制备杂交探针；制备被检的 核酸或蛋白质样品；印迹及杂交。
一、Southern杂交步骤
（一）植物总DNA提取 （二）杂交探针的制备
探针：是经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。 分为DNA探针和RNA探针，DNA探针又分为单链DNA探针
和双链DNA探针。 杂交探针制备包括：探针核苷酸序列的获取及标记两
酸（NTP）或脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），以这些标记 的核苷酸作底物，通过酶促聚合反应，使标记物掺入 到多核苷酸链中，从而获得合适探针。 特点：放射自显影灵敏度高，压片时间短； 分辨力较低； 探针不能长期保存
（3）非放射性标记物
特点：敏感性较差；
稳定性好、分辨力高，检测所需时间短。对人和环境 无害。
生物素:是一种水溶性B族维生素，其分子中的戊酸羧 基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、 核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质被生物素 标记。
生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和 系统检出，也可通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统 检出。
抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
部分。
1、探针核苷酸序列的获取
鉴定转基因植株时应使用同源探针，常以转化的目 的基因作探针。
目的基因探针一般从载体质粒上切取。包括质粒DNA 的分离纯化；限制性内切梅切割；电泳分离酶切片 段；从凝胶中回收目的片段。
2、探针标记
（1）理想的标记物条件：
标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针 的杂交特异性；
洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗 膜效果的三要素。
6、杂交信号的检出
放射性标记的探针通过放射自显影检出； 包括：感光材料曝光、显影、定影、水洗等
物细胞内并不存在； 便于检查
目前常使用的报告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等
1、gfp（绿色荧光蛋白）基因
简介：绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧 光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体的、能 在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它是一种能接 受荧光辐射能并最终发射荧光的物质。
从水母中分离纯化的Gfp是由238个氨基酸残基组成的 单体蛋白，分子量26888Da，它在蓝光激发下能发出绿 光。
Gfp作报告基因的优点：
适用于各种生物的基因转化； 检查方法简便，无需底物、梅、辅因子等物质； 便于活体检测； 检测是可获得直观信息。
2、gus（β -葡萄糖苷酸酶）基因
检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操 作简便、省时；
稳定、安全、无环境污染； 经济。
标记物分为：放射性和非放射性两类 放射性标记物主要有32P、35S、125I、14C等； 非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素、
辣根过氧化物酶等.
（2）放射性标记物 制备核酸探针时使用的放射性标记物多为三磷酸核苷
Gus基因存在于某些细菌体内，是一种水解酶，能催化 许多β -葡萄糖苷酯类物质的水解。
检测方法：组织化学染色定位法 以X-Gluc为底物，通过显色反应可直接观察到组织器 官中gus基因的活性。在适宜的条件下，该酶可将XGluc水解成蓝色物质，此靛蓝染料使具有Gus活性的部 位或位点呈现蓝色，用肉眼或显微镜即可观察。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法
放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法
酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通 过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。
包括切口平移法及随机引物法。
PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。
化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
28-4切口平移法
28-5随机引物法
三、Southern印迹杂交
程序 1、植物总DNA的限制酶切 2、凝胶电泳分离酶切片段 3、凝胶中的DNA变性 4、印迹：毛细转移法和电转移法 5、杂交 6、杂交信号的检出
第九章 转基因植物的检查与鉴定
第九章 转基因植物的检查与鉴定
第一节 报告基因的表达检测 第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定 第三节 外源基因转录的Northern杂交检测 第四节 外源基因表达蛋白的检℃测
第一节 报告基因的表达检测
报告基因的两大特点： 表达产物及产物的类似功能在未转化的植
第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定
Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检查DNA链，用于 外源基因整合的鉴定及分析。
具有灵敏度高（可检出1pgDNA样品）；特异性强（可 鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点
根据杂交时所用的具体方法分为：印迹杂交、斑点或 狭缝杂交和细胞原位杂交等。