几种基因敲除鼠简介
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能

传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除(KO )/敲入(KI )基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时,同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换(即同源重组)。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠,该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段,并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题,而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中,要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等,要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式,为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题,合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则:在分线盒处,当不同电压回路交叉时,应采用金属隔板进行隔开处理;同一线槽内,强电回路须同时切断习题电源,线缆敷设完毕,要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系,根据生产工艺高中资料试卷要求,对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验;对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作;对于继电保护进行整核对定值,审核与校对图纸,编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案,编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案;对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
两种基因敲除小鼠的培育

七周重
黑鼠 灰鼠
八周重
黑鼠 灰鼠
九周重
黑鼠 灰鼠
十周重
黑鼠 灰鼠
十一周重
黑鼠 灰鼠
十二周重
黑鼠
3
心电图
4
生理指标
HR
SBP
DBP
MBP
心率
收缩压
舒张压
平均动脉压
C-S
547.1
104.3
67.0
79.2
C-C
448.3
98.4
68.5
78.8
5
项目
血液常规
单位 C-S C-C C57BL/6
WBC
两种基因敲除小鼠的培育
摘要
从美国哈佛大学引进了两种基因敲除小鼠。
这两种品系小鼠的体内分别缺少Cystatin C (胱抑素C )和 Cathepsin S(组织蛋白 酶 ),简称C-C 和 C-S。在三年的培育过程 中,我们对其生长繁殖、生理生化等一系列 指标作了测定,现将结果汇报如下。
一、材料和方法
#LUC %NEUT %LYMPH
白细胞计数
大未染色细胞计数 中性细胞比率 淋巴细胞比率
10^9/L
10^9/L % %
4.54
0 5.8 .4 76.2
5.89
14.2 81.2
%MONO
%EOS %BASO %LUC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC
项目名称 血清总蛋白 血清白蛋白 血清球蛋白
项目代码 TP ALB GLOB
单位 g/L g/L g/L
C-S 50.4 35.1 15.4
C-C 50.8 34.1 16.6
血清白球比
血清丙氨酸氨基转移酶 血清天门冬氨酸氨基转移酶 血清总胆红素 血清碱性磷酸酶 血清甘油三酯 血清总胆固醇 血清肌酸激酶 血清肌酐 尿素 钠
Nlrc4基因敲除小鼠模型介绍

Nlrc4基因敲除小鼠模型介绍
基因敲除小鼠是什么?是否就是我们平日所说的实验室用的小白鼠?其实小鼠有很多种,小白鼠只是其中一种,通常普通的小白鼠多被药厂用作临床试验,而基因敲除的小鼠,则用于更尖端的生物医学研究。
基因敲除小鼠技术原理:是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉,然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎,生成嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后,体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。
下面是,Nlrc4基因敲除小鼠介绍
Nlrc4炎症小体小鼠模型,可用于炎症小体、免疫、感染、糖尿病、肾病疾病药物研发的相关研究。
利用CRISPR/Cas9技术,敲除Nlrc4基因Exon,获得Nlrc4基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠介绍

基因敲除小鼠介绍展开全文持续活化的Cre敲除基因的效率较高,但敲除基因的时间点不可控,导致基因敲除可能发生在发育早期或非预期的实验时间窗。
诱导型CreER虽具有时间可控性,提高了遗传操作的精确度,但敲除基因效率较低。
为了提高诱导型CreER的基因敲除效率,需要高剂量且多次给予tamoxifen诱导,这不仅对实验小鼠有毒副作用、长期影响其健康状况,而且会引起基因敲除以外的一些混淆的表型。
Cre小鼠通常不需要纯合小鼠,通常杂合子的Cre小鼠表达量已经足够重组了。
纯合子Cre插入位点不确定,可能导致非预期表型。
Cre 小鼠可能带有毒性,对内源基因表达有影响。
Cre小鼠作用的时间点是不可控的,其剪切效率比Cre ER高。
CreER会有leaky(泄露)的情况。
CreER的结果直接取决于tamoxifen诱导时间窗口的基因表达的情况,他莫昔芬可以在胚胎期给药,可以穿过胎盘屏障。
当然也有一种和谐的解决方法:例如2020年周斌组发表的Generation of a self-cleaved inducible Cre recombinase for efficient temporal genetic manipulation文章。
该研究构建了一种新的诱导型Cre重组酶,可通过自我剪切将诱导型CreER转变成持续活化的Cre,实现时间可控的高效遗传操作。
这种新型Cre重组酶结合了诱导型CreER和持续活化的Cre重组酶的优点,既提高了重组效率又具有时间可控性,弥补了传统CreER和Cre重组酶介导的遗传操作技术的缺陷,突破了长期阻碍基因功能研究的瓶颈,可广泛应用于器官发育、组织再生和疾病进程中的基因功能研究。
生殖系统漏表达现象他莫昔芬的给药时间窗口,6-8天才会代谢,连续给药比较好雌激素诱导型 Cre-ER将雌激素受体(estrogen receptor,简称ER)的配体结合区与Cre 重组酶相融合,形成定位于胞浆中的融合蛋白(Cre-ER)。
完全性基因敲除大鼠构建技术原理及流程

完全性基因敲除大鼠构建技术原理及流程完全性基因敲除大鼠是通过CRISPR/Cas9基因敲除技术,针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒,造成目的基因的功能区域被敲除,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大鼠模型。
完全性基因敲除包括:移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。
移码突变鼠的建系原则与流程1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠;3、选择来自同一只F0代大鼠,基因型一致的F1代大鼠,达到性成熟后进行互配,可获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生大鼠。
片段基因敲除鼠的建系原则与流程1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子大鼠;3、选择来自同一只F0代大鼠,基因型一致的F1代大鼠,达到性成熟后互配,可获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生大鼠。
双(多)基因敲除鼠的建系原则与流程1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子大鼠;2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子大鼠;3、选择双基因杂合子大鼠进行杂交,获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定。
基因敲除小鼠的制作方法

一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶,把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响,而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶,把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前,其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后,可以在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为:( 1 )该基因有胚胎致死性;( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶,把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点,使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选,信号通路的研究等。
一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点,并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改,这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的,传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组,其效率只有百万分之一,而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入,可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节,目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN,但 ZFN的脱靶( off target ),也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因,利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
几种基因敲除鼠简介

目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠:通过基因工程技术,将特定基因从 老鼠体内敲除,从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程,用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中,然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病,用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果,加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低,产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术,将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子,使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统,如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物,缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性,可以避免全身敲除基因带来的副作用;同 时,可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能,提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂,需要较高的技术要求和时间成本;同时, 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响,如激素水平、给药方式等。
基因敲除小鼠

基因敲除小鼠摘要基因敲除小鼠是一种常用的实验动物模型,可以帮助科学家研究基因在生物体发育和功能中的作用。
本文将介绍基因敲除小鼠的定义、用途以及常用的敲除方法,帮助读者了解基因敲除小鼠在生物学研究中的重要性和应用。
引言基因敲除小鼠是指通过干扰或删除特定基因,使小鼠体内该基因表达受到抑制或消失的实验模型。
这种模型被广泛应用于基因功能研究、疾病机制研究以及药物开发等领域。
基因敲除方法基因敲除小鼠的制备有多种方法,其中最常用的是胚胎干细胞敲除和CRISPR/Cas9系统。
胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是一种传统的基因敲除方法。
首先,从小鼠胚胎中获得胚胎干细胞,然后通过基因转染或基因突变等方式,使目标基因发生敲除突变。
最后,将敲除的胚胎干细胞注入到早期小鼠胚胎中,形成敲除小鼠。
CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术,已经在基因敲除小鼠制备中得到广泛应用。
该系统利用Cas9核酸酶和特定的引导RNA来定向切割目标基因的DNA链,从而导致基因发生敲除或突变。
基因敲除小鼠的应用基因敲除小鼠在生物学研究中有着广泛的应用,以下是其中几个重要的应用领域:基因功能研究通过敲除特定基因,科学家可以观察与该基因相关的表型变化,从而揭示该基因在生物体发育和功能中的作用。
这对于揭示基因调控网络、疾病机制的研究具有重要意义。
疾病模型研究基因敲除小鼠常被用来构建各种疾病模型,如癌症、心血管疾病等。
这些模型可以模拟人类疾病的发生和发展过程,为相关疾病的研究提供了有力的工具。
药物开发基因敲除小鼠在药物开发中也起着重要的作用。
通过敲除特定基因可以观察药物对目标基因的影响,从而评估药物的疗效和安全性。
结论基因敲除小鼠是一种重要的实验动物模型,被广泛应用于基因功能研究、疾病模型研究以及药物开发等领域。
不同的敲除方法可根据具体实验需求选择使用。
基因敲除小鼠在解析基因功能、揭示疾病机制和评估药物疗效方面发挥着重要的作用,为生物学研究提供了强大的工具。
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Tyro 3, Axl和Mer三种受体的胞外结构域与神经细胞黏附分子高度同源。此外, 三种受体均在小脑的柏金氏细胞(Purkinje细胞)中表达,Tyro3 还在颗粒神经元 和Bergmann神经胶质细胞中表达。其共同配体也在小脑Purkinje细胞中表达,这表 明Tyro3, Axl和Mer及其配体Gas6很可能在神经系统中发挥重要的作用。
介绍几种基因敲除鼠的应用价值
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族简介
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族属于受体酪胺酸激酶 (RTKs) 家族成员,也称UFO受体酪氨酸激酶亚家 族,包括三个成员,又被命名为TAM受体酪氨酸 激酶:
♦Tyro3 又名Sky,Brt,Tif, Rse, Dtk, Etk-2
♦ Axl 又名Ark,Ufo,Tyro 7
Toll like receptor(TLRs)表达特征
许多肿瘤尤其是上皮来源的肿瘤可检测到不同TLR受体的
表达或上调。并且它的表达与肿瘤的增生,侵袭,恶性转化 ,抵抗凋亡及抗药性的产生密切相关。活化肿瘤细胞TLR受 体,通过调节基质金属蛋白酶(metalloproteinases)及整合素 (integrins)增强了肿瘤细胞的侵袭及转移;并且合成促炎因 子及免疫抑制分子,增加肿瘤细胞对细胞毒性淋巴细胞的抗 性,引起免疫逃逸。 其中TLR 4与肿瘤的发生高度相关。
♦Gas6和Protein S的结构基本相似, 由Gla(a-carboxylated aminoterminus)结构域、四个前后重复的 上皮生长因子样结构域、一个与性 激素结合球蛋白(SHBG)类似的大 的碳末端结构域组成
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族的功能研究
Tyro3家族的三种受体酪氨 酸激酶与配体Gas6和Protein S结合,其构象发生变化,形 成同源或异源二聚体,胞内 段酪氨酸残基发生磷酸化,, 激活受体本身的酪氨酸蛋白 激酶活性,催化下游分子, 起到信号转导的作用。能够 在包括细胞增殖、迁移、黏 附、吞噬等方面发挥重要功 能,参与免疫、神经、生殖、 心血管和血液等系统的调控。
♦ Mer 递途径作用广泛而且重要, 涉及到细胞生长、分化、增殖和代谢等,一旦发生 变异往往会诱导癌症等疾病的发生。
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族的特征
Tyro 3受体酪氨酸激酶家 族成员的分子均由与细胞 黏附分子相关的胞外配体 结合域:两个免疫球蛋白 (Ig)样的结构域和两个纤 维连接蛋白III(FN III)重 复序列相连,胞内区:酪 氨酸激酶结构域,以及跨 膜区组成
Tyro 3 优先表达于中枢神经系统中,而在肾脏、卵巢、睾丸等组 织中表达水平较低,在造血细胞系中的表达量变化较大。
Axl
在卵巢滤泡细胞、造血系统、骨骼肌、心肌以及睾丸组织 中 的表达水平较高。近来有研究发现Axl在肿瘤重建血
管的内皮细胞中高表达。
Mer 在神经组织、淋巴结、脉管系统、肺、肾脏以及卵巢、前 列腺等生殖系统中均有明显的表达,同时在一些原代培养 和肿瘤细胞系中也有较高的表达。
最近的研究报道表明TAM受体参与TLR受体信号通路的 负调控,防止过强的免疫反应给机体带来自身免疫性疾病 等不利影响
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族的特征
酪氨酸激酶是一组催化酪氨酸残基磷酸化的酶,通过从三磷酸
腺苷ATP上转移一个磷原子到酪氨酸残基上,而使底物蛋白活化。 通过活化底物蛋白,参与细胞的信号转导,最终,这些信号转导 进入细胞核内,引起某些基因表达水平的改变。
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族表达特征
Tyro 3亚家族三种受体酪氨酸激酶在人或动物的成熟组织 中均有广泛的表达。但表达量却有较大差异。
Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族敲除鼠的功能研究
1 生殖系统
通过对基因敲除小鼠的研究发现,敲除三个基因(AXL,MER,TYRO3)中的一 个或两个,小鼠能够生存且具有生育能力。三个基因都敲除后,小鼠虽然能够生存 ,但通过组织学检查发现,雌性小鼠卵巢中的细胞凋亡增加,但仍具有生育能力。 与此不同,所有三基因敲除的雄性小鼠都不能产生成熟精子,完全丧失生育能力, 其成熟个体睾丸的大小约为正常小鼠睾丸的三分之一。
2 免疫系统
通过将小鼠的三个基因TYRO3, MER,和 AXL去除或阻断,可以复制出自身免疫 疾病的动物模型,这些小鼠表现出了广泛的自身免疫疾病的症状,包括类风湿关节 炎和系统性红斑狼疮等。为认识自身免疫性疾病的分子机理提供了重要的线索。近 年来Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族在肿瘤中所起的作用正在受到关注。
新近的理论认为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生
不单纯是简单的脂质代谢障碍,而是动脉壁的慢性进行性炎 症过程。TLR受体与AS的形成密切相关。研究表明,AS的血 管内膜有TLR2表达,TLR2通过识别内源性和外源性的配体 氧化脂蛋白和脂质并活化内皮细胞,造成内皮细胞的损伤, 致AS形成。
TAM受体酪氨酸激酶广泛地抑制 TLR及TLR-诱导的细胞因子产生
小结
TLR2:可应用于AS的研究 TLR3: 可应用于与病毒感染相关疾病的研究中 TLR4:在肿瘤相关疾病的研究中有应用价值
这三种基因敲除鼠在炎症反应中均具有重要的意义
AXL :在肿瘤相关疾病的研究中有应用价值 Tyro 3:在神经系统的研究中具有重要作用 Mer :在血液、免疫等疾病的研究中具有重要作用
研究结果显示三种受体酪氨酸激酶在不同组织中的表达量有很大区 别,表明三种受体酪氨酸激酶在不同组织中在功能上存在较大的差异。
Tyro 3受体酪氨酸激酶亚家族的配体及其结构特点
Tyro 3受体酪氨酸激酶家族三种 受体的共同配体是Gas6和Protein S.
♦Gas6(growth arrest-specific gene 6)与血清抗凝因子Protein S有 46%以上的氨基酸同源,是依赖于 维生素K的蛋白。
Toll like receptor(TLRs)表达特征
TLRs表达于多种免疫细胞,如淋巴细胞,树突状 细胞及巨噬细胞,以及多种与外界直接接触的组织 黏膜上皮细胞,如肺、肾、小肠和生殖管道。这些 TLR受体构成天然免疫防线的第一道屏障。TLRs在 调节机体自身免疫反应中具有重要的作用,研究表 明内源性的配体如RNA和DNA可活化TLR受体进而 诱导典型的自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus,SLE) ,TLR受体在 肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病 、肥胖等慢性疾病中 的作用正逐渐被人们所认识和重视。